C-Fos rolü ve Dusp1 onkogen bağımlılığı değerlendirme yöntemleri

Özet

Burada, c-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal doğrulama uyuşturucu hedef olarak tüp bebek ve içinde vivo genetik ve insanlaşmış fare modelleri kullanarak lösemi için iletişim kuralları açıklar. Bu yöntem, herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme için uygulanabilir.

Özet

Tirozin kinaz inhibitörleri (TKIs) kronik miyeloid lösemi (CML) tedavisinde gösteri kanser tedavi yeni bir dönemin habercisi. Ancak, küçük bir nüfus hücre TKI tedavi için minimal rezidüel hastalık (MRD); kaynaklanan yanıt vermiyor Bu hücreler ortadan kaldırmak için bile en güçlü TKIs başarısız. Bu MRD hücreler tedaviye direnç geliştirmek için bir depo olarak hizmet vermektedir. Neden TKI tedavi MRD hücreleri karşı etkisiz bilinmemektedir. Büyüme faktörü sinyal MRD hücreleri hayatta kalma TKI tedavisi sırasında destek karıştığı, ama mekanik bir anlayış eksik. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bir yükseltilmiş c-Fos ve yakınsak bir sonucu olarak Dusp1 ifade oncogenic ve büyüme faktörü MRD hücreleri sinyal TKI direnç aracılık gösterdi. C-Fos ve Dusp1 genetik ve kimyasal inhibisyonu CML TKIs zarif duyarlı işler ve her iki genetik ve insanlaşmış fare modellerinde CML tedavileri. TKI-duyarlı ve - dayanıklı hücreleri birden çok microarrays kullanarak bu hedef genlerin tespit edilmiştir. Burada, biz tüp bebek ve içinde vivo fare modelleri kullanarak hedef doğrulama için yöntemler sağlar. Bu yöntemlerin herhangi bir hedef için genetik doğrulama ve terapötik geliştirme kolayca uygulanabilir.

Giriş

Kurucu Tirozin kinaz aktivitesinin BCR-ABL1 füzyon onkogen kinaz aktivitesi küçük molekül inhibitörleri tarafından hedeflemek için bir gerekçe sağlar CML neden olur. CML hastaların tedavisinde TKIs başarısı hedefe yönelik tedavi^1,2kavramı devrim. Daha sonra anti-kinaz terapisi hassas ilaç olarak solid tümör dahil olmak üzere birçok diğer maligniteler için geliştirilmiştir. Şimdiye kadar otuzdan fazla kinaz inhibitörleri çeşitli maligniteler tedavisi için United State FDA tarafından onaylanmıştır. TKI tedavi hastalık bastırmak çok etkili olmakla birlikte, iyileştirici değil. Ayrıca, tedavi sırasında kanser hücrelerinin küçük bir nüfus devam ederse: MRD^3,4,5. Tam iyileşme gösterdi bile hasta sonunda sonuçları nüks içinde değilse sürekli bastırılmış MRD ile bırakılır. Bu nedenle, MRD hücreleri eradikasyonu dayanıklı veya tedavi edici bir yanıt elde etmek için gereklidir. CML tanımlama hassas tıp kavramı, oncogenesis, rasyonel hedef yönelik tedavi, hastalık ilerleme ve ilaç direnci mekanizmaları için değerli bir paradigma temsil eder. Ancak, bugün bile, TKI indüklenen hücre ölümü kanser hücrelerinde sürüş mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır, ne de neden MRD hücreleri (lösemik kök hücrelerinin [LSCs] oluşan) TKIs^4,-⁶özünde dayanıklı. Yine de, mutant kinaz oncoprotein için "onkogen bağımlılık" olgusu içinde nereye TKIs tarafından hedeflenen onkogen akut inhibisyonu bir büyük proapoptotic yanıt ya da sendika hücredeki yol açan bir oncogenic şok neden TKI etkinliği karıştığı içerik bağımlı bir şekilde^6,7,8,9. Ancak, mekanik destek onkogen bağımlılığı eksik. Son yıllarda yapılan çalışmalarda büyüme faktörü sinyal onkogen bağımlılığı abrogates ve sonuç olarak direnç TKI terapi^10,11,12confers karıştığı. Bu nedenle, onkogen bağımlılığı mekanizmasının bir anlayış kazanmak için biz bütün-genom ifade BCR-ABL1 bağımlısı ve nonaddicted hücreleri (büyüme faktörleri ile büyüdü), c-Fos ve Dusp1, kritik arabulucu olduğunu ortaya profil oluşturma gerçekleştirilen onkogen bağımlılığı¹³. C-Fos ve Dusp1 genetik silinmesi sentetik BCR-ABL1 ifade etmek için öldürücü hücreler ve deneyde kullanılan farelerde lösemi geliştirmek değil. Ayrıca, c-Fos ve DUSP1 inhibisyonu küçük molekül inhibitörleri tarafından BCR ABL1 indüklenen CML farelerde tedavi. Öyle ki daha yüksek düzeyleri terapi¹³direnç neden iken alt düzey ilaç duyarlılığı görüşmek ifade düzey c-Fos ve Dusp1 kanser hücrelerinde apoptotik eşik tanımlamak sonuçlar gösterir.

