Türetme ve köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

Özet

Burada, yalıtım, genişleme ve köpek yumurtalık dokusundan mezenkimal kök hücre farklılaşma için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Mezenkimal kök hücre (MSCs) ilgi yalıtım, genişleme ve kültür kolaylığı nedeniyle son on yıl içinde artmıştır. Son zamanlarda, çalışmalar bu hücreler sahip geniş farklılaşma kapasite göstermiştir. Yumurtalık hücre tabanlı terapiler için umut verici bir aday MSCs içinde zengin ve sık sık biyolojik atık olarak ovariectomy ameliyat sonra atılan nedeniyle gerçeğini temsil eder. Bu makalede, yalıtım, genişleme, için yordamlar açıklanır ve MSCs farklılaşma hücre sıralama gerekliliği olmadan köpek yumurtalık türetilmiştir teknikleri. Bu iletişim kuralı rejeneratif tıp için önemli bir araç nedeniyle klinik çalışmalar son derece türevlenebilir bu hücrelerde geniş uygulanabilirliği temsil eder ve terapötik kullanır.

Giriş

Kök hücreler üzerinde odak önemli ölçüde güçlü rejeneratif tıp terapiler keşfetmek toplu amacı tarafından yakıt oldu bir araştırma çaba son on yıl içinde artmıştır yayımlanmış çalışmaları sayısı. Kök hücreler var iki birincil tanımlama işaretleri: öz - yenileme ve farklılaşma. Mezenkimal kök hücre normal doku ciro için sorumlu ve embriyonik kök hücre¹' e göre farklılaşma daha sınırlı bir kapasiteye sahip. Son zamanlarda, birçok çalışma geniş bir MSCs farklılaşma göstermiştir ve olup farklar embriyonik ve yetişkin kök hücreleri arasındaki tüm²adlı bir konudur tartışma altında.

Ovarium yüzey epitel hücreleri yanıt olarak farklı türdeki ayırt etmek için kapasite istinat hem epitelyal ve mezenkimal işaretçileri³, ifade farklılaşmış, bir kaydedilmemiş katman hücre, nispeten daha az olduğunu çevre sinyalleri⁴. Yumurtalık kök hücre tam konumunu iyi bilinen değildir; Ancak, tunica albuginea bipotential ataları germ hücreleri⁵' e çıkmasına önerilmiştir. İmmünolojik araştırmalar bu hücreler stromal kökenli⁶ veya içinde bulunduğu veya proksimal Over yüzey⁷onaylanmadığına karar. Mezenkimal kök hücre hücre adezyon⁸' önemli bir rol oynamaktadır çok sayıda reseptörleri hızlı beri bir deney bir nüfus hızlı adezyon içeren hücrelerin seçerek hücreleri nüfusu açıkça ayırmak hipotezi test etmek için tasarlanmıştır doğada mezenkimal olarak characterizable. Son zamanlarda, bizim grup MSCs türetmeye yumurtalık dokusu hücreleri hızlı yapışma⁹sergilenmesi arıtılmış nüfusu elde etmek için onların ilk 3 h kültür, kültür tabakta plastik yüzeyine yapışma üzerine kurulu kapasiteli bildirdi. Burada, yumurtalık dokusu mezenkimal kök hücre izolasyon için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır.

Protokol

Bu deney dört melez kadın köpek bir köpek sterilizasyon programı seçmeli ameliyat sonrası hibe yumurtalık ile gerçekleştirildi. Bu deney UNESP-FCAV (protokol No 026991/13) hayvanların kullanımı Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. deneysel hazırlık

1. Hazırlamak veya 500 mL steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) kalsiyum ve magnezyum olmadan satın alın.
2. Bir collagenase hazırlamak enzim DPBS 1 ml 40 µg karıştırılarak çözüm stok. 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre uygulama ve 2 mL aliquots-20 ° C'de depolayın
3. Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) düşük glikoz % 10 fetal serum ve antibiyotiklerin % 1 ile kültür ortamından hazırlayın.
4. Steril malzeme toplamak: makas ve forseps, doku kültürü flask, yemekler, tüpler ve 10 mL ve 5 mL pipetler.
5. Standart hücre kültür Labaratuar donanımları kullanın: bir biyolojik emanet dolabı (BSC), % 5 CO₂ ve 38 ° C ve bir santrifüj ayarlamak bir hücre kültür kuluçka makinesi.
6. BSC temiz: eldivenli elleriyle % 70 ile sterilize alkol, UV ışığı kullanarak.

2. izolasyon yumurtalık mezenkimal kök hücre

1. Ameliyattan sonra onların varış laboratuarındaki kadar PBS bir konik tüp buzda yumurtalık unutmayın.
2. 100 mm Petri tabağı PBS 10 mL ile doldurulması.
3. Yumurtalık tüpü çıkarması ve PBS ile ilk Petri kabına aktarın. Onları hareketleri karıştırma ile yıkayın.
4. Yavaşça yumurtalık almak ve başka bir çanak içine yerleştirin. Steril cımbız ve makas ile çok küçük parçalara, yaklaşık 1 mm boyutunda doku kıyma.
5. Yumurtalık dokusu bir 35 mm Petri kabına aktarın ve collagenase 2 mL ekleyin. Doku biraz daha kıyma.
6. 38 ° c kuluçka 3 h için Petri kabına yerleştirin ve yavaşça dairesel hareketler her 20 min ile Petri kabına sallamak.
7. 3 saat sonra Petri kabına kuluçka makinesi kaldırın.
8. Yemeğin içeriğini 15 mL tüp aktarmak. Genişletme ortam 5 mL ekleyin.
9. Santrifüjü önce tüpü yavaşça tersine çevirin. 2100 x g 7 dk. kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet genişleme medya 3 mL ile resuspend.
10. Pelet T25 biberondan aktarın. Kuluçka % 5 ile şişe koyun 3 h için 38 ° C'de CO₂ .
    Not: Prosedürün en önemli kısmı kuluçka 3 h sonra medya değiştirmektir.
11. Şişe kuluçka makinesi kaldırın ve medya kalan doku ile kaldırın. Taze genişleme medya 3 mL şişe ekleyin.
12. Medya her 48 h değiştirmek ve hücresel izdiham için şişe gözlemlemek.
    Not: Yordamı ana adımları Şekil 1' de görülebilir.

3. yumurtalık mezenkimal kök hücre genişlemesi

1. Hücre geçiş
   1. Hücreleri izdiham ulaştığınızda, medyayı şişeden çıkarın.
   2. PBS ile 3 mL şişe yıkama. PBS kaldırın.
   3. Tripsin ve şişe 38 ° C'de kuluçka 3 dakika süreyle hafifçe dokunun ayırmak için hücreleri yardımcı şişe yerine 1,5 mL ekleyin.
      Not: Hücreleri izdiham yaklaşık 5 - 7 sonra ilk kaplama d ulaştırılması gerekmektedir.
   4. Genişletme ortam 3 mL ekleyin ve içeriği bir konik tüp aktarın.
   5. 2100 x g 7 dk. kaldır at tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve 1 mL genişleme medya ekleyin.
   6. Yavaşça tüp içeriğini lunaparkçı.
   7. 10 µL sayma ve hücreleri ile tüp da kuluçka makinesine koy hücre gerçekleştirmek için örnek bir aliquot al.
   8. Karışımı içine hemasitometre yer 10 µL.
2. Hücreleri sayma
   1. Hemasitometre kılavuz çizgileri üzerinde odaklanmak ve mikroskop'ın 10 X objektif kullanın.
   2. Beş küçük kareler (Şekil 2) içinde hücreleri saymak.
   3. Sayılan sayısı mililitre başına hücre sayısı tahmin etmek için 50.000 tarafından çarpın.

4. yumurtalık mezenkimal kök hücre farklılaşma

Not: Hill ve ark. içinde kurulan esaslarına göre farklılaşma deneyleri gerçekleştirilmiştir ⁹.

1. Kuyuda nüsha, 4-şey kültür tabak başına tohum 1.0 x 10⁴ hücre.
2. Genişletme ortam 1 mL ekleyin.
3. Yavaşça dairesel hareketler ile çanak kışkırtmak.
4. 24 saat sonra arzu edilen farklılaşma medya ile kültür ortamı değiştirin.
5. İçin osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma, kuluçkaya indüksiyon medya 30 d için hücrelerle, Medya değiştirme ile her 3 ö. belirli farklılaşma kitleri her bu deneyleri için kullanıldı.
6. Nörojenik lineage farklılaşma için indüksiyon medya, medya değiştirilmesi her 3 d ile 10 d için hücreleri kuluçkaya. Burada kullanılan ortamı DMEM düşük glikoz, 2 mM valproik asit, 1 µM hidrokortizon, 10 µM forskolin, 5 mM potasyum klorür, 5 µg/mL insülin ve 200 µM butylated hydroxyanisole yer.
7. Endoderm medya reaktif üreticinin yönergelerine göre 5 d için endoderm öncüleri, kuluçkaya.
8. Primordial germ hücreli lineage farklılaşma için indüksiyon medya medya değiştirilmesi her 3 d ile 14 d için hücrelerde kuluçkaya. Burada kullanılan medya bulunan DMEM, %10 FBS, 1 mM sodyum pyruvate, 10 ng/mL LIF, 1 mM gerekli olmayan amino asitler, 2 mM L-glutamin, 5 µg/mL insülin, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 60 µM putrescine, 20 µg/mL transferrin, 10 ng/mL fare epidermal büyüme faktörü, 1 ng/mL insan temel fibroblast büyüme faktörü, 40 ng/mL insan gliyal hücre satırı kaynaklı nörotrofik faktör ve 15 mg/L penisilin.

Sonuçlar

Köpek yumurtalık mezenkimal kök hücre izolasyon:

Yumurtalık MSC yalıtım yordamı Şekil 1' de özetlenmiştir. Cerrahi, doku kıyma, collagenase sindirim ve medya Değiştir 3 h başında kültür sonra sonra hızlı plastik yapışkanlı özellikleri sözde MSC nüfusuyla başarıyla köpek yumurtalık dokusundan izole edildi. Hasat hücreleri hızla kültü...

Tartışmalar

Burada kanıt MSCs ovariectomy sonra biyolojik atık olarak kabul edilir köpek yumurtalık dokusu yalıtılmış olmasını sağlamak. Birçok hücre tipleri-ebilmek bulunmak içinde Yumurtalık nedeniyle gerçeğini, başarılı bir şekilde büyüdü hücreleri bir monolayer fibroblast benzeri görünümdeki seçili plastik hızlı onların bağlılığı dayalı MSCs seçmek için bir protokol evlenme teklif etti.

MSCs türetmeye kemik iliği ilk rapor MSCs plastik yapışma kapasitesini k...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Thermo Fisher	14190144
Collagenase I	Thermo Fisher	17100017
Tissue flask	Corning	CLS3056
DMEM low glucose	Thermo Fisher	11054020
FBS	Thermo Fisher	12484-010
TrypLE express	Thermo Fisher	12604021
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007001
StemPro Chondrogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007101
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit	Thermo Fisher	A1007201
STEMdiff Definitive Endoderm Kit	StemCell	5110
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15070063
CD45	AbD Serotec	MCA 2035S
CD34	AbD Serotec	MCA 2411GA
CD90	AbD Serotec	MCA 1036G
CD44	AbD Serotec	MCA 1041
Nestin	Milipore	MAB353
β-Tubulin	Milipore	MAB1637
DDX4	Invitrogen	PA5 -23378
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR80F
IgG- FITC	AbD Serotec	STAR120F