Adipo-Clear: Bir doku Yöntem yağ dokusu üç boyutlu görüntüleme için temizlenmesi

Özet

Yüksek lipid içeriği nedeniyle yağ dokusu geleneksel histolojik yöntemlerle görselleştirmek için zor oldu. Adipo-temiz sağlam etiketleme ve yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel floresan görüntüleme sağlayan tekniği temizleyerek bir dokudur. Burada, numune hazırlama, ön, boyama, takas ve montaj için görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır.

Özet

Yağ dokusu enerji homeostazı ve termoregülasyon merkezi bir rol oynar. Adipositler, hem de adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, kan damarları ve sinir projeksiyonlar farklı türde oluşur. Her ne kadar hücre türü belirtimi moleküler kontrolü ve bu hücreler arasındaki etkileşimle giderek tarif, bu yağ yerleşik hücreler daha kapsamlı bir anlayış, kendi dağıtım ve mimari görselleştirme tarafından elde edilebilir Bütün doku. Adipose Histoloji analiz etmek için varolan immünhistokimya ve ayirt yaklaşımlar üzerinde ince parafin gömülü kısımlar dayanmaktadır. Ancak, ince kesitler doku yalnızca küçük bir bölümünü yakalamak; Sonuç olarak, sonuçları doku hangi bölümünü analiz tarafından önyargılı. Bu nedenle teknik, moleküler ve hücresel kalıplarının kapsamlı üç boyutlu görselleştirme içinde tüm yağ doku izin vermek için Adipo-temiz, takas bir yağ dokusu geliştirdik. Adipo-net iDISCO adapte / iDISCO +, belirli değişiklikler ile yapılan için tamamen doğal doku morfoloji koruyarak doku içinde depolanan lipid kaldırmak. Işık sayfalık floresans mikroskobu ile birlikte, biz burada tüm bir yağ dokusu yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüler elde etmek için Adipo-Clear yöntemi kullanımını göstermektedir.

Giriş

Yakın zamana kadar yağ dokusu ve yağ hücrelerinin amorf bir topluluğu olarak tasarlandı. Son birkaç on yıl içinde anladığımız kadarıyla şimdi farklı türde adiposit yanı sıra adipocyte öncüleri, bağışıklık hücreleri, fibroblastlar, damarlara ve sinir projeksiyonlar içeren karmaşık bir organ olduğu kabul yağ ile daha sofistike büyüdü. Bu yağ yerleşik hücreler arasındaki etkileşimler yağ dokusu ve organizma fizyolojisi ve patofizyolojisi¹etkileri belirgin. Her ne kadar ortaya çıkan çalışmalar bazı etkileşimler yatan önemli moleküler mekanizmaları sökülmüş, daha kapsamlı bir anlayış tüm doku üç boyutlu (3D) güvenilir yapısal profilleme gerektirir.

Geçerli bilgimizi yağ dokusu morfolojisi histolojik Analize ince kesitler (5 mikron) nispeten yüksek büyütme görüntüleme (daha--dan 10 X) ile büyük ölçüde dayalı^2,3. Ancak, bu yaklaşım bazı önemli sınırlamaları vardır. İlk, karmaşık ipliksi yapılar adipose işlev^4,5,6,7' önemli roller oynamak için bilinir, sempatik sinirler ve damarlara gibi değerlendirmek zordur ince kesitler. İkinci olarak, görünüşte amorf şeklini ve odaklanmak için temsilcisi yapısal birim eksikliği nedeniyle, yalnızca bölüm boyama temel yağ dokusu yapıları takdir etmek zordur. Üçüncü olarak, yağ dokusu 3D anatomik imar, tüm beyin morfoloji⁸çalışma için kullanılan geleneksel bir yöntem için uygun tutarlı seri bölümler elde etmek zorluklar oluşturma bir çok yüksek lipid içeriğe sahiptir. Bu faktörler göz önüne alındığında, hala hücresel çözünürlük elde ederken tüm yağ depo 3D görselleştirme sağlayabilir bir bütün-mount yaklaşım için büyük bir ihtiyaç var.