Onkogen bağımlılığı sürüş genlerin tanımlamak için hem fare - ve CML hasta kaynaklı hücreler (K562) kullanarak deneyler büyüme faktörü ve TKI (imatinib) profil oluşturma birkaç bütün-genom ifade seslendirdi. Bu veri paralel CML hasta veri kümeleriyle CD34 elde edilen analiz edildi⁺ hematopoietik kök hücre imatinib ile işlemden önce ve sonra. Bu analiz üç gen saptandı (transkripsiyon faktörü [c-Fos], Çift özgüllük fosfataz 1 [Dusp1] ve bir RNA-bağlayıcı protein [Zfp36]) hangi are sık TKI dayanıklı hücrelerdeki upregulated. İlaç direnci veriyor bu genlerin önemi doğrulamak için adım adım vitro ve in vivo analizi yapılır. Bu genlerin ifade düzeyde gerçek zamanlı qPCR (RT-qPCR) ve ilaca dirençli hücrelerde western Blot tarafından teyit edildi. Daha fazla, cDNA overexpression ve c-Fos, Dusp1, shRNA tokalar tarafından nakavt ve Zfp36 yükseltilmiş c-Fos ve Dusp1 ifadeleri yeterli ve TKI direnç danışmam gerekli olduğunu ortaya koymuştur. Bu nedenle, fare modelleri c-Fos ve Dusp1 ile sadece kullanma içinde vivo bir doğrulama işlemi. C-Fos ve Dusp1 genetik doğrulama için biz ROSACreERT indüklenebilir c-Fos^fl/fl fareler (koşullu nakavt)¹⁴ oluşturulan ve onları ROSACreERT2-c-Fos^{fl/fl yapmak Dusp1- / - (düz nakavt)15 ile çapraz} Dusp1^{- / -} çift transgenik fareler. Kemik iliği türevi c-Seti⁺ hücreleri (c-Fos üzerinden^fl/fl-, Dusp1^{- / -}- ve c-Fos^fl/flDusp1^{- / -}) BCR-ABL1 ifade edildi analiz vitro bir koloni oluşturan birim (CFU) tahlil ve içinde Vivo c-Fos ve Dusp1 şartı tek başına veya birlikte lösemi gelişme test etmek için öğrenirim radyasyonlu farelerde kemik iliği nakli tarafından. Aynı şekilde, kimyasal engellemeler BCI tarafından Dusp1 ve c-Fos DFC (difluorinated curcumin)¹⁶ (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)¹⁷ test edildi tüp bebek ve içinde vivo BCR-ABL1-ifade, kemik kullanarak vahşi-tipi (WT) fare hücrelerden kemik iliği türevi c-Seti⁺ . C-Fos ve Dusp1 gereksinim lösemik kök hücre olarak onaylamak için biz nerede BCR-ABL1 özellikle kök hücrelerine doksisiklin (Tet-transactivator ifade fare kök hücre lösemi (SCL) Gen 3' artırıcı altında tarafından akımıdır CML fare modeli kullanılan Yönetmelik)^18,19. Kemik iliği Lin^-kullanılan Sca⁺c-Seti⁺ (LSK) hücreleri bu fareler içinde vivo nakli tahlil üzerinden. Ayrıca, phopsho-p38 düzeyleri ve Il-6 Dusp1 ve c-Fos inhibisyon, ifade pharmaco dinamik biyolojik olarak sırasıyla kurduk vivo içinde. Son olarak, çalışma insan alaka, hasta kaynaklı CD34 için genişletmek için⁺ (c-Seti⁺ hücreleri eşdeğer üzerinden fareler) vardı tabi uzun vadeli için tüp bebek kültür başlatılıyor hücre deneyleri (LTCIC) hücreleri ve bir içinde vivo insanlaşmış fare modeli CML^20,21. İmmünyetmezligi fareler CML CD34 + hücre, ardından ilaç tedavisi ve insan lösemik hücre sağkalım analizi ile nakledilen.

Bu projede, biz farklı preklinik modelleri kullanarak hedef tanımlama ve genetik ve kimyasal araçlarını kullanarak doğrulamaları için yöntemler geliştirmek. Bu yöntemler, terapötik geliştirme için kimyasal yöntemleri geliştirme diğer hedefler doğrulamak için başarıyla uygulanabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) esaslarına göre yapılmıştır. İnsan örnekler (Normal BM ve CML bundan (p210-BCR-ABL +) Lösemi) Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylanan iletişim kuralları üzerinden alınan (Kurumsal değerlendirme Komitesi: Federalwide güvence #00002988 Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi) ve CCHMC ve Cincinnati Üniversitesi izin donör bilgili.

1. gerçek zamanlı qPCR Analizi

1. Toplam RNA ile % 10 FBS ve % 10 WEHI harcanan kültür orta interlökin-3 (IL-3) kaynağı olarak takıma RPMI büyüyen BaF3 hücrelerden yalıtmak.
2. Logaritmik faz (% 99 canlı) (IL-3 ve imatinib) yanı sıra tedavi edilmezse örnekleri hücreleri hasat ve onları vasıl 435 x g 3 dk santrifüj kapasitesi. Sağlık ve gelişim aşamaları hücrelerin gen ifade profillerini önemli ölçüde değiştirebilirsiniz gibi kritik öneme sahiptir.
3. RNA toplam RNA²²arındırıcı tarafından izole et. Toplam RNA ölçmek; o zaman, DNaz tedavi²³için tabi. RNA DNA-Alerjik eşit miktarda dönüştürmek (2 µg) cDNA transkriptaz²⁴ile için.
4. QPCRs gene özgü astar (Tablo 1) ile gerçekleştirin. 0.2 ml 20 µL reaksiyonlarda PCR taşımak, ince duvarlı PCR tüpleri 1 x polimeraz kullanarak optik büyük ile (bkz. Tablo reçetesi) mix her astar 0.5 µM, DNA ve su 1 µL. Thermocycler aşağıdaki döngüsü ile reaksiyon yer: adım 1, 95 ° C 10 dakika; Adım 2, 15 95 ° C s; Adım 3 için 1 dk 60 ° C'de; Adım 4, 40 kez 2-3 adımları yineleyin. Tüm PCR triplicates içinde gerçekleştirmek ve komplo önce β-aktin ifade için gerçek zamanlı verileri normalleştirmek.

2. Batı kurutma

Not: Bütün hücre özleri hazırlanan Kesarwani içinde açıklandığı gibi 1 lizis arabellek x 250 µL ekleyerek vd.¹³ bir proteaz inhibitörü kokteyl ve fosfataz inhibitörü kokteyl 2 ile desteklenmiştir.

1. Beş milyon BaF3 hücreleri Logaritmik faz (% 99 canlı) (IL-3 ve imatinib) tedavi yanı sıra Santrifüjü 435 x g 4 ° C'de 3 dk de tarafından işlenmemiş BaF3 hücreleri hasat 1 x, 80 ° C'de 5 dk kuluçka ardından yukarı ve aşağı pipetting lizis arabellek (250 µL) hücreleri parçalayıcı Lysate 5 5-6 darbeleri ile tüm DNA yıkmak için solüsyon içeren temizleyicide her 4 ° C'de soğuk bir odada s
2. Lysate 1.5 mL tüp aktarmak ve 16.000 x g çözünmez herhangi bir malzeme çıkarmak 5 min için de santrifüj kapasitesi. Özü-80 ° C'de kullanımı kadar saklanabilir. Isı örnekleri ile 80 ° C arasında bir sıcaklık blok yüklemeden önce 5 min için. 10 µL % 10 SDS-sayfa jel bir jel-yükleme ipucu kullanarak örneği yükleyin.
3. Referans boya jel sonuna ulaşana kadar 150 V proteinler gidermek. Protein nitroselüloz membranlar için 1 h için 1 amp, elektroforetik bir transferi ile aktarın. Aktarımdan sonra 1 x Tris arabelleğe alınmış serum + %0,1 membranlar blok ara 20 (TBST) %5 yağsız süt için 1 h ve 1:1,000 seyreltme, uygun antikorlar ile gecede 4 ° C'de sonda ile.
4. Membranlar 3 yıkama x TBST ile 5 x 10 dk her; sonra bir HRP Birleşik uygun ikincil antikor (1:5, 000 seyreltme) Oda sıcaklığında ile probe 1 h için. TBST kullanılan kapsayıcı boyutuna bağlıdır. TBST membran tamamen daldırın emin olun. İkincil antikor 3 yıkama x 5 min her TBST ile için.
5. Chemiluminescent substrat reaktif kullanarak leke geliştirmek. Belgili tanımlık substrate ve kullanımdan önce Şu iki şişe arabelleğinden eşit miktarda karıştırın. 1 mL pipet ile bütün membran kapak ve 1 dk. için kuluçkaya membran üstüne belgili tanımlık substrate ekleyin. Lekesi 1 – 10 dk içinde belgili tanımlık substrate ekleme yansıması.
6. Künt forseps kullanarak, dikkatle membran görüntüleme sistemi platformda yer (bkz. Tablo malzemeler), çok sıvı kaçınarak. Canlı bir görünüm seçin ve lekeleri ve chemiluminiscence menüsünden seçin. El ile alma kullanarak, farklı zaman noktalarda birden çok pozlamayı elde etmek. Bu dosyalar görüntülenmeyecektir ve görüntüleme yazılımı kullanarak sayılabilir.

