JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı kornea limbal epitel kök hücre xeno - ve besleyici boş hücre kültür koşullar altında insan pluripotent kök hücrelerden ayırt için basit iki adımlı bir yöntem sağlar. Burada sunulan hücre kültür yöntemleri klinik kalite hücre kornea hücre terapisi kullanmak için uygun maliyet-etkin, büyük ölçekli üretim sağlar.

Özet

Kornea limbal epitel kök hücreler (LESCs) sürekli yenileyerek kornea epitel ve böylece kornea homeostazı ve görsel netlik sağlamak için sorumludur. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC)-türetilmiş LESCs kornea hücre replasman tedavisi için umut verici bir hücre kaynağı sağlamak. Tanımsız, xenogeneic kültür ve farklılaşma koşulları araştırma sonuçlarında değişim neden ve hPSC elde edilen tedavi klinik tercümesi engel. Bu iletişim kuralı için hPSC-LESC farklılaşma xeno - ve besleyici boş hücre koşullar altında tekrarlanabilir ve verimli bir yöntem sağlar. İlk olarak, rekombinant laminin-521 (LN-521) ve tanımlanmış hPSC orta farklılaşmamış hPSC kültürünün monolayer saptamaları için yüksek kaliteli başlangıç malzemesi sağlam üretimi için bir temel olarak hizmet vermektedir. İkinci olarak, hızlı ve basit hPSC LESC ayırt etme yöntemi sadece 24 gün içinde LESC örneğin alınma olasılığını verir. Bu yöntem bir dört gün yüzey ektodermal indüksiyon LN-521/kollajen IV kombinasyonu matris tanımlanmış kornea epitel farklılaşma orta yapisan kültür aşaması gelir küçük molekülleri ile süspansiyon dahil eder. Cryostoring ve genişletilmiş farklılaşma daha fazla hücre nüfus arındırır ve bankacılık hücre hücre terapi ürünleri için büyük miktarlarda sağlar. Elde edilen yüksek kalite hPSC-LESCs limbal kök hücre eksikliği (LSCD) tedavisinde kornea yüzey yeniden inşası için potansiyel bir roman tedavi stratejisi sağlayabilir.

Giriş

Oküler yüzeyde saydam kornea retina girmek ışık ve gözün refraktif güç çoğunluğu sağlar. En dış katmanı, tabakalı kornea epitel sürekli limbal epitel kök hücreleri (LESCs) tarafından yeniden oluşturulur. LESCs corneoscleral kavşak1,2limbal nişler bazal tabaka yer alır. Kendi kimlik bir dizi sözde işaretleri daha kapsamlı bir analiz gerektirir böylece LESCs özel ve benzersiz işaretleri, eksikliği. Epitel transkripsiyon faktörü p63 ve özellikle N-ölümcül kesilmiş transkript p63 Alfa izoformu (ΔNp63α), bir ilgili olumlu LESC işaret3,4önerdi. Asimetrik Anabilim Dalı LESCs onları kendi kendini yenilemek, ama aynı zamanda centripetally ve anteriorly geçirmek Döl üretmek izin verir. Hücreleri ilerleme olarak kornea yüzeyine doğru onlar yavaş yavaş onların stemness kaybetmek ve son olarak da sürekli olarak kornea yüzeyinden kaybolur yüzeysel Skuamöz Hücre ölümcül ayırt etmek.

Kornea katmanlardan herhangi birini Damage için ciddi görme bozukluğu açabilir ve kornea kusurları böylece görme kaybı dünya çapında önde gelen nedenlerinden biridir. Limbal kök hücre eksikliği (LSCD), limbus hastalık ya da conjunctivalization ve opaklaşmasına kornea yüzey ve vizyon5,6sonraki kaybı yol açan travma tarafından yok edilir. Hücre replasman tedavisi otolog veya allojenik limbal Greftler kullanarak LSCD4,7,8,9olan hastalar için bir tedavi stratejisi sunmaktadır. Ancak, otolog greft hasat sağlıklı göz komplikasyon riski taşımaktadır ve donör doku kısa kaynağı olduğunu. İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs), özellikle insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (hiPSCs), klinik hücre tipleri kornea epitel hücreleri de dahil olmak üzere, sınırsız bir kaynağı olarak hizmet verebilir. Bu nedenle, hPSC elde edilen LESCs (hPSC-LESCs) oküler hücre replasman tedavisi için çekici bir yeni hücre kaynağı temsil eder.

Geleneksel olarak, farklılaşmamış hPSC kültür yöntemleri ve farklılaşma protokolleri LESCs için tanımsız besleyici hücreler, hayvan sera, klimalı ortam veya amniyotik membran10,11, kullanımı yararlanmıştır 12 , 13 , 14 , 15. son zamanlarda, daha fazla standart ve xeno-Alerjik kültür ve farklılaşma protokolleri için arama çabaları daha güvenli hücre terapi ürünleri doğru isteniyor. Sonuç olarak, çeşitli tanımlı ve xeno-Alerjik farklılaşmamış hPSCs uzun vadeli kültürü için şimdi piyasada bulunan16,17,18yöntemlerdir. 19,20,21,22bir süreklilik, yönlendirilmiş farklılaşma kornea epitel kadere hPSCs Kılavuzu için moleküler ipuçları üzerinde güvenerek protokolleri son zamanlarda tanıttı gibi 23. Henüz bu protokollerin çoğunu ya da tanımsız, besleyici dayalı hPSCs malzeme veya karmaşık, xenogeneic büyüme faktörü kokteyl farklılaşma için başlangıç olarak kullanılır.

Bu iletişim kuralının amacını sağlam, en iyi duruma getirilmiş, xeno sağlamaktır- ve besleyici-Alerjik hPSC kültür yöntemi ve kornea LESCs için sonraki farklılaşma. Pluripotent hPSCs laminin-521 (LN-521) matris içinde tanımlanan, albümin-Alerjik hPSC Orta (özellikle temel 8 Flex) kültürünün monolayer homojen Başlangıç materyali saptamaları için hızlı üretim sağlar. Bundan sonra basit bir, iki adım farklılaşma stratejisi hPSCs yapisan farklılaşma tarafından LESCs için takip süspansiyon, yüzey ektodermal kadere doğru size yol gösterir. Nerede > %65 ΔNp63α hızlı bir hücre nüfus 24 gün içinde elde edilir. Xeno ve besleyici ücretsiz iletişim kuralı birkaç hPSC hattı (her ikisi hESCs ve hiPSCs), hücre satır belirli optimizasyonu için herhangi bir zorunluluğu olmadan test edilmiştir. Yüksek kaliteli LESCs için büyük gruplar halinde üretimi için burada açıklanan hafta sonu ücretsiz bakım, passaging, cryostoring ve hPSC-LESC fenotipleme iletişim kurallarını etkinleştirme klinik veya araştırma amaçlı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tampere Üniversitesi Ulusal insan embriyosu üzerinde araştırma yapmak için yetki Medicolegal işleri Finlandiya (Dnro 1426/32/300/05) onayı vardır. Enstitü aynı zamanda Etik Komitesi: Pirkanmaa hastane bölgesinin, kültür, türetme yapıp yapmayacağınızı ve hESC satırları (Skottman/R05116) ayırt etmek ve hiPSC satırları oftalmik araştırma (Skottman/R14023) kullanmak için destekleyici ifadeleri var. Yeni hücre satır bu çalışma için elde edilmiştir.

Not: açıklanan protokolü belirli, piyasada bulunan hPSC ve kornea epitel farklılaşma medya dayanmaktadır. Tablo malzemeleri üretici/tedarikçi bilgi ve Katalog numaraları için başvurun.

1. hPSC kültür Xeno ve besleyici ücretsiz kurulması

  1. Hazırlıklar
    1. 24-şey pilakalar ve insan rekombinant laminin-521 (LN-521) kat. İlk besleyici-Alerjik (FF) geçiş için LN-521 1,09 µg/cm2bir konsantrasyon ve 0.55 µg/cm2 aşağıdaki pasajlar için kullanın. Önerilen LN-521 konsantrasyonları başarılı FF kültür için bir başlangıç noktası olarak hizmet ama indirdi.
      1. LN-521 flakon yavaşça 4 ° C'de üretici tarafından talimat olarak çözme.
        Not: Uygun şekilde işlenmiş LN-521 çözüm 4 ° C'de çözdürme sonra 3 ayda depolanmış olabilir.
      2. Kaplama çözüm hazırlamak için uygun miktarda LN-521 hisse senedi çözüm ile 1 x Dulbecco'nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik (Ca2 + ve Mg2 + 300 µL iyi başına toplam hacmiyle içeren DPBS) oranında seyreltin.
      3. Damlalıklı wells, kaplama çözüm parafilm ile iyi plaka mühür ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya Kaplamalı plakalar 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
        (İsteğe bağlı): Alternatif olarak, kuluçkaya hızlı kaplama iletişim kuralı için iyi pilakalar ve kaplama çözüm için 2 h 37 ° c, % 5 CO2.
    2. HPSC kültür orta (özellikle temel 8 Flex) Bazal orta sağlanan ilave ile ilave tarafından üretici tarafından talimat olarak hazır olun. 50 U/mL penisilin-streptomisin ekleyin. Formülasyonu hafif ve yüksek ısıya duyarlı olduğunu unutmayın. Ek çözülme ve ışıktan korumalı medya, oda sıcaklığında (RT), sıcak. Takviyesi tarihinden itibaren iki hafta içerisinde ilave hPSC aracı kullanın.
  2. HPSC LN-521 üzerinde FF kültür için aktarma
    1. Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
    2. Besleyici Katmanlar (Örneğin insan Inaktif sünnet (hFF) veya fare embriyonik fibroblastlar) sistemde standart kültür veya diğer FF kültür sistemleri standart metodoloji kullanarak geçiş hPSCs. Örneğin, hPSC kolonileri hFF besleyici hücreler kültürlü bir neşter ile küçük parçalar ve parçaları bir iğne ucu ile ilişkisi kesildi kesmiştim. FF kültür sistemleri kullanarak kültürlü insan PSC'ler yöntemi ile veya olmadan önceki enzim tedavisi passaging küme kullanarak transfer edilebilir.
    3. LN-521 kaplama çözüm 24 kuyulardan kaldırın ve 1 mL önceden ısıtılmış hPSC orta iyi başına ekleyin.
      Not: LN-521 kurutma üzerine devre dışı gibi Kuru kuyu izin vermez.
    4. Koloni adet/hücre kümeleri LN-521 kaplı 24-kuyu hPSC orta bir pipet ile aktarın. 20-30 koloni adet iyi kuyuları aşırı kalabalık kaçınarak, başına aktarın.
    5. Orta hPSC orta 1 mL ile transfer ve bundan sonra her gün sonra gün değiştirin. Kültürler passaging 3-4 gün sonra hPSCs dışarı pürüzsüz, farklılaşmamış görünümdeki kolonileri için büyüdü için hazırsınız. Başvuru için bkz: Şekil 1B (ilk resim). İlk FF geçiş için koloniler için tam konfluent monolayer büyümeye izin verilmemelidir ama kolonileri yaklaşık bir boyutu 1 mm ulaştığınızda kültürler passaged.
  3. Passaging ve bakım FF hPSC kültür
    1. Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
    2. 80-%100 confluency kültür ulaşmıştır itibaren ikinci FF bölüm, FF hPSCs geçiş. Geçit FF hPSCs yeni LN-521 için iki kez bir hafta (Pazartesi ve Perşembe günleri) tek hücre passaging farklılaşmamış morfolojisi ile yüksek kaliteli kültürleri korumak için ve hafta sonu ücretsiz beslenme rejimi elde etmek için kullanarak 24-şey plakaları kaplı. Detaylar için lütfen18,24,25için bakın.
      1. FF hPSCs iki kez Ca2 + ve Mg2 +1 x DPBS 1 mL ile yıkayın.
      2. FF hPSCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA (özellikle TrypLE seçin enzim) ile 37 ° C, % 5 CO2kuyuda başına 500 µL kuluçka tarafından bağlantısını kesin. Hücreleri yukarı yuvarlamak ama değil ayırmak için en uygun kuluçka süresi için izin. Bu genellikle 37 ° C, % 5 CO2 3 dakika sürer (5 dk fazla olamaz).
      3. Xeno-Alerjik tripsin-EDTA kaldırın ve hemen tanımlanmış tripsin inhibitörü kuyu başına 500 µL ekleyin.
      4. FF hPSCs bir tek hücre süspansiyon elde etmek için dikkatli, henüz tam pipetting tarafından bağlantısını kesin. FF hPSC süspansiyon önceden ısıtılmış hPSC orta içeren bir 15 mL konik santrifüj tüpüne 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla aktarın.
      5. 1 mL hPSC orta Wells'le yıkama ve çamaşır orta 15 mL konik santrifüj tüpü için ekleyin.
      6. Tek hücre süspansiyon için 300 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi, hücre Pelet Aspire edin ve 1 mL önceden ısıtılmış hPSC ortamda resuspend.
      7. Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücreleri saymak.
      8. LN-521 kaplama çözeltisi (0.55 µg/cm2) 24 kuyulardan kaldırın ve hPSC orta 1.2.3 olduğu gibi ekleyin.
      9. Plaka FF hPSCs 0,55 µg/cm2 LN-521 üzerine 24-wells, 40.000-50.000 hücreleri/cm2hücre yoğunluğu kaplı.
      10. Orta taze hPSC orta passaging sonra gün ve bundan sonra Pazar günleri hariç her gün değiştirin.
    3. Hücre farklılaşması için 3-4 gün passaging sonra ne zaman kültür ulaşmıştır kullanılmaya hazır > % 85 confluency. HPSCs yüksek kalitesini sağlamak için karakterizasyon yöntemleri ayrıntılı olarak önceki işleri18,24,25açıklanmıştır bakın. Bu sadece kültür hPSCs kadar geçiş Seviye 15 FF sistemdeki tek hücre karyotip değişiklikleri önlemek için passaging kullanarak önerilir. Sadece yüksek kaliteli, farklılaşmamış hPSCs malzeme saptamaları için başlangıç olarak kullanın.

2. yönlendirilmiş farklılaşma ve hPSC elde edilen LESCs dondurma

  1. Hazırlıklar
    1. Xeno-Alerjik bazal indüksiyon Orta (bazal indüksiyon orta) hazırlamak: ek Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (özellikle nakavt DMEM) % 15 xeno-Alerjik serumu değiştirme ile (spesifically CTS nakavt SR XenoFree), 2 mM L-glutamin, 0,1 mM 2 - mercaptoethanol, %1 non-gerekli amino asitler ve 50 U/mL penisilin-streptomisin. Bazal indüksiyon orta iki hafta içinde kullanın.
    2. Medya süspansiyon kültürü kornea indüksiyon için hazır olun.
      1. 1. gün: Bazal indüksiyon orta 5 mikron blebbistatin ile ek.
      2. 2. gün: 10 µM SB-505124 ve 50 ng/mL insan temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile bazal indüksiyon orta ek.
      3. Gün 3-4: 25 ng/mL kemik morfogenetik protein 4 ile ek bazal indüksiyon Orta (BMP-4).
    3. Kornea epitel farklılaşma Orta (farklılaşma orta, özellikle CnT-30) yapisan kültür için hazırlamak: üreticinin yönergelerine göre bazal orta takviyeleri ekleyin ve 50 U/mL penisilin-streptomisin ekleyin.
      Not: Farklılaşma orta formülasyonu ışığa duyarlıdır. İlave farklılaşma orta takviyesi tarihi 6 hafta içerisinde kullanın.
    4. Kat 100 mm doku kültürü yemekleri yapisan farklılaşma için (bkz. Adım 2.3) 0,5 µg/cm2 LN-521 1 x DPBS Ca2 + ve Mg2 +, bir toplam içeren içinde seyreltilmiş ve 5 µg/cm2 insan plasental kollajen tip IV (sütun IV) karışımı ile kaplama hacmi çanak başına 5 mL. Hazırlamak ve col IV kaplama ve LN-521 1.1.1.3 içinde açıklandığı gibi saklayın.
  2. Adım ı: kornea indüksiyon süspansiyon kültürü
    1. Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
    2. FF hPSCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile tek hücre süspansiyon için adımları 1.3.2.1–1.3.2.6 talimat olarak ayırmak. Hücreleri saymak ve 2-3 x 6-şey plaka, EB oluşumu ikna etmek için 5 mikron blebbistatin ile desteklenmiş bazal indüksiyon orta 3 mL hacmi içinde bir gecede 37 ° C, % 5 CO2 (gün 1) düşük ek başına 106 hücre dağıtmak.
    3. Ertesi gün (gün 2), orta kaldırmak ve 3 mL 10 µM SB-505124 ve 50 ng/mL bFGF ile desteklenmiş bazal indüksiyon orta yerine.
    4. Aşağıdaki iki gün (günde 3-4), orta kaldırmak ve 3 mL 25 ng/mL ile BMP-4 takıma bazal indüksiyon orta yerine.
  3. Adım II: Kornea farklılaşma yapisan kültür
    1. Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
    2. 5 günde 5 µg/cm2 col IV ve 0,5 µg/cm2 LN-521 ile kaplı 100 mm doku kültürü yemekleri üzerine aşağı EBs plaka.
      1. Kaplama çözüm 100 mm doku kültürü yemekleri kaldırın ve önceden ısıtılmış farklılaşma orta çanağı başına 10 mL ekleyin.
        Not: Bulaşıkları LN-521 kurutma üzerine devre dışı gibi kuru izin vermez.
      2. EBs bir 6-şey plaka de iki üç 100 mm doku kültürü yemekleri transfer (yaklaşık 50 cm2başına EBs) pipetting tarafından. EBs nazik sallayarak eşit dağıt.
    3. 37 ° c, % 5 CO2orta yerine taze farklılaşma orta 10 mL ile önümüzdeki 2,5 – 3 hafta boyunca (Tarih Pazartesi, Çarşamba ve Cuma) haftada üç kez, yapisan kültüründe hücreleri korumak. Hücreleri faz kontrast mikroskop kullanarak doğru epitelyal morfoloji ortaya çıkması için düzenli olarak denetleyin.
  4. Adım III: Cryo-bankacılık hPSC elde edilen LESCs
    1. Tüm gerekli malzeme ve önceden soğutulmuş dondurma orta dışında laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
    2. HPSC elde edilen LESCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve adımları 1.3.2.1–1.3.2.6 ama farklılaşma orta kullanma FF hPSCs için talimat olarak hücreleri saymak.
      Not: hPSC elde edilen LESCs için en uygun kuluçka xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile daha uzun zamanı (yaklaşık 5 dk). Xeno-Alerjik tripsin-EDTA ve tanımlanmış tripsin inhibitörü 3 mL 100 mm çanak kullanın.
    3. Sayım sonra hücreler, vasıl 300 x g, 5 min için tekrar Santrifüjü orta Aspire edin ve hücre Pelet önceden soğutulmuş, xeno-Alerjik hPSC dondurma ortamda resuspend. Damlalıklı tek hücre süspansiyon cryotubes böylece her cryotube 1 mL dondurma orta 0.5-1 x 106 hücreler içerir.
    4. Tüpler bir dondurma konteyner ve-80 ° c hemen (5 dk) içinde transfer gecede yerleştirin.
    5. Ertesi gün, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tüpleri aktarın.
  5. Adım IV: cryopreserved hPSC-LESCs çözme
    1. Çözdürme önce 5 µg/cm2 col IV ve 0,5 µg/cm2 LN-521 yemekleri/iyi pilakalar kat.
    2. Tüm gerekli malzeme ve laminar akış başlıklı RT reaktifler önceden ısıtmak.
    3. Kaplama çözüm yemekleri/kuyulardan kaldırın ve uygun önceden ısıtılmış farklılaşma orta hacmi ekleyin.
      Not: Bulaşıkları LN-521 kurutma üzerine devre dışı gibi kuru izin vermez.
    4. Hücreleri hızlı bir şekilde RT, çözülme ve hücre süspansiyon önceden ısıtılmış farklılaşma orta 5 mL içeren 15 mL konik santrifüj tüpü hemen aktarın.
    5. 300 x g, de 5 dk Aspire edin ve Pelet farklılaşma ortamda herhangi bir dondurma orta kaldırmak için resuspend hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
    6. Hücreleri yemekleri/kuyu 5 µg/cm2 col IV ve 0,5 µg/cm2 LN-521, 40.000-50.000 hücreleri/cm2yoğunluğu, farklılaşma ortamda ile kaplı üzerine plaka. 37 ° c, % 5 CO2haftada üç kez farklılaşma orta yerine, hücreleri korumak.

3. fenotipleme hPSC elde edilen LESCs

  1. Nitel ayirt Analizi
    1. Ayirt için 24 veya 12 iyi plaka wells ile 5 µg/cm2 col IV ve 0,5 µg/cm2 LN-521 ve plaka/tezcan hPSC-LESCs 40 yoğunluğu, farklılaşma orta kat 000 – 50 000 hücre/cm2.
    2. Kültürler confluency ulaştınız, hücreleri % 4 paraformaldehyde (PFA) ile fix: wells olmadan Ca2 + ve Mg2 +1 x DPBS ile iki kez yıkayın ve % 4 ile 15-20 dk kuluçkaya PFA RT. Bundan sonra herhangi bir PFA artıkları kaldırmak için iki kez 1 x DPBS ile yıkayın. Çözümleri de başına kullanım 0.5-1 mL.
      Not: Sabit hücreleri 4 ° C'de 1 x DPBS boyama önce bir hafta depolanabilir.
      Dikkat: PFA toksik ve aşındırıcı. İngiltere'de yılın bir duman mahallede işlemek ve koruyucu giysiler, göz koruması ve eldiven giymek.
    3. 1 x DPBS Aspire edin ve hücre zarlarında Triton X-100 1 x DPBS içinde 10-15 dk % 0.1 ile kuluçka permeabilize.
    4. % 0.1 Triton X-100 ve blok nonspesifik antikor bağlayıcı siteleri RT. Prepare birincil antikor dilutions 1 x DPBS % 0.5 BSA içinde 1 x DPBS içinde % 3 Sığır serum albümin (BSA) ile 1 h için kuluçka tarafından Aspire edin.
      Not: Tablo 1 için önerilen birincil antikor bakın.
    5. %3 BSA Aspire edin ve uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor gecede 4 ° C'de ile kuluçkaya
    6. 3 kuyu yıkama 5 min için x 1 x DPBS ile. 1 x DPBS % 0.5 BSA ikincil antikor dilutions hazırlayın.
      Not: Tablo 1 için önerilen ikincil antikor bakın.
    7. 1 x DPBS Aspire edin ve ışıktan korunan RT, 1 h için uygun, uygun şekilde seyreltilmiş ikincil antikor ile kuluçkaya.
      Not: Bu adımından floresan boyalar solmaya önlemek için ışıktan korunan örnekleri tutmak.
    8. 3 kuyu yıkama x 1 x DPBS ile 5 dk ve nihayet counterstain çekirdeklerin 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ve ortam takma floresan ile monte. DAPI ayrı olarak üreticinin talimatlarına göre kullanılan veya montaj orta dahil. Yer coverslips yuvarlak (çapı 19 mm ve 13 mm için 12-24-iyi ve levhalar, sırasıyla) her şey içinde. Kurutma ve depolama monte örnekleri ile ilgili üreticinin yönergeleri izleyin.
    9. Lekeli hücreleri floresan mikroskop ile görüntü.
  2. Nicel ayirt Analizi
    1. HPSC elde edilen LESCs nesne gözlükteki örnekleri cytospin hazırlayın.
      1. HPSC elde edilen LESCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve 2.4.2. adımda anlatıldığı gibi hücreleri saymak.
      2. Sayım sonra önceden soğutulmuş 1 x DPBS ve 300 x g. ayarlama numune hacmi, 5 min için santrifüj ve hücre konsantrasyon verilen cytocentrifuge, Örneğin , üreticinin yönergelerine göre 150 µL örnek hacmi içinde 50.000-100.000 hücreleri ekleyin.
      3. Hücreleri nesne gözlük ile bir cytocentrifuge Örneğin 5 dk 28 x g ve düzeltme % 4 ile 15-20 dk için hemen aşağı spin PFA RT., 1 x DPBS içinde Önerilen iplik zaman ve hız için verilen cytocentrifuge talimat kılavuzuna bakın.
    2. Adımları 3.1.3–3.1.8 kullanım sıvı engelleyici kalem örnekleri hidrofobik bir daire ile çevrilidir ve ekonomik uygulama için damlacık boyama yapmak için açıklandığı gibi cytospin örnekleri boyama için devam edin. Yıkar kapları ile slayt sahipleri, aşırı antikor ve minimal arka plan boyama verimli kaldırılmasını sağlamak için gerçekleştirilebilir. Çekirdeklerin DAPI ile counterstain ve coverslips ile kapsayan ortam takma floresan ile lekeli örnekleri bağlayabilirsiniz. Kurutma ve depolama monte örnekleri ile ilgili üreticinin yönergeleri izleyin.
    3. 5 – 10 çekim Örneğin 10 X büyütme floresan mikroskop kullