Düşük yoğunluklu nötrofil tarafından oluşturulan nötrofil hücre dışı tuzakları Peritoneal lavaj sıvı aracılık tümör hücre büyümesini ve eki elde

Özet

Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.

Özet

Hangi yakalayabilir ve mikroplar yok nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), aktif. Son yıllarda yapılan çalışmalarda NETs, otoimmün hastalığı, kan pıhtılaşması ve tümör Metastazlari gibi çeşitli hastalık süreçlerini katılmaktadırlar öneririz. İşte, bindirme ağları için ek sonra büyümek ücretsiz tümör hücrelerinin sırasında NET faaliyet algılamak için detaylı vitro tekniği göstermektedir. İlk olarak, biz düşük yoğunluklu nötrofil (LDN) laparotomies yapılan hastaların postoperatif peritoneal lavaj sıvı toplanan. Kısa vadeli LDN kültür yeşil floresan nükleer ve kromozom counterstain ile görüntülenmiştir büyük NET oluşumu sonuçlandı. Sonra eş kuluçka insan mide kanseri hücre hatların MKN45, OCUM-1 NUGC-4 ağları ile birçok tümör hücreleri ağlar tarafından kapana kısıldın. Daha sonra ek tamamen DNaz ı. Time-lapse video ağları tarafından tuzağa tümör hücreleri ölmek ortaya ağlar bozulması tarafından kaldırıldı ama bunun yerine şiddetle sürekli bir kültürde büyüdüm. Bu yöntemler ağlar ve hücreleri ve materyaller çeşitli yapışkanlı Hofstede tespiti için uygulanabilir.

Giriş

Polimorf nükleer nötrofiller kan dolaşan içinde genelde yoğunluk gradient hazırlama yöntemi mononükleer hücreler ayrılır. Ancak, bazı nötrofil düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), CD11b(+), CD15(+), CD16(+) ve CD14(-) fenotipleri ile bilinen mononükleer hücreler ile birlikte saf. LDN göreli sayısı otoimmün hastalıklar^1,2, sepsis³ve kanser^4,5de dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullarında önemli ölçüde artırır. Önceki çalışmalarda LDN nötrofil⁶phenotypically ve işlevsel olarak ayrı bir sınıf olduğunu göstermiştir. Bu unutulmamalıdır ki kan dolaşan içinde LDN nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) normal yoğunluk nötrofil^2,7' den üretmek olasılığı vardır. Ağlar nükleik asitler, histon, proteaz ve taneli ve sitozolik protein oluşan web benzeri yapılar, ve verimli bir şekilde tuzağa ve patojenler⁸yok.

Son zamanlarda, NETs sadece mikroplar, ama aynı zamanda trombosit ve dolaşan trombus olgusu oluşumu⁹ ve tümör Metastazlari^10,11' yardımcı olabilir tümör hücreleri yakalamak için gösterilmiştir. Ancak, ağlar ve trombosit veya tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler arkasında moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, bir vitro yapışma tahlil myeloid lösemi hücreleri (K562¹²) ve Akciğer Karsinomu Hücre (A549¹³) ağlar için β1 ve β3 integrinler yolu ile atamanız da ortaya koydu. Yazarlar nötrofil izole ve phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olarak yapışma substrat¹⁴tarafından aktive NET stok kullanılır. Bu tahlil NET bileşenleri ile gerçek etkileşim tespiti nötrofil yokluğunda sağlar, "hücre-ücretsiz NET hisse senedi" ile yüksek hızlı Santrifüjü izole moleküler yapısı içinde üretilen Nets aynı olup olmadığı korur tartışılabilir olsa da Vivo. Son zamanlarda, sonra karın ameliyatı büyük ağlar oluşturulan ve periton Metastazlari¹⁵neden tümör hücrelere bağlı olan birçok olgun LDN bulunan peritoneal lavaj sıvıyı bulduk. Bu çalışmada, başarılı bir şekilde herhangi bir fiziksel manipülasyon olmadan sağlam Nets tümör hücrelerinin yapışma inceledi. İşte, ağlar ve ücretsiz tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler algılamak için bir teknik ayrıntılarını göstermektedir.

Protokol

LDN Bu çalışmada kayıtlı hastalardan elde edilmiştir ve kurumsal İnceleme Kurulu, Jichi tıbbi üniversite tarafından kabul edildi.

1. yalıtım LDN karın boşluğu Lavages ve NET algılama

1. Örnek alma
   1. 1000 mL normal steril serum doğrudan gastrointestinal malignite nedeniyle karın ameliyatı geçiren hastalarda yara kapatma önce karın boşluğu içine süzülür.
      Not: Örnekleri gastrektomi, kolektomi veya yaşında yaş veya cinsiyet dayalı önyargı olmadan yapılan hastalarda elde edilmiştir. Serum fizyolojik bir konteyner içine transfer ve bir dakika içinde tüm karın dökülür. Bu rutin bir ameliyat sonrası periton yıkama hasta üzerinde önemli etkisi olmadan olarak gerçekleştirilir.
   2. Lavaj en az 1 dk. için kapsamlı bir şekilde karın boşluğu.
      Not: Bu örnekleri tek tip olması infüzyon sıvı yavaş yavaş cerrahın elleri ile karıştırılır tavsiye edilir.
   3. Lavaj sıvı dört 50 mL şırınga ile 200 mL kurtarmak.
      Not: Bazen bir lastik bağlayıcı sıvılar çekmek için kullanılır.
2. Arıtma periton LDN granülosit belirli mAb, CD66b¹⁶kullanarak gerçekleştirin.
   Not: yoğunluk gradient Santrifüjü sonra ara katman birçok mononükleer hücreler içerdiğinden, polimorf nötrofil CD66b mAb kullanma olumlu seçimi gerçekleştirildi.
   1. Peritoneal lavaj sıvı bir 50 mL tüp aktarın.
      Not: Bu adımda, sıvılar kirleri çıkarmak için bir 100 µm naylon filtreden geçmek.
   2. 270 x g 7 dk RT. az için peritoneal sıvı santrifüj kapasitesi
   3. Granül PBS %0.02 EDTA ile 5 ml resuspend.
   4. Dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon 3 mL yoğunluk gradient çözüm üzerinde 5 mL yerleşimi.
   5. 1.700 x g RT, 15dk sınırlarında olmadan için santrifüj kapasitesi.
   6. Bir pipet kullanarak ara Katmanlar (Şekil 1A) içeren çözüm ~ 2-3 mL hasat ve PBS %0.02 EDTA ile 10 mL ile karıştırın.
   7. RT, 7 dk 400 x g, peritoneal sıvı santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
   8. PBS %0.02 EDTA ve santrifüj ile başka bir 10 mL 270 x g RT. atma süpernatant 7 dakika için ekleyin.
   9. Hücre Pelet (1 x 10⁷) arabelleği için manyetik hücre ayrılık teçhizat 60 µL geçiyoruz.
   10. Fc blok 20 µL için granül ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
   11. Anti-CD66b 20 µL lastikteki ile Birleşik ve ek bir 10 min 4 ° C'de için kuluçkaya ekleyin
   12. Yıkama ve granül MAC'ler arabellek 500 µL içinde yeniden askıya alma.
   13. Hücre süspansiyon uygun manyetik ayırıcı manyetik alan manyetik bir sütun için geçerli ve sütun arabellek 15 mL ile yıkayarak akışı aracılığıyla içeren CD66b(-) hücreleri toplamak.
   14. Sütun manyetik ayırıcıyı kaldırmak ve hemen sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik olarak etiketli CD66b(+) hücreleri floş.
       Not: CD66b(+) hücre nüfus çoğunlukla nötrofil gösteren FACS analiz tarafından belirlenen oluşur > CD66(+) kesir % 95'i CD11b, CD15 ve CD16 olumlu ama CD14 için negatif.
3. Nesil ağlar
   1. 270 x g RT, 7 dk de aralıklarla sonra izole LDN yeniden askıya alma (5 x 10⁶) RPMI1640% 10 FCS ile 1 ml.
   2. LDN tabakta 6-şey poli-L-lizin kaplı (6 cm çapında) %5 CO₂37 ˚C 2 h için kültür.
   3. Yeşil flüoresan counterstain (çekirdek ve kromozomlar leke geçirmez membran bir boya) 5 mikron son konsantrasyonu ekleyin.
   4. Hemen ağlar (LDN floresans mikroskobu altında ihraç ekstraselüler DNA bileşenleri) morfoloji gözlemlemek.

2. tümör hücreleri kırmızı floresan hücre bağlayıcı boya boyama

1. İnsan kanser hücre hatları MKN45, NUGC ve OCUM-1 hazırlayın.
2. 1 x 10⁷ hücreleri PBS + 15 mL tüp ve 270 x g, santrifüj RT. 7 min için %0,02 EDTA ile yıkayın
3. Çözüm için granül boyama boya için 1 mL ekleyin ve hafifçe pipet.
4. Kırmızı floresan hücre bağlayıcı boya boyama için çözüm 1 ml 4 µL dağıtılması ve hücre süspansiyon adım 2.2 ile karıştırın.
5. Granül RT., 4 dk için kuluçkaya
6. DMEM 4 mL ekleyin (% 10 FBS) boyama reaksiyonu durdurmak için.
7. 270 x g 7 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
8. 2.6 ve 2.7 adımları iki kez tekrarlayın.
9. Kontrol floresan mikroskop (uyarma 551 = nm, yayan 567 = nm) tümör hücreleri kırmızı lekeli.

3. tümör hücre adezyon Nets Analizi

1. RPMI % 0.1 BSA ile desteklenmiş 1640 1 ml kırmızı floresan lekeli tümör hücreleri (1 x 10⁶) yeniden askıya alma.
2. 1.3. adımda açıklandığı gibi ağlar üretilen LDN kültür tümör hücreleri ekleyin.
3. NETs başvurmanız tümör hücreleri sağlar 37 ˚C, 5 min için kuluçkaya.
   Not: Uzun bir kuluçka tümör hücre adezyon LDN veya plakaları neden olmaktadır.
4. Orta kaldır ve yavaşça kuyuları prewarmed medya (% 0,1 BSA + RPMI 1640) 2 mL ekleme ve çanak dönen yıkayın.
5. Adım 3.4 çamaşır yordamda iki kez tekrarlayın.
   Not: Beri ağları zayıf plakasına eklemek, çamaşır temizleme ağlarının kendilerini önlemek için mümkün olduğunca yavaşça yapılmalıdır.
6. Çekirdeği ve kromozom 5 µg/mL NETs görselleştirme için son bir konsantrasyon, boyama için yeşil flüoresan boya ekleyin.
7. NETs gözlemlemek ve tümör hücreleri uygun filtreleri kullanarak bağlı (yeşil, uyarma 504 = nm, yayan 523 = nm; kırmızı, uyarma 551 = nm, yayan 567 = nm).
8. Ağlar tarafından tuzağa tümör hücreleri göstermek için rakamlar birleştirme.
   Not: Bazı deneylerde DNA bozulması enzim 5 dk önce 5 min için ortak kuluçka LDN Kültür (son konsantrasyon 100 U/mL) eklenmiştir.

4. zaman atlamalı Video analiz kapana kısılmış tümör hücrelerinin

1. Kültür bir 35 mm periton LDN çanak poli-L-lizin 1.3 adımda anlatıldığı gibi ile kaplı yuvarlak.
2. Çekirdeği ve kromozomlar 1.3 adımda anlatıldığı gibi ağlar görselleştirmek için boyama için yeşil flüoresan boya ekleyin.
3. 1 dk, kuluçka sonra medyayı çıkarın ve 2 mL % 0,1 BSA + RPMI 1640 ekleyin.
4. Medyayı çıkarın ve günahı 1 x 10⁶ MKN45 hücreleri % 0,1 askıya BSA + RPMI 1640 ekleyin. Dik, 5 min için kuluçkaya
5. 3.4. adımda açıklandığı gibi yavaşça yıkayarak herhangi bir bekâr tümör hücreleri kaldırın ve DMEM 100 u/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile % 10 FCS ile ekleyin.
6. Kültür çanak bir bütün-görünümü hücresi gözlem sistemi monte ve hangi tümör hücreleri ağlar tarafından tuzak vardır uygun alanı seçin.
7. Bir ek 2 gün ortak kültür ve her 6 dk normal ışık ve MKN45 hücreleri ve ağlar, sırasıyla algılar floresans altında alanın sürekli fotoğraf çekmek devam edin.
8. Görüntüleri her timepoint, üst üste ve hızlandırılmış videoları Image Viewer yazılımı kullanarak oluşturur.

Sonuçlar

2 saatlik kültüründe CD66b(+) peritoneal lavaj sıvı gösterdi dize yapılardan türetilmiş LDN lekeli yeşil-floresan boya için nükleer ve kromozom (Şekil 1B), mononükleer hücreler vermedi CD66b(-) ise (Şekil 1 c). LDN kültürleri ile ön işleme Ancak, 100 U/mL DNaz olduğumu karakteristik yapısı (Şekil 1 d), yok ekstraselüler DNA nötrofil ihraç oluşan olduklarını gösteren. LD...

Tartışmalar

Önceki çalışmalarda tümör hücreleri dolaşan NET yüzeylerde vivo içinde^10,11tarafından kapana olduğunu bildirdi. Metastatik meme kanseri hücrelerinin nötrofil uyarmak ve hangi tümör hücre büyümesini hedef organ¹⁷yardımcı olur ağlar, oluşumu teşvik gösterilmiştir. Buna ek olarak, biz kısa vadeli kültürleri LDN ameliyat sonrası lavaj sıvı üzerinden verimli bir şekilde tümör hücreleri daha fazla st...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-104-913
Fc block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-059-901
MACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-091-376
LS Columns	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-041-306
MACS Magnetic Separator	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany	130-042-501
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9691
Diluent C	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	CGLDIL
RPMI1640 Medium	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	D8537
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	gibco by life technologies, Mexico	10437-028
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylactic	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
fluorescein stereomicroscope	BX8000, Keyence, Osaka Japan	BZ-X710
Whole view cell observation system	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 human gastric cancer cell line	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 human gastric cancer cell line	Osaka City University, Japan	N/A	Gift from Dr. M.Yashiro