JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

NMDA reseptörleri (NMDAR) çalışma daha büyük ölçekli, kolaylaştırmak ve küçük moleküller düzenleyici etkileri muayene ve tedavi uygulamaları izin vermek için bu iletişim kuralını hedefidir.

Özet

N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörleri (NMDAR) ionotropic glutamat reseptörlerinin sınıflandırılır ve öğrenme ve bellek önemli rollere sahiptir. NMDAR arıza olarak her iki bitti - veya altında - mutasyonlar, değiştirilmiş ifade, kaçakçılığı veya yerelleştirme, neden activity ifade, merkezi sinir sistemi özellikle çok sayıda hastalık katkıda bulunabilir. Bu nedenle, reseptör'ın biyoloji anlama hem de keşif bileşikler ve küçük moleküller kolaylaştırmak nörolojik hastalıklar ile mücadele için devam eden çabaları önemlidir. Reseptör eğitimi için geçerli yaklaşımlar iş hızı düşük, yüksek maliyet ve NMDAR-aracılı excitotoxicity önlemek için işlevsel yetenekleri kanal blokerleri gerekli varlığı nedeniyle çalışmaya yetersizlik de dahil olmak üzere bazı kısıtlamalara sahiptir. Ayrıca, varolan tahlil sistemleri stimülasyon glutamat sadece tarafından duyarlıdır ve glisin, NMDAR, diğer eş ligand stimülasyon duyarlılık eksikliği. Burada, hem eş ligandlar, glutamat ve D-serin/glisin hassasiyetle NMDA reseptör çalışmaya yüksek üretilen iş gücü ile ilk plaka tabanlı tahlil mevcut. Bu yaklaşım farklı NMDAR alt birim besteleri incelenmesi ve fonksiyonel çalışmalar reseptör glisin - ve/veya glutamat duyarlı modlarında izin verir. Ayrıca, yöntem inhibitörleri varlığı ölçümler sırasında gerektirmez. Pozitif ve negatif allosteric modülatörler etkileri bu tahlil ile tespit edilebilir ve NMDAR bilinen Farmakoloji sistemimizde çoğaltılır. Bu teknik ve varolan yöntemleri kısıtlamaları üstesinden maliyet-etkili. Biz bu roman tekniği NMDAR-aracılı patolojiler için terapiler keşfi hızlandıracak inanıyoruz.

Giriş

Tıpta güncel gelişmeler ile yaşam süresi önemli ölçüde artmıştır; Ancak, çok yaşa bağlı hastalıkların yaygınlığı var. Şizofreni, amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı, diğerleri arasında gibi merkezi sinir sistemi (MSS) hastalıkları bir istisna vardır ve sonraki on yıl1, artırmak için öngörülen 2 , 3. N-metil-D-aspartat reseptör (NMDAR) bilinen ionotropic glutamat reseptörlerinin arıza Alzheimer hastalığı, şizofreni, travmatik beyin hasarı, felç, diyabet ve yasalar tarafından aksi gerekmekdikçe glokom diğerlerinin yanı sıra, bağlı biyolojilerinin etkili, hastalığı değiştirme tedaviler4,5,6,7gelişimi için çalışması gerekir.

NMDARs dört monomerleri veya alt birimleri4,8,9/ oluşur. NMDAR yapısal kompozisyon içinde beyin7,10gelişimsel ve bölgesel değişkenlik gösterir. NMDARs sinaptik plastisite, biliş ve ritimleri oluşturmak için nefes ve hareket11,12,13katılmaktadırlar. Voltaj bir kanal büyük ölçüde sigara-membran potansiyeli dinlenme iletken (-70 mV) ve daha fazla nüfuz iyonlar önlemek için magnezyum tarafından engellenir. Kanal iki ligandlar, glutamat ve glisin/D-serin bağlama tarafından etkinleştirilir ve sinaptik membran, eşzamanlı bir depolarizasyon AMPA reseptör, ionotropic glutamat reseptörlerinin başka bir alt sınıf tarafından aracılık. Depolarizasyon katyonlar, özellikle kalsiyum14,15,16akını etkinleştirme NMDAR, magnezyum tıkanması kaldırır. NMDAR aktivasyonu hücre hayatta kalmak için gerekli olmasına rağmen aşırı harekete geçirmek hücre ölüm17,18,-19 arası excitotoxicity yol açabilir. Bu, reseptör, karmaşık yapısı ek olarak bu çalışmaları gerçekleştirmek için zorlu etkili tedaviler geliştirmek için gerekli kılar.