3. nesil nakavt fareler

1. C-Fos^fl/fl fareler ROSACreERT2c-Fos^fl/fl fareler¹³oluşturmak için ROSACreERT2 fareler ile çapraz. Çift-nakavt (KO) fareler oluşturmak için ROSACreERT2c-Fos^fl/fl fareler ROSACreERT2c-Fos^fl/fl Dusp1^{- / -} fareler¹³oluşturmak için Dusp1^{- / -} fareler ile doğurmak. Genotip fare kuyruğu klipleri tarafından aşağıda açıklandığı gibi PCR tarafından takip ettim.
2. Genotipleme:
   1. DNA hazırlamak için kuyruk küçük bir bölümünü makasla klip ve 1,5 mL tüp içine koy. Kuyruk ısıtmalı makasla dağlamak. 50 mm NaOH 200 µL tüp kısaltıldı kuyrukta ekleyin ve 95 ° c ısı blok 1 h için kuluçkaya.
   2. Girdap iyi tüp ve sonra tekrar 50 µL 1 M Tris HCl pH 6.8 ve girdap ekleyerek etkisiz hale getirin. 1 dk. için maksimum hızda tüp santrifüj kapasitesi.
   3. 1 x Taq polimeraz ana karışımını içeren boya, astar her 0,5 µM, DNA ve su 1 µL kullanarak ince duvarlı PCR tüpleri, 0.2 ml 20 µL reaksiyonlarda PCR taşımak. Tüpler içinde thermocycler yerleştirin ve Tablo 2' de gösterildiği gibi uygun döngüleri çalıştırın.
   4. PCR ürünü % 2 özel jel ve görüntü bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak çalışır.

4. kemik iliği hücrelerinden c-Seti⁺ yalıtım

1. Fareler kurumsal esaslarına göre kurban.
   Not: Burada, fareler bir according karbondioksit (CO₂) maruz kaldılar kadar ölüm solunum ve kalp atışı kesilmesi tarafından belirlenen akış hızı önerilen travma için takip tarafından servikal çıkığı.
2. Fareden bacakkemikleri hasat — iki uyluk, iki yırtılmalarıteşhis, iki iliacs. Tüm kemikleri dokulardan uzak neşterle kazıma temiz. Bacak kemikleri soğuk 1 x PBS buza koyun — 15 mL tüp içinde 5 mL. Tüp içeriğini bir harç dökün ve bir havaneli ile ezersin.
3. Hücre süspansiyon 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla, bir pipet kullanarak bağlı bir 10 mL pipet ile 50 mL vidalı kapak tüp içine filtre. Harç ve havaneli birden çok kez soğuk 1 x PBS, toplama ve hücre süspansiyon 50 mL tüp ekleme ile yıkayın. Spin aşağı vasıl 1200 x g 4 ° c 5 dk. Kaldır süpernatant ile bir vakum cam pipet ile bağlı kemik iliği. Hücre Pelet 5 ml 1 x PBS bir pipet ile askıya alma.
4. Bir pipet ile yavaş yavaş askıya alınan kemik iliği oda sıcaklığında (sıcaklık kritik) 5 mL başına ekleyin. polysucrose, arabirimin rahatsız etmek büyük ilgileniyor. 400 x g , oda sıcaklığında 20 dakika için de devre dışı fren ile spin.
5. Bir pipet ile bulutlu toplam mono-nükleer hücre (TMNC) arabirimi toplamak ve yeni bir 15 mL tüp içine koydu. Birimin getirmek kadar 10 mL 1 x PBS için yıkama ile saymak, 20 µL alarak ve spin vasıl 1200 x g 5 dk. atma süpernatant 4 ° C'de ve Pelet buz adım 4.6.1 için tasarruf edin.
6. C-Seti⁺ gerçekleştirmek hücre izolasyon.
   1. C-Seti⁺ için bir microbead kiti iletişim kuralı izleyin hücre izolasyon. Hücre pelet 1 x PBS + EDTA + BSA 80 µL 10⁷ hücrelere resuspend. Hücre süspansiyon için 20 µL CD117 lastikteki/10⁷ toplam hücre ekleyin. De vortexing tarafından mix ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya Birimin getirmek 1 x PBS + EDTA + BSA ve spin ekleyerek 10 mL 1200 x g 4 ° c 5 min için de.
   2. Bir vakum yoluyla süpernatant çıkarın ve 1 x PBS + EDTA + BSA 500 µL/10⁸ toplam hücrelerinde hücre Pelet askıya alma. Mıknatıs standı kullanarak bağlı, manyetik sütun ile 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA ekleyin ve yerçekimi 15 mL toplama tüp içine üzerinden akışı sağlar.
   3. İlk arabellek ek sütun geçerken tamamlandıktan sonra hücre süspansiyon yerçekimi 15 mL toplama tüp içine üzerinden akışı izin sütun ekleyin. Bu flowthrough istenmeyen hücre kesir var.
   4. 3 kere 3 mL 1 x PBS + EDTA + BSA ile sütun her zaman yolu ile yerçekimi toplama tüp içine akışı izin yıkayın. Sütun mıknatıs çıkarın ve bir 15 mL tüp yerleştirin.
   5. 5 mL 1 x PBS + EDTA + BSA ekleyin ve hemen sütun ile sağlanan pistonu ile yıkayın. Pistonu çıkarın ve floş bir ek 5 mL 1 x PBS + EDTA + BSA ile yineleyin. Standart yöntemleri kullanarak toplam birim hücreleri saymak.
   6. Spin aşağı vasıl 1200 x g 5 dk. Kaldır süpernatant 4 ° C'de hücreler ve Pelet tam IMDM resuspend (IMDM + %10 FBS + Il-6 [10 ng/mL] mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) kültür için. Bu hücreler hücre IMDM tam medya 2 x 10⁶ hücreler/1 mL bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂yerleştirerek gecede kültür.