3D hacimsel görüntüleme tüm bir organ ışık saçılım belirsiz etkileri nedeniyle meydan okuyor. Biyolojik dokuların içinde ışık saçılım önemli bir kaynağı lipid sulu arabirimlerden geliyor. Çabaları dağılım lipidler kaldırarak ortadan kaldırmak için bir yüzyıl boyunca devam edecek olmasına rağmen çok sayıda son yenilikleri⁹olmuştur. Bir tür yeni geliştirilen doku Temizleme immunolabeling etkin 3D görüntüleme solvent seçilmemiş organların yöntemidir (iDISCO / iDISCO +)^10,11. Ancak, yağ dokusu lipidler, onun yüksek düzeyde verilen belirli bir meydan okuma sunuyor ve bu nedenle, iDISCO ek değişiklikler / iDISCO + Protokolü tamamen çöken gelen doku koruyarak lipidler ayıklamak için gereklidir. Geliştirdiğimiz, şimdi Adipo-temiz, adı değiştirilmiş Protokolü metanol/diklorometan tabanlı delipidation yağ dokusunun en iyi şeffaflık yüksek çözünürlüklü hacimsel görüntüleme¹²için uygun elde etmek için kullanır. Çünkü büyük ölçüde endogenously ifade quenches floresan proteinler GFP ve RFP gibi delipidation adım, görselleştirme gibi proteinlerin immunolabeling tarafından sağlanmalıdır. Genel olarak, bu basit ve sağlam iletişim kuralı yağ yerleşik hücre, doku düzeyinde organizasyon eğitim için uygulanabilir adipocyte progenitör hücrelerin ve yağ morfogenez soy izleme geliştirme sırasında.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvan bakımı ve deney hayvan Kurulusları ve Rockefeller Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yordamlara göre yapıldı.

1. doku hazırlık

1. Kan tamamen dokudan kaldırılana kadar standart intrakardiyak perfüzyon ile ~ 20 mL 1 x 4 ° C'de fosfat tamponlu tuz (PBS) gerçekleştirin.
2. Boyun ve kuyruk önemli ölçüde kasıldı kadar perfusate ~ 20 mL sabitleştirici çözeltisi (% 4 paraformaldehyde (PFA) 1 x PBS içinde) 4 ° C'de geçin.
   Dikkat: PFA zehirlidir. Cilt, göz ve müköz membran ile temasından sakının. Çözümleri bir duman başlık içinde yapılmalıdır.
3. Dikkatli bir şekilde zarar vermeden tüm yağ yastığı çıkarın ilgi yağ yastıkları incelemek. Künt uçlu forseps pinching veya doku sıkma önlemek için kullanın. Herhangi bir kürk ile disseke doku bulaşıcı kaçının.
4. Dokuya %4 1 x PBS PFA gecede 4 ° C'de sonrası fix Her yağ yastığı, ~ 10 mL fiksasyon çözeltisi 15 mL konik tüp ile sonrası düzeltme için.
5. Doku oda sıcaklığında (RT) 3 kez (1 h her) 1 x PBS ile yıkayın.
6. Kısa süreli (en fazla 2 hafta) için doku 1 x PBS 4 ° C'de depolayın ve ışıktan korunan. (Örneğin, 1-2 yıl) uzun süreli depolama için arabellek 1 x PBS ile % 0.05 sodyum azid (koruyucu olarak) geçiş yapar.
   Dikkat: Sodyum azid sözlü olarak yutulur veya deri yoluyla emilir çok zehirli. Sodyum azid çözümleri (% 5 ya da daha fazla) bir duman başlık altında ele alınmalıdır yoğunlaşmıştır.