NMDAR eğitim için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, her biri uyarılar eşlik vardır. Örneğin, yaygın olarak kullanılan tekniklerden biri NMDAR-aracılı değişimler istikrarlı hücre kültürünü tetrasiklin-indüklenebilir organizatörü (Tet-On)20kontrol altında hücre içi kalsiyum ölçer floresans tabanlı bir tahlil olduğunu. Ancak, bu sistemde gerekli ligandlar supramaximal konsantrasyonları ve NMDAR inhibitörleri ölçüm sırasında mevcut gereksinimi yapar rekabetçi antagonist aktivite tespit etmek neredeyse imkansız. Diğer benzer sistemleri, fonksiyonel reseptör ifade toksisite, kanal blokerleri gibi hücre kültürleri korumak için ketamin21,22 gerektiren neden olur. Bu kanal blokerleri reseptör özünde oturmak ve yıkayayım, özellikle bir plaka tabanlı biçiminde, ki onlar reseptör fonksiyonel çalışmalar ile müdahale etmek zordur. Son olarak, yama sıkma gibi elektrofizyolojik ölçümlerde sınırlı işlem hacmi olduğunu ve çok pahalı23büyük ölçekli çalışmalar vardır. Rağmen yukarıdaki sistemleri glisin uyarmaya duyarsız; Bu nedenle, NMDAR glisin bağımlı etkinliği okuyan bir sorun haline gelmektedir.

Burada tartışılan sınırlamalar üstesinden NMDAR çalışmak için yeni bir yaklaşım açıklar. Bizim teknik baculovirus ifade reseptör alt birimleri en uygun bir oranı ile fonksiyonel düzeyde olduğu kadar az 16 saat içinde hızlı sisteme capitalizes. Ayrıca, geniş bir karakterizasyonu alt türlerinden farklı rekombinant NMDAR sağlayan bir basit ve kombinatorik yaklaşım için baculovirus kullanımına izin verir. Diğer deneyleri, bu iletişim kuralını zayıf antagonistleri kullanımı nedeniyle kanal blokerleri gerektirmez. Yöntemin en güçlü avantajı zayıf antagonisti sonra bu fiyasko, modülasyon bireysel glisin ve glutamat bağlama sitelerin yanı sıra çift modülasyon glisin/D-serin ve glutamat reseptör duyarlıdır-ligand taşıması siteleri. Tahlil NMDAR reseptör bilinen Farmakoloji ve bilinen onun pozitif ve negatif modülatörler etkileri beyannamedir. Son olarak, bu vitro hücresel tahlil nesil aşırı kalsiyum akını tarafından neden olduğu hücresel toksisite üstesinden gelir ve fonksiyonel çalışmalar reseptör NMDAR modülatörler keşifler hızlandırabilir yüksek üretilen iş moda sağlar hastalık durumlarında.

Protokol

1. hücre hazırlanması

Not: NR1 ve NR2A hücreleri kodlama bir baculovirus ile transduced HEK293 hücreleri veri üretimi, dahil olmak üzere bu protokolü kullanır.

  1. HEK293 hücreler uygun sayıda tohum ve NR1 ve/veya NR2A virüs uygun son konsantrasyonları (1.00 her µL) ekleyin. 384-şey plaka için 10.000 30 µL son bir hacim içinde hücre/iyi kullanın.
  2. Alternatif olarak, tohum HEK293-NR1-NR2A hücreleri uygun cep telefonu numarasını ve birim (384-şey plaka, kullanım 10.000 hücre/kuyuda son hacmi 30 µL için). Tetrasiklin bir konsantrasyon 2 µg/mL NR2A ifade teşvik ve bileşik koruma eklemek için Ekle (100 µM MDL105, 519 veya 5 mikron CGP07066724).
  3. Not: NR1 ve NR2 kodlama baculovirus 5 x 109 - 10 x 109 bulaşıcı mililitre24birim arasında yaklaşık bir titresi olmalıdır.