5. iletim

1. Retroviral plazmid transfection
   1. Taze su banyosu öğleden önce 37 ° C'ye ayarla HEK293 hücreleri tezcan 435 x g 3 dk. Kaldır için oda sıcaklığında, HEK hücreleri içeren cryotube süpernatant ile bir vakum spin ve 1 ml % 10 ile desteklenmiş DMEM hücre Pelet askıya FBS, penisilin, streptomisin ve glutamin.
   2. Hücreleri saymak ve uygun cilt tedavi 10 cm çanak (~ 4 x 10⁶ HEK293T hücreleri) ekleyin. Yemek için DMEM 10 medya 14 mL ekleyin ve karıştırarak de eşit bir dağıtım için yukarı ve aşağı kaydırarak. Bir 37 ° C, % 5 CO₂ kuluçka gecede çanak yerleştirin.
   3. Ertesi sabah, bir ters ışık mikroskobu altında hücreler izdiham kontrol (% 50 veya daha iyi çalışıyor).
   4. DNA (istenen retroviral plazmid), PclEco (ambalaj plazmid), 2 M CaCl₂ve H₂0 (= 500 µL) 1,5 mL tüp içinde birleştirmek aşağıdaki miktarlarda bir micropipette kullanarak: DNA (BCR-ABL1-YFP), pCLeco, 2 M CaCl₂ 62 µL 7.5 µg 7.5 µg ve son hacmi 500 µL. eklemek 500 µL 2 x HBS için başka bir 1,5 mL Tüp, su.
   5. DNA dropwise 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES ve 1.5 mM Na₂HPO₄) 500 µL içeren 1,5 mL tüp mix karıştırma sırasında ekleyin. Bunu başarmak için en düşük hız bir girdap ayarlayarak ve HBS tüp üzerinde transfection mix eklerken sürekli karıştırma için basılı tutun.
   6. Transfection karışımı oda sıcaklığında 20-30 dk için kuluçkaya için izin. Kuluçka sırasında 25 nM klorokin HEK hücrelere ekleme ve bunları da kuluçka makinesine koyun. Kuluçka sonra transfection karışımı dropwise HEK hücrelere ekleme ve sonra yavaşça girdap medya plaka boyunca transfection mix karıştırın.
   7. ~ 8 h bir 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka için karışımı hücrelerle kuluçkaya. Bu hücreler medyada çok yavaş yavaş ekleyerek 14 mL taze DMEM 10 medya tarafından değiştirin. Yavaş yavaş yemek duvara pipetting herhangi bir HEK hücrelerinin sıyırma önlemeye yardımcı olur. 37 ° C, % 5 CO₂ kuluçka gecede hücrelerde kuluçkaya.
   8. Viral süpernatant bir 10 mL şırınga toplamak, süpernatant şırınga çizmek ve 0,45 µm şırınga filtre ekleyebilirsiniz. Viral süpernatant yeni bir koleksiyon tüp içine dalma. Daha sonra ilk toplama viral süpernatant ~ 16 h almak.
2. Fibronektin viral konsantrasyon ve iletim
   1. 0.1 mg rekombinant insan fibronektin parçanın 2 mL 1 x PBS tedavi edilmemiş 6-şey kültür tabakaları bana ekleyin. Gerektiği gibi kadar fibronektin hazırlamak, hangi hücreleri ve genotip sayısına bağlıdır. Bir de yeterince transduce 10 milyon c-Seti⁺ hücreleri. Gecede 4 ° C'de plaka kuluçkaya
   2. Ertesi gün, fibronektin wells bir pipet pipet 2 mL 1 x PBS plaka engellemek ve oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya steril % 2 BSA ile kaldırın. Bir vakum yoluyla BSA kaldırmak ve iyice pipetting 2 mL tarafından 1 x PBS yıkayın sonra bir vakum kaldırın.
   3. Hemen taze toplanan ve (0,45 µm) süzülmüş ekleyin viral süpernatant en çok 5 mL. 435 x g 32 ° c de 2 h. süpernatant ile bir vakum kaldırmak ve ek taze toplanan viral süpernatant ile bu işlemi tekrarlayın ve tekrar santrifüj kapasitesi. Süpernatant ile bir vakum kaldırmak ve 2 mL 1 x PBS ekleyerek kuyuları yıkayın; o zaman, üzerinden bir vakum kaldırın.
   4. C-Seti⁺ fare kültürlü geceleme (adım 4.6.6) viral kaplamalı wells için tarafından hücre süspansiyonlar iyi karıştırma ve bunları şimdi viral konsantre Fibronektin plaka pipetting olduğunu hücreleri ekleyin. 1200 x g 90 dk. hücreleri bir 37 ° C, % 5 CO₂ kuluçka makinesi koymak için 25 ° c de spin.
   5. 48 h posttransduction, hücreleri tarafından Santrifüjü 1200 x g 5 min için 4 ° C'de de cips ve onları FACS arabelleğe #1 (1 x PBS + %0.5 BSA) 6 x 10⁶/mL olarak resuspend. YFP akış sitometresi kullanarak pozitif yüzdesi ölçerek BCR-ABL1 pozitif hücrelerinin yüzdesini belirleyin.
   6. Standart prosedür olaylarıyla elde etmek. İlk olarak, ön ve yan dağılım dayalı canlı hücreleri kapı. Sonra YFP olumlu canlı hücre negatif kontrol (Şekil 4) tarafından belirlenen YFP negativecells hariç kapısı.