2. Delipidation ve Permeabilization

Zamanlama: 1-2 gün

1. % 20, % 40, % 60 ve % 80 metanol degradeyle B1n arabellek (Tablo 1) (v/v), Örneğin, % 20 metanol/B1n arabelleği için hazırlamak, mix 20 mL metanol ve B1n arabelleği 80 mL. Tüm arabellekleri 4 ° C'de depolayın Glisin kristalleri doygunluk nedeniyle % 60 ve % 80 metanol/B1n arabellekleri çökelti. Kristalleri kaldırma kaçının; sıvı çözüm için aşağıdaki yıkar kullanın.
   Dikkat: Metanol uçucu, tahriş edici ve yanıcı. Cilt ve göz temasından kaçının.
2. Yavaşça saç örnek bir diseksiyon mikroskop altında kaldırın. Herhangi bir saç, tüysüz veya örneğe bağlı enkaz gölgeler görüntüleme sırasında neden olur. Temizlenmiş örnek yeni bir tüp içine aktarın.
3. Aksi belirtilmedikçe buz veya 4 ° C'de tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Küçük örnekleri için (Örneğin, posterior subkutan/perigonadal yağ yastıkları genç yalın fareler üzerinden), 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri ya da yüksek lipid içerikli (Örneğin, obez farelerin gelen yağ yastıkları) örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın.
   1. Yatay olarak ayarlanan bir orbital çalkalayıcı üzerinde örnekleri içeren tüpler yer ~ 100 rpm. Örnekleri tüp içinde özgürce hareket edebilirsiniz emin olun.
4. % 20, % 40, %60, % 80 ve % 100 metanol/B1n arabellek kademeli bir dizi örnek belirtilen süre (Tablo 2) kurutmak. Etkilenmişimdir çözüm en aza indirmek.
5. Delipidate ile % 100 diklorometan (DCM) örnek (3 kez), her kuluçka süresi ile Tablo 2' de belirtti. Örnek ikinci ve üçüncü DCM yıkar, sonundaki tüp altına lavabo. Aksi takdirde, tam delipidation emin olmak için kuluçka süresini uzatmak (Örneğin, 1-2 h 30 dk genişletmek).
   Dikkat: DCM duman çuval içinde ele alınmalıdır. Polipropilen incubations için yapılmış depolama ve microcentrifuge tüpler için cam kaplar kullanın. Microcentrifuge tüpler DCM uzun süreli depolama için kullanılmamalıdır. Petri yemekler ve polistiren yapılan serolojik pipetler DCM ile uyumlu değildir. DCM çok kırılgandır. Örnek hızlı kuruma önlemek için taze çözüm aktarın.
6. İki kere % 100 metanol ile belirtilen süre (Tablo 2) yıkayın.
7. İsteğe bağlı: örnek iyi perfused değilse, kalan kırmızı kan hücreleri hemoglobin rengini güçlü autofluorescence neden olabilir. Metanol (metanol, 5 cilt için % 30 H₂O₂ 1 birim) içinde % 5 H₂O₂ ile gecede 4 ° C'de çamaşır suyu.
8. Örnek bir ters metanol/B1n arabellek dizi rehydrate: %80, % 60, %40, % 20 metanol/B1n ve %100 B1n (2 kez) belirtilen süre (Tablo 2) arabellek.
9. PTxwH arabellek (Tablo 1) için 2 h ile örnek RT. yıkama
10. Delipidated örnek PTxwH arabellek 4 ° c (en fazla 1 yıl) depolamak veya hemen immunostaining adıma geçin.

3. bütün Dağı Immunostaining

Zamanlama: 8-10 gün

Not: Aşağıdaki adımların tümünü RT aksi, sallayarak ve ışık koruma ile belirtilmediği sürece yapılmalıdır. Küçük örnekleri için 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın. Bu ilk küçük parçalar halinde dokusu veya doku metanol tedavi bölümleri üzerinde antikorlar doğrulamak için tavsiye edilir.

1. Önerilen konsantrasyonu PTxwH arabellekte birincil antikor sulandırmak. ~ 20.000 x g tanıtımı antikor precipitates veya toplamalardan önlemek 10 dk de seyreltilmiş antikor çözüm santrifüj kapasitesi.
2. Delipidated örnek birincil antikor çözüm ile belirtilen süre (Tablo 2) için kuluçkaya.
3. PTxwH arabellek ile örnek bir dizi kuluçka adımı yıkama: 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 1 h, 2 h, 4 h ve geceleme.
4. Önerilen konsantrasyonu PTxwH arabellekte ikincil antikor sulandırmak. ~ 20.000 x g tanıtımı antikor precipitates veya toplamalardan önlemek 10 dk de seyreltilmiş antikor çözüm santrifüj kapasitesi.
   Not: kırmızı ve far-red bölgelerinde ışık yayarlar fluorophores ile Birleşik ikincil antikorları yüksek arka plan doku autofluorescence tarafından neden önlemek için tavsiye edilir. Lazer bir mikroskobunun kullanılabilir hatları sayısına bağlı olarak en çok 3-4 işaretleri aynı anda bir örnek yansıma.
5. Örnek ikincil antikor çözüm ile belirtilen süre (Tablo 2) için kuluçkaya.
6. PTxwH arabellek kuluçka adımları bir dizi ile yıkama örnek: 5 dk, 10 dk, 15 dk, 20 dk, 1 h, 2 h, 4 h ve geceleme.
7. İsteğe bağlı: kırılgan doku türleri için %4 1 x PBS PFA gecede 4 ° C doku morfoloji korumaya yardımcı olmak ile lekeli doku düzeltmek.
   Not: Bu adım görüntüleme arka plan artabilir. Yağ dokusu için bu adımı gerçekleştirmek gerekli değildir.
8. 1 x PBS ile örnek bir dizi kuluçka adımı yıkama: 5 dk, 10 min ve 30 dak.
9. Yavaşça tüysüz bir diseksiyon mikroskop altında örnek kaldırın.

4. doku takas

Zamanlama: 1-2 gün

1. İsteğe bağlı: örnek örnek montaj ışık sayfalık Mikroskopi için kolaylaştırmak için özel katıştırın.
   Not: Bu adımı sırasında görüntüleme şeklini dengelemeye yağ dokusu için önemle önerilir.
   1. 1 x PBS (w/v) % 1'özel gömme çözümle hazırlayın. Gömme çözümü cool ~ 40 ° C arasında aşırı sıcağa örnek kullanılmasını önlemek için.
   2. Temizlenmiş örnek (Örneğin, Petri kabına veya tekne tartı) bir kalıp yerleştirin ve istediğiniz pozisyona düzenlemek. Herhangi bir sıvı ertelenmiş kaçının. Yavaşça gömme çözüm örnek dökün. Herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
   3. Tam olarak örnek içeren bir bloğun RT. keser kuvvetlendirmek özel izin.
      Not: Tüm gece incubations de dahil olmak üzere aşağıdaki adımları RT, sallayarak ve ışık koruma ile yapılmalıdır. Küçük örnekleri için 2 mL microcentrifuge Tüpler 1.6 mL çözeltisi ile kullanın. Büyük örnekleri için 5 mL tüpler 4 mL çözeltisi ile kullanın.
2. Metanol gradient H₂O: % 25, % 50, % 75 ve % 100 (3 kere) örnekte belirtilen süre (Tablo 2) kurutmak.
   Not: Örnek gecede %100 metanol adımda bırakılabilir.
3. % 100 DCM (3 kere) sallayarak ile 1 h için örnekte kuluçkaya. Örnek tüp her DCM yıkama sonunda altına lavabo. Eğer değilse, metanol tam kaldırılmasını sağlamak için kuluçka süresini uzatmak. Örnek bir gecede %100 DCM adımda bırakılabilir.
4. Örnek dibenzyl eter (DBE) gecede kırılma indisi eşleştirme elde etmek için hafif sallayarak ile kuluçkaya.
   Not: Örnek sonunda görünür ışık şeffaf olacak.
   Dikkat: DBE zararlıdır. Herhangi bir cilt ile temasından sakının. Çift katmanlı eldiven ile duman örtünün içinde hallederim. En kısa zamanda DBE ile kontamine eldiven atma. Cam kaplar için depolama ve microcentrifuge tüpler (Polipropilen) incubations için kullanın. Microcentrifuge tüpler DBE uzun süreli depolama için kullanılmamalıdır. Petri yemekler ve polistiren yapılan serolojik pipetler DBE ile uyumlu değildir. Temiz bir % 100 etanol ile bile ziyan.
5. Taze ete ile örnek 2 h. deposu için örneği RT'karanlıkta sallayarak hafif kuluçkaya veya doğrudan görüntüleme için devam edin.
   Not: Örnekleri bir ay içinde yansıması için tavsiye edilir. Bazı fluorophores diğerlerinden daha kararlıdır olmakla birlikte, bu aşamada örnekleri uzun süreli depolama tavsiye edilmez.