2. NMDA reseptör etkinlik ölçümü

  1. 384-şey plaka ya da koruyucu bileşik huzurunda NR1/NR2 veya HEK293-NR1-NR2A hücreleri ile transduced HEK293 hücreleri ile hazır olun. Bir açık alt, siyah çerçeve, poli-D-lizin boyalı tabak kullanın.
    Not: Koruma 100 µM ile MDL105, 519 glisin, 5 mikron ise duyarlılık görüşmek için kullanılır CGP070667 glutamat duyarlılık görüşmek için kullanılır.
  2. Plaka 37 ° C ve % 5 CO2 (gece) on altı saat kuluçkaya.
  3. Plaka da kuluçka kaldır ve yavaşça hücre medya plaka uyumlu Biyoatik konteyner üzerinde saygısız yavaşlatarak atın. Plaka basına kapalı plaka kenarlarını temizlemek ve kalan herhangi bir medya drenaj için kağıt havlu üzerine hafifçe dokunun.
  4. Calcium6 boya calcium6 boya (1 plaka boyutu) bir şişe çözücü tarafından 10 mL kuluçka arabellek (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM Probenesid) hazırlayın. 2 saat 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.
  5. Plaka da kuluçka kaldırmak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ayarlamak hücreleri izin.
  6. Yavaşça 2.3 adımda anlatıldığı gibi calcium6-boya dökmek ve tahlil arabelleği (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1.8 mM CaCl2, 1 mM Probenesid) 30 µL ekleyin.
  7. 2.6 iki kez olmak üzere toplam 3 yıkar, adımları yineleyin. Tahlil arabelleği 30 µL hücreleri üzerinde son yıkama sonra bırakın.
  8. Oda sıcaklığında 5 dakika dinlenme hücreleri izin.
  9. Ligand plaka 400 µM glisin ve 400 µM glutamat (100 µM son konsantrasyonu; aşağıda açıklandığı gibi belirlenecek ligandlar en iyi konsantrasyon) 4-fold bir stok yaparak hazırlamak. En az 25 µL ligand stokunun bir V-alt 384-şey plaka aktarın.
  10. Ligand plaka ve hücre plaka FDSS (fonksiyonel uyuşturucu eleme sistemi) yerleştirin.
  11. Temel Floresan (Fo) hücre plaka 30 saniye için ölçmek. 10 µL ligand stokunun FDSS dağıtım işlevini ve ölçü kalsiyum akı calcium6-boya floresans 5 dakika kaydederek kullanarak hücre plaka içine aktarın.
  12. Temel Floresan (Fmax/Fo) tarafından elde edilen maksimal floresans bölerek maksimal floresans oranını hesaplamak.

3. NMDAR ifade düzey optimizasyon

  1. Baculovirus kullanmak için en uygun miktarını belirlemek için bir titrasyon NR1 ve NR2A virüslerin gerçekleştirin. HEK293 hücreler (10.000 hücre/iyi tavsiye, medya 30 µL) 384-şey plakalı hazırlamak ve 2.1 adımda anlatıldığı gibi koruma bileşikleri içerir.
  2. NR1 virüs değişen miktarlarda plaka farklı satırları ekleyin (örneğin: 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0.5 µL, 0,25 µL satırları AE sırasıyla Ekle). Veri doğruluğunu çoğaltmaları ekleyin.
  3. NR2A virüs değişen miktarlarda plaka farklı sütunlar ekleyin (örneğin: 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0.5 µL, 0,25 µL satırları AE sırasıyla Ekle). Veri doğruluğunu çoğaltmaları ekleyin.
  4. Plaka 37 ° C ve % 5 CO2 (gece) on altı saat kuluçkaya.
  5. En iyi oranı ve NR1 ve NR2A virüs miktarı FDSS (yukarı bakın) kalsiyum akı ölçüm gerçekleştirerek belirler.

4. ligand titrasyon

  1. Hücreleri 2.3. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.
  2. Her ligand konsantrasyonu (100 µM) doyurarak huzurunda dilutions 4-fold hisse senedi çözüm olarak diğer ligand hazırlayın. Örneğin: bir 10 µM son test konsantrasyon glisin için glisin 400 µM glutamat dahil olmak üzere 40 µM stok çözeltisi hazırlamak.
  3. 2.11. adımda açıklandığı gibi FDSS ölçüm ile devam edin.