6. koloni oluşturan UnitAssays

1. Sitokinler, oda sıcaklığında 1 – 2 h. Aliquot 3 mL 5 mL şırınga iğne olmadan kullanarak bir FACS tüp methylcellulose için fare ile methylcellulose çözülme. YFP-pozitif hücre hücre sıralayıcıda sıralayın.
2. Hücreleri aşağı spin ve Pelet IMDM tam medyada askıya alma. Kaplama ve onları IMDM tam medya 100 µL 5.000 YFP-pozitif hücreleri elde etmek için sulandırmak için hücreleri saymak.
3. 5.000 YFP-pozitif hücreler ve methylcellulose 3 mL için uygun inhibitörleri içeren hücre süspansiyon 100 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Girdap yüksek 10-30 s için karıştırın.
4. Sonra hava kabarcıkları kaçmış en, bir tarafta ortam çıkarma ve yavaş yavaş eşit şekilde yaymak için dairesel bir hareketle plaka devirme 1 mL üç Çoğalt 3 cm tabak medya plaka için 1 mL şırınga kullanın.
5. Kullanmak için inhibitörleri son konsantrasyonu imatinib 3 µM, DFC 0.2 µM ve BCI 0.5 µM, at, tek başına veya kombinasyonları vardır. Uygun olursa olsun, c-Fos 4-hydroxytamoxifen için methylcellulose eklendi (1 µg/mL) ile hücreleri kaplama silin.
6. Kaplama sonra plakaları 2 mL steril su orta içeren bir açık yemek ile büyük bir Petri tabak koyun. Büyük Petri kabına kapak ve dikkatle 37 ° C, % 5 CO₂ kuluçka kuluçkaya. Koloni sayıları kolonileri mikroskop altında toplam sayısını sayarak kaplama bir hafta sonra kaydedin.
7. PCR ile c-Fos silinmek uygun plakalar üzerinden birkaç kolonileri analiz. Kolonilerin P1000 ucuyla emerek toplamak. 1 x PBS 500 µL hücrelerde ucu PBS içinde birden çok kez yıkayarak çıkarmak. Hücre süspansiyonlar 6.000 x g 1 dk. için de spin ve DNA genomik DNA izolasyon kit kullanarak hücre Pelet ayıklayın.
8. Genomik DNA PCR için astar mFos-FP3 ve mFos kullanarak kullanın- Tablo 2' de açıklandığı gibi RP5. PCR ürünlerinin % 2 özel jel ve bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak görüntü analiz.
9. Kolonilerin grafik tanıtımı için Iodonitrotetrazolium klorür kullanarak koloniler, leke. 10 mg 10 mL su 1 mg/mL solüsyon elde etmek için Iodonitrotetrazolium klorür geçiyoruz. Filtre sterilize radarı kilit bir 10 mL şırınga steril koşullarda bir doku kültürü başlıklı bağlı 0.2 µm filtre ile kullanarak çözüm.
10. Doku kültürü başlık, dropwise etrafında CFU plaka boyama çözüm 100 µL ekleyin; Slayt ya da kolonileri rahatsız değil dikkatli olun. Gecede bir 37 ° C, % 5 CO₂ hücre kültür kuluçka levha kuluçkaya. Kolonilerin koyu kırmızımsı kahverengi dönecek. Beyaz bir arka plan steril doku kültürü mahallede kullanarak, lekeli CFU plaka fotoğraf çekmek.

7. transplantasyon ve mortalite tahlil

1. Öğrenirim 7.0 Gy 4.75 Gy tarafından takip bir doz adlı bir 137 Cs tabanlı gama ışını kullanarak bölünmüş radyasyon ile fareler ışınlatayım (0.5 Gy/dak), 3 h önce nakli ayrı.
2. 4 x 10 nakli⁴ sıralanmamış YFP pozitif (YFP yüzdeye göre hesaplanır) 3 x 10⁵ normal kemik iliği hücre içine her fare kuyruğu aracılığıyla bir taşıyıcı olarak hücrelerle damar enjeksiyon.
3. Ekimi, bir hafta sonra FACS kullanarak periferik kan YFP pozitif hücrelerden analiz ederek engraftment belirler.
4. Bir kuyruk ven taşma payı ve FACS analizi gerçekleştirin.
   1. A ısı lamba değil aşırı ısınma ya da yanmak onları dikkatle altında fareler kafesi sıcak.
   2. Bir fare restrainer bir fare dizginlemek ve steril bir bıçak ile kuyruk damar nick. Yavaşça gelen kuyruk arka, bir kan damlası birikmesine izin anterior süt. Bu doldurulana kadar kan heparinized kılcal tüp ile toplamak (etrafında toplamak 75-100 µL). Kan dolu kılcal tüp sizden EDTA içeren bir kan toplama tüp dalma ve iyice karıştırın.
   3. RBCs 3 mL 1 x RBC lizis arabelleği (150 mM amonyum klorür, 10 mM potasyum bikarbonat ve 0.13 mM EDTA) 30-40 µL kan ekleyerek parçalayıcı. Karıştırın tüp birden çok kez ters çevirme. 1200 x g 4 ° c de 10-15 dk. Spin için oda sıcaklığında 5 dk. süpernatant ile bir vakum kaldırmak ve Pelet 2 ml 1 x PBS bir yıkama için askıya almak için kuluçkaya.
   4. 1200 x g 5 dk. Kaldır süpernatant 4 ° C'de, spin ve FACS arabellekte #1 askıya alma. FACS adım 5.2.5–5.2.66 yukarıda açıklandığı gibi analizlerini. Kısa vadeli deposu, 4 ° C'de çeşitli amaçlar için kullanılan koleksiyon tüp içinde kalan kan
5. 10-%40 YFP pozitif hücreler kan periferik gösterdi transplante fareler deneme için kullanılmıştır. YFP pozitif hücrelerinin % 2'den az olan fareler çalışma dışı bırakıldı.
6. Tamoxifen, 20 mg/mL Mısır yağı tamamen eriyene kadar aralıklı vortexing ile 60 ° C'de hazırlamak ve tedavi süresince karanlıkta 4 ° C'de saklayın. Tamoxifen (Mısır yağı 100 mg/kg) intraperitoneally enjekte edilerek c-Fos^fl/fl gen nakli, bir hafta sonra silmek (IP) fare, her gün üç gün üst üste için içine. Farelere enjekte etmek için ne kadar tamoxifen belirlemek için tartılır vardır önemlidir. Tamoxifen tedavisinden sonra (uygun yerde), fareler ilaç tedavileri için grubu (n = 5/Grup).
7. Fareler lösemi ilerleme ve hayatta kalmak için izlemek ve fareler günümüze sekiz hafta lösemik yük (YFP-pozitif hücreleri tarafından FACS) haftalık ilâ belirlemek.
8. Kan c-Fos silme işlemi için uygun olursa olsun, yukarıda 6 bölümünde açıklandığı gibi analiz. Hayatta kalan fareler her gün kaydedin ve sağkalım eğrisi grafik yazılımı kullanarak deney sonunda arsa.

8. transgenik fareler modeli BCR-ABL1 lösemi

1. LSK yalıtım
   1. Scl-tTA transgenik fareler üzerinde bir ifade BCR-ABL1 önlemek için doksisiklin chow korumak. Dört hafta önce organ nakli, fareler doksisiklin kapalı yemek BCR-ABL1 ifade için al.
   2. TMNCs Scl-tTA transgenik fareler bölümde 4 yukarıda açıklandığı gibi izole et. TMNCs FACS arabelleği #2 (1 x PBS + %0.5 BSA + 2 mM EDTA) 10⁶ hücre/mL elde etmek için askıya alma.
   3. Lineage hücre algılama kokteyl biotin 10 µL ekleyerek TMNCs soy-pozitif hücreler için tüketmek (CD5 karşı monoklonal antikor biotin Birleşik [fare Igg2a], CD11b [fare Igg2a], CD45R [B220] [Igg2a sıçan] Anti-7-4 [fare Igg2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, sıçan Igg2a] ve Anti-Ter-119 [fare Igg2b]) 1 x 10⁶ hücre başına. 10 dk içinde belgili tanımlık karanlık bir yıkama FACS arabelleği #2, 5 mL ile takip ve 1200 x g 5 dk. aspiratı süpernatant 4 ° C'de de tamamen spin ve FACS arabelleği #2 400 µL hücrelerde askıya 4 ° C'de hücreler kuluçkaya.
   4. Anti-biotin antikor-FITC eşlenik 5 µL, Ly-6A/E (Sca1) PECy7 1.2 µL ve CD117 (c-Kit) APC antikor ilâ 10⁸ milyon hücreler için 2.4 µL ekleyin. Birimin getirerek karanlıkta 10 dk. Yıkama için oda sıcaklığında kuluçkaya ilâ 5 mL ile FACS arabellek #2; daha sonra 1200 x g 5 dk. Kaldır süpernatant 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet FACS arabellek #2 500 µL içinde askıya alma.
   5. Hücre süspansiyon mavi filtre-cap FACS tüp içine filtre.
   6. Ön ve yan dağılım kullanarak kapı canlı hücreler. Sonra MFI gösterdi lin^- hücreleri seçin (yani floresan yoğunluğu az 10²) hücreleri LSK almak için c-Seti⁺ ve Sca1⁺ bir biexponential üzerinde Arsa Lin^- üst ve sıralayabilirsiniz (Şekil 7 C).
   7. Sıralanmış hücreleri toplamak ve onları vasıl 1200 x g 5 min için 4 ° C'de santrifüj kapasitesi.
2. Nakli
   1. Sonra nakilden önce 3 h 4.75 Gy tarafından takip 7.0 Gy split radyasyon doz ile BoyJ fareler ışınlatayım öğrenirim.
   2. 3 x 10³ ile 10⁶ yardımcı kemik iliği hücreleri x 0,3 5 x 10³ BCR-ABL1-LSK hücrelere WT BoyJ fare kuyruğu ven (IV) üzerinden gelen radyoaktif BoyJ fareler enjekte.
   3. Dört hafta posttransplantation, CD45.1 ve CD45.2 için alıcı fareler analiz. TMNC kuyruk 7,4 adımda anlatıldığı gibi damar kanama tarafından periferik kandan elde edilir. FACS arabelleği 100 µL hücrelerde resuspend. 1 µL her 1 h için oda sıcaklığında CD45.1-FITC ve CD45.2-PE antikor hücrelerle kuluçkaya.
   4. Hücreleri FACS arabelleği ile 3 mL birime kadar getirerek yıkama ve vasıl 1200 x g 4 ° C'de 5 dk. süpernatant kaldırmak ve 1 x PBS 200 µL içinde resuspend için spin.
   5. CD45.1 ve CD45.2 üzerinde yüzde ilk günahı örneği temel alarak FITC ve PE pozitif hücreler çoğunluğuna tarafından takip ön ve yan dağılım dayalı canlı hücreleri çoğunluğuna göre analiz.
   6. Fareler Grup dört gruba (n = 6 grup başına). İmatinib ile tedaviye başlayın (75 mg/kg 2 günlük x) yalnız ve DFC + BCI ile birlikte (her iki uyuşturucu doz 10 mg/kg 2 verildi günlük x).
   7. Aynı şekilde, diğer gruplar imatinib (75 mg/kg) + curcumin (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) ve imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) kombinasyonları ile üç ay, 2 x bir gün ile muamele etmek için eklenen IP
   8. Lösemik chimerism için altı ay için bir ay x 1 fareler CD45.2 yüzdesi belirlenerek analiz olumlu kuyruk tarafından periferik kan hücrelerinde damar kanama açıklandığı gibi 7,4 adım '.

9. vivo değerlendirilmesinde BCI ve DFC etkinlik

1. Fosfo-p38 Analizi
   1. BCR ABL1 ifade c-Seti⁺ hücreleri ile 7 bölümünde açıklandığı gibi nakledilen üç lösemik fare (8-12 hafta yaşlı) alın. Fareler BCI (10 mg/kg) ile IP dört hafta posttransplant enjekte edilerek enjekte et.
   2. Fosfo-p38 periferik kan TMNC fosforilasyon akış sitometresi kiti üreticinin yönergeleri doğrultusunda kullanma düzeylerini ölçmek. Kan her fare sonra uyuşturucu enjekte önce ve 6 h toplamak. RBC tükenmesi tarafından TMNCs belirleyip onları aşağıdaki gibi çözmek.
   3. RBC lizis çözüm 100 µL periferik kan başına 4 mL ekleyin. Mix ve buz RBCs. Spin aşağı vasıl 1200 x g 4 ° C'de 5 min için hücreleri parçalayıcı ve süpernatant kaldırmak 5 min için kuluçkaya. Lizis 1 x daha tekrarlayın.
   4. İkinci lizis adımdan sonra 1 mL % 2 BSA ile hücre topakları PBS içinde yıkayın. Fiksasyon ve permeabilization çözümleri 100 µL ekleyerek hücreleri tamir ve karanlıkta 4 ° C'de 20 dk için kuluçkaya. Santrifüjü 1200 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından hücre cips
   5. Granül 1 mL 1 x permeabilization yıkama ile yıkayın. Hücreleri 100 µL üç eşit aliquots hücreleri 20 dk. bölmek için oda sıcaklığında permeabilization yıkama arabellekte 300 µL % 2 BSA ekleyerek engellemek (~ 1 x10⁶).
   6. Sabit hücrelerin her aliquot için toplam p-38 antikor, Fosfo-p38 antikor 1 µL veya izotip IgG kontrol, 1 µL 1 µL sırasıyla ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya
   7. Hücreleri 1 yıkama x 5 mL de %2 BSA içinde PBS ile ve ikincil antikor (Alexa Fluor-488 Birleşik 1 µL) ile Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Tekrar x 1 hücreleri yıkama ve onları 1 x PBS 200 µL içinde askıya alma.
   8. FACS tarafından veri elde etmek ve bunları Akış Sitometresi Analizi Yazılım tarafından analiz.
   9. Deneysel örnekleri MFI IgG denetiminden MFI düşeriz. Fosfo-p38 MFI değerleri daha sonra sonra BCI enjeksiyon Fosfo-p38 düzeylerini belirlemek için toplam p-38 olan için normalleştirilmiş.
2. C-Fos hedef genlerin kantitatif gen ifade Analizi
   1. 7 bölümünde açıklandığı gibi BCR ABL1 ifade c-Seti⁺ hücreleri ile nakledilen üç lösemik fare (8-12 hafta eski), al. Periferik kan her fare toplamak ve 10 mg/kg ile her DFC + BCI farelere enjekte et.
   2. Periferik kan 6 h sonra uyuşturucu enjekte toplamak. TMNCs tarafından RBC tükenmesi, yukarıda açıklandığı gibi izole et. TMNCs cips ve onları fenol tabanlı lizis arabellekte askıya alma ( Tablo malzemelerigörmek).
   3. Bcl2l11, Lif ve Il-6 ( Tablo 1' de gösterilen) gene özgü primerler kullanılarak (1 bölümünde açıklandığı gibi) RT-qPCR analiz gerçekleştirmek.

10. uzun vadeli kültür başlatılıyor hücre tahlil

Not: Bir LTCIC tahlil²⁵daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi.

1. Bir T175 doku kültürü şişesi içinde confluency için MEMα bir fare fibroblast hücre satır MS-5 büyür. Hücreleri HEK293T için yukarıda açıklandığı gibi trypsinize. MEMα hücrelerde 2 x 10⁶ hücre/mL, askıya alma. 10 x 10⁶ hücreler bir 50 mL konik tüp al ve 80 Gy ışınlatayım. 0.5 x 10⁶ hücre/mL % 10 FBS (M10) medya ile desteklenmiş MEMα hücrelere sulandırmak. 12-şey plaka bir kuyu başına 2 mL plaka ve bir 37 ° C, % 5 CO₂ kuluçka gecede kuluçkaya.
2. Ertesi gün, 2.5 mg 5 ml MEMα (1 M çözüm) çözülerek hidrokortizon sodyum hemisuccinate hazırlayın. Filtre-0.2 µm şırınga filtre Biyogüvenlik mahallede kullanarak hidrokortizon çözüm sterilize. Hidrokortizon seri seyreltme 100 µM çözüm elde etmek için MEM tarafından oranında seyreltin. Bu 250 µL insan uzun vadeli kültür orta (HLTM) için 25 mL ekleyin (bakınız Tablo reçetesi) sadece öncesinde 1 µM son bir konsantrasyon elde etmek için kullanın.
3. CML-CD34⁺ ve UCP3 TMNCs spin ve onları tarafından kısa vortexing içinde HLTM askıya alma ve sayar tarafından bir hemasitometre belirlemek.
4. Vakum M10 medya stroma hücreleri ile seribaşı 12-şey plaka kapalı ve eski yerine koymak o ile 1 mL hasta hücre (CML-CD34⁺ [10.000] ve UCP3 TMNCs [1 x 10⁶]) HLTM süspansiyon. Üç kuyu başına ilaç kombinasyonu her hücre türü kullanın.
5. İlaç stokları HLTM gerekli konsantrasyon 2 x oranında seyreltin. Uyuşturucu ile basına 1 mL 1 x ilaç konsantrasyonu elde etmek için yukarıda belirtilen hücrelere ekleyin. Medya yarısı beş hafta boyunca her hafta taze hazırlanmış HLTM ile değiştirin.
6. Altı haftalık LTC-BM tahlil dönemin sonunda nonadherent hücre kültürleri bir tüpün içine toplamak. Yapışık hücreleri trypsinize ve bunları ilgili nonadherent hücreleri ile birleştirir.
7. Hücreleri ve tahlil için CFUs methylcellulose orta içeren % 30 fetal buzağı serum içinde eritropoietin (3 adet/mL), SF yıkayın (50 ng/mL) ve IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL) ve granülosit/makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) (20 ng / mL). sayar tarafından bir hemasitometre belirlemek.
8. Plaka 5 x 10⁴ hücreleri üç çoğaltır. % 20 FBS ve % 10 DMSO kalan hücreleri aşağı dondur. Orta su içeren bir açık çanak ile büyük bir petri levha düzenlemek. Büyük Petri kabına dikkatlice kapağı ve bir 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka iki haftadır kuluçkaya.
9. Kolonilerin iki hafta sonra puan. Bazı durumlarda, hasat yalnızca bir kısmını CFUs için denetlesinler). Hücre hasat bölümünden elde edilen CFUs LTCIC extrapolating tarafından ilk hücre süspansiyon mevcut toplam sayısı dayalı hesaplamak. LTC-BM başına ortalama CFU çıktı 8'dir.
   Not: Örneğin, başlangıçta 1 x 10⁶ hücreler bir kuyuda, beş haftanın sonunda kaplama Eğer 0.5 x 10⁶ hücre hasat edildi, CFU, 5 x 10⁴ hücreleri kaplama ve 50 CFUs elde edilmiştir. Bu 500 CFUs/1 milyon kaplama hücreleri eşittir. Bu sayıyı 62.5 LTCIC almak için 8 tarafından böler.

11. insanlaşmış CML CD34 kullanarak fare modeli⁺ hücreleri

1. Sublethally insan IL3, ifade 8 haftalık NOD scid gama fareler, ışınlatayım GM-CSF ve SCF (NSGS), 7.0 Gy (700 RAD) 50 Rad/dk ile tek bir doz ile.
2. 3 x 10⁶ CD34 enjekte⁺ radyoaktif fareler BCR-ABL1 pozitif CML kronik faz hastalardan hücreleri İntravenöz enjeksiyon tarafından seçilen.
3. Ekimi bir iki hafta sonra fare ve insan özel antikorlar CD45 karşı kullanarak FACS tarafından kemik iliğinde lösemi engraftment belirler.
4. Bir FACS çözümlemesi gerçekleştirin.
   1. Kemik iliği aspiratı transplante farelerin kemiklerine üzerinden alın. RBC lizis tampon yukarıda açıklandığı gibi kullanarak RBCs parçalayıcı ve TMNCs tarafından Santrifüjü toplamak. Pelet 1 yıkama x soğuk 1 x PBS ile.
   2. Hücreleri insan FcR blok ve CD45 FITC ve anti-fare CD45 APC^Cy7 gecede 4 ° C'de Anti-insanla boyama tarafından takip fare FcR blok blok LSRII üzerinde FACS çözümlemeyi gerçekleştirmek ve Akış Sitometresi Analizi yazılım kullanarak veri analiz.
5. Fareler dört farklı tabur grubu (n = 6/grup) araç, imatinib (75 mg/kg), DFC BCI (her ikisi de 10 mg/kg), veya imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (her ikisi de 10 mg/kg) ile tedavi için. 1 x PBS (araç) hisse senedi ilaçları sulandırmak ve ı.p. 2 enjekte edilerek yönetme günlük x.
6. Fareler altı haftadır tedavi ve lösemik yük nakli sonra sekiz hafta kadar her iki hafta içinde 11.4 yukarıda açıklandığı gibi belirleyin.

Sonuçlar

Onkogen bağımlılığı TKIs tedavi edici etkinliği karıştığı olmuştur. Ancak, onkogen bağımlılığı sürüş mekanizmaları anlaşılmadı. Biz genetik bileşen bağımlılığı düzenlediğini dahil tanımlamak için birden çok tarafsız gen ifade analizler yapılır. Bu analizler üç genler, c-Fos, Dusp1 ve Zfp36, oncogenic hayatta kalmak için sinyal üzerinde bağımlı değildir ve böylece, TKI tedavi için büyük küçük harf duyarlı olan kanser hücrelerini upr...

Tartışmalar

Kanser hücreleri toplu için TKI tedavi yanıtı Tirozin kinaz oncoprotein sinyalleri tümör bağımlısı olduğu bir abluka tarafından aracılık ettiği. Ancak, nispeten az hakkında nasıl bir azınlık MRD için katkıda bulunan kanser hücrelerinin kaçış onkogen bağımlılığı ve tedavisi⁴bilinir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda büyüme faktörü sinyal ilaç direnci lösemi ve solid organ tümörler aracılık eder saptandı. Bu çeşitli moleküler mekanizmaları iç diren...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological Materials
RPMI	Cellgro (corning)	15-040-CV
DMEM	Cellgro (corning)	15-013-CV
IMDM	Cellgro (corning)	15-016-CVR
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment	Takara	T100B
MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU)	Stem Cell	3434
MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU)	Stem Cell	4434
4-Hydroxytamoxifen	Sigma	H6278
Recombinant Murine SCF	Prospec	CYT-275
Recombinant Murine Flt3-Ligand	Prospec	CYT-340
Recombinant Murine IL-6	Prospec	CYT-350
Recombinant Murine IL-7	Peprotech	217-17
DFC	LKT Laboratories Inc.	D3420
BCI	Chemzon Scientific	NZ-06-195
Imatinib	LC Laboratory	I-5508
Curcumin	Sigma	458-37-7
NDGA	Sigma	500-38-9
Penn/Strep	Cellgro (corning)	30-002-CI
FBS	Atlanta biological	S11150
Trypsin EDTA 1x	Cellgro (corning)	25-052-CI
1x PBS	Cellgro (corning)	21-040-CV
L-Glutamine	Cellgro (corning)	25-005-CL	5 mg/mL stock in water
Puromycin	Gibco (life technologies)	A11138-03
HEPES	Sigma	H7006
Na2HPO4.7H2O	Sigma	S9390
Protamine sulfate	Sigma	P3369	5 mg/mL stock in water
Trypan Blue solution (0.4%)	Sigma	T8154
DMSO	Cellgro (corning)	25-950-CQC
WST-1	Roche	11644807001
0.45 μM acro disc filter	PALL	2016-10
70 μm nylon cell stariner	Becton Dickinson	352350
FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose)	Simga	1083
PBS	Corning	21040CV
LS Columns	Miltenyi	130-042-401
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	CO-RO
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma	P5762
Nitrocullulose Membrane	Bio-Rad	1620115
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)	Thermo Scientific	34075
CD5	eBioscience	13-0051-82
CD11b	eBioscience	13-0112-75
CD45R (B220)	BD biosciences	553092
CD45.1-FITC	eBioscience	11-0453-85
CD45.2-PE	eBioscience	12-0454-83
hCD45-FITC	BD Biosciences	555482
Anti-Biotin-FITC	Miltenyi	130-090-857
Anti-7-4	eBioscience	MA5-16539
Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)	eBioscience	13-5931-82
Anti-Ter-119	eBioscience	13-5921-75
Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7	BD	558612
CD117 APC	BD	553356
BD Pharm Lyse	BD	555899
BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution)	BD	554714
BD Perm/Wash  (permeabilization and wash solution for phospho flow)	BD	554723
phospho p38	Cell Signaling Technologies	4511S
total p38	Cell Signaling Technologies	9212
Mouse IgG control	BD	554121
Alexa Flour 488 conjugated	Invitrogen	A-11034
Calcium Chloride	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	Ambion	AM9261
BSA	Sigma	A7906
Blood Capillary Tubes	Fisher	22-260-950
Blood Collection Tube	Giene Bio-One	450480
Newborn Calf Serum	Atlanta biological	S11295
Erythropoiein	Amgen	5513-267-10
human SCF	Prospec	CYT-255
Human IL-3	Prospec	CYT-210
G-SCF	Prospec	CYT-220
GM-CSF	Prospec	CYT-221
MyeloCult (media for LTCIC assay)	Stem Cell Technologies	5100
Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate	Stem Cell Technologies	7904
MEM alpha	Gibco	12561-056
1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2	Becton Dickinson	329461
Mortor pestle	Coor tek	60316 and 60317
Isoflorane (Isothesia TM)	Butler Schien	29405
SOC	New England Biolabs	B90920s
Ampicillin	Sigma	A0166	100 mg/mL stock in water
Bacto agar (agar)	Difco	214050
Terrific broth	Becton Dickinson	243820
Agarose	Genemate	E-3119-500
Doxycycline chow	TestDiet.com	52662	modified RMH1500, Autoclavable 5LK8  with 0.0625% Doxycycline
Tamoxifen	Sigma	T5648
Iodonitrotetrazolium chloride	Sigma	I10406
Kits
Dneasy Blood & tissue kit	Qiagen	69506
GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye)	Promega	M1722
miRNeasy Mini Kit  (RNA isolation kit)	Qiagen	217084
DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR)	Ambion, Life Technologies	AM1906
Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis)	Invitrogen	18080051
SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR)	Bio-Rad	1725270
CD117 MicroBead Kit	Miltenyi	130-091-224
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay	Stemp Cell Technologies
Instruments
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator	Thermo scientific
Swing bucket rotor cetrifuge 5810R	Eppendorf
TC-10 automated cell counter	Bio-RAD
C-1000 Thermal cycler	Bio-RAD
Mastercycler Real Plex 2	Eppendorf
ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots)	Bio-RAD	17001401
Hemavet (boold counter)	Drew-Scientific
LSR II (FACS analyzer)	BD
Fortessa I (FACS analyzer)	BD
FACSAriaII (FACS Sorter)	BD
Magnet Stand	Miltenyi
Irradiator	J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA	Mark I Model 68A	source Cs 137
Mice
ROSACreERT2	Jackson Laboratory
Scl-tTA	Dr. Claudia Huettner’s lab
BoyJ	mouse core facility at CCHMC
C57Bl/6	Jackson Laboratory
NSGS	mouse core facility at CCHMC
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-	Made in house
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	Made in house
Cells
BaF3	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
WEHI	Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston
CML-CD34+ and Normal CD34+ cells	University Hospital, University of Cincinnati