5. mikroskobu

1. DBE ile uyumlu olan ışık sayfalık mikroskop ile görüntüleme.
   Not: organik solvent bazlı görüntüleme için onaylanmış ve DBE kırılma indisi ile eşleşen tek amaçları hedefleri DBE dalmış görüntülemede daldırma olarak kullanılabilir.
   1. Görüntüleme sırasında hareketi engelleyen bir tutucu üzerine özel katıştırılmış örnek bağlayın. Örnek DBE dolu bir odaya sokmak.
   2. Bir z-yığın (Örneğin, 1-2 X büyütme) Bütün doku dağıtım/yapısı işaretin ilgi elde etmek için tüm örnek kapsayan toplamak.
   3. Bir amaç (Örneğin, 4-12 X büyütme) faiz detaylı yapıları görüntü bölgelerinde yakınlaştırmak için daha yüksek büyütme ile geçin.
      Not: Kollajen tüm yağ hücrelerinin¹³çevreleyen yağ dokusu hücre dışı matriks için büyük bir katkıda bulunuyor. Kolajen vardır yaklaşık 400 arasında değişen bir tipik emisyon spektrum nm 550 nm¹⁴. Örnek (yeşil) 488 lazer çizgi ile görüntüleme ve kollajen (Örneğin, 525-550 nm) emisyon spektrum içinde yatıyor bir dalga boyu aralığı verilmiş ışık toplama için daha önce gösterilen doku autofluorescence sinyal sağlayacak yağ hücre kontur ve genel doku mimari¹²betimlemek.
2. Bir ters confocal görüntüleme veya iki fotonlu mikroskop.
   1. Özel katıştırılmış örnek cam alt odası slaytla herhangi bir plastik parçalar (veya mühürleyebilirsiniz diğer DBE uyumlu görüntüleme odası) dokunmadan yerleştirin. DBE kaçak değil emin olun.
   2. Objektif ile daha derin nüfuz elde etmek için daha uzun çalışma mesafeler seçin.
      Not: Görüntüleme odası slayt cam alt aracılığıyla ters bir confocal veya iki fotonlu mikroskop ile yapılmalıdır. Örnek ve daldırma DBE tabanlı görüntüleme için önerilen değil hedefleri arasında doğrudan temastan kaçının.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Adipo-Clear tüm Yağ yastıkları 3D doku Morfoloji ve hücresel etkileşimlerin yalın ve obez Amerika'da nasıl etkilendiğini analiz etmek için yansıma hazırladı. Bu yöntem doku autofluorescence sinyal yeşil kanal toplayarak genel yağ yapısı analiz etmek için kolayca uygulanabilir. Biz daha önce autofluorescence göstermiştir sinyal olumlu perilipin boyama, Olgun adiposit¹²anahat için yaygın olarak kullanılan bir marker ile yağ bindirmeleri. Ör...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Adipo-temiz yağ dokusu, normal laboratuar kurulumunda kolayca gerçekleştirilebilir temizlenmesi için bir basit ve sağlam yöntemdir. İDISCO gibi diğer solvent bazlı temizleme yöntemleri ile karşılaştırıldığında / iDISCO +^10,11,12, Adipo-Clear özellikle yağ dokusu ve diğer doku yüksek yağ içeriği ile temizlenmesi için optimize edilmiştir. Delipidation adım lipitler yağ tamamen kaldırır ve bu nedenle ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparin	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270991
Hydrogen peroxide 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzyl ether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Sodium azide	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 dilution
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1	R&D Systems	AF3628	Final concentration of 2 µg/mL
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Final concentration of 2 µg/mL
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Final concentration of 5-10 µg/mL
Imaging chamber	ibidi	80287
Light sheet microscope	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Imaging software	LaVision BioTec	Imspector software
Microscopy visualization software	Bitplane	Imaris