5. test bileşik

  1. 1. adımda açıklandığı şekilde hücreleri hazırlayın.
  2. Son ligand konsantrasyonu tahlil arabellekte bir 5-fold hazır ligand plakalı hazırlayın.
  3. Bileşikler plaka tahlil arabellekte bileşiklerin istenen son konsantrasyonunun 4-fold hisse senedi ile hazırlayın. Bir son bileşik konsantrasyon tahlil arabelleğinde 10 µM için 40 µM hisse senedi çözüm hazırlamak.
    1. Dimetil sülfoksit (DMSO) konsantrasyonu daha fazla seyreltme tahlil arabellek içine önce DMSO bahçedeki öncesi bir seyreltme hazırlayarak tüm örnekler üzerindeki sabit tutmak.
    2. Bahçedeki 3 ve 30 µM arasında değişen son tahlil bir doz yanıt için 1'den 10 mM den kadar DMSO bahçedeki öncesi bir seyreltme hazırlayın. Bu 4-fold hisse senedi toplama için tahlil arabellekte oranında seyreltin. DMSO son konsantrasyonu % 0.5 aşmaması gerekir.
      Not: Bu triplicates içinde her bir örneği test etmek için tavsiye edilir.
  4. Ligand, bileşik ve hücre plaka FDSS yükleyin.
  5. 30 saniye için temel floresans ölçmek.
  6. Bileşik stokunun 10 µL ekleyin ve 5 dakika floresans ölçmek.
  7. Ligand stokunun 10 µL ekleyin ve 5 dakika floresans ölçmek.
  8. Ölçüm son 5 dakika boyunca floresan oranları eğri altındaki alan hesaplayarak floresans oranı integrali belirlemek.
    Not: Alternatif olarak, floresans ligand ek sonra maksimal oranı analiz için kullanılabilir.

Sonuçlar

Küçük moleküller etkileri test etmeden önce bir yanı sıra en iyi ligand konsantrasyonu NMDARs en iyi ifade düzeyleri belirlemeniz gerekir. Açıklandığı hücreleri 384-şey plaka bir kuyu başına 10.000 hücre, seribaşı HEK293 huzurunda 5 mikron CGP060667, sonra transduced değişen miktarlarda NR1 ve NR2A virüs. Kuluçka gecede, ligand kaynaklı kalsiyum sonra akı ölçüldü (Şekil 1). Bu deneylerin sonuçlarını en iyi miktar ve her alt b...

Tartışmalar

Bu tahlil başarısı büyük ölçüde kullanılan HEK hücre sağlık üzerinde bağlıdır. Hücreleri üstel büyüme geçiyor ve düşük geçiş numarası ile kullanılmalıdır. Bu tahlil birçok transferleri içerir ve eklemeler çözümleri, çok dikkatli kullanarak sonuçları daha yüksek doğruluk sağlayacaktır. Bileşikler ve diğer kimyasalları konsantrasyonları da çapraz-hatalarını en aza indirmek için kontrol olmalıdır. Böylece hücreleri değil ayırmak hücre medya kalsiyum akı tahlil için ...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ve ifşa etmek bir şey yok.

Teşekkürler

Yazarlar Bakalorya bilim programı Postane ve Novartis Enstitüleri Bu çalışmada finansmanı için bir bütün olarak Biyomedikal araştırma için teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
HEK-293ATCCCRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell LineChanTest CorporationCT6120
pFastBac Dual Expression VectorThermoFisher Scientific10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom MicroplateCorning Life Sciences3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay KitMolecular DevicesR8192
GlycineSigma-AldrichG7126
GlutamateSigma-Aldrich49621
D-serineSigma-AldrichS4250
L701,324Tocris907
HEPES BufferBoston Bio ProductBB-103
Magnesium Chloride SolutionSigma-Aldrich63069
Calcium ChlorideVWRE506
HBSSThermoFisher Scientific14025-092
ProbenecidThermoFisher ScientificP36400
DMEM/F-12, GlutaMAX mediaThermoFisher Scientific10565018
MDL105,519NIBRSynthesized in house
NVP-AAM077NIBRSynthesized in house
CGP070667NIBRSynthesized in house

Referanslar

  1. Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
  2. Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
  3. Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
  4. Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
  5. Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
  6. Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
  7. Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
  8. Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
  9. Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
  10. Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
  11. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
  12. Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
  13. Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
  14. Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
  15. Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
  16. Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
  17. Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
  18. Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
  19. Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
  20. Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
  21. Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
  22. Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
  23. Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
  24. Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
  25. Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
  26. Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
  27. Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
  28. Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
  29. Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 137NMDARkalsiyum fluxexcitotoxicityh cre canl lantagonistleriglisin D seringlutamatmod lat rler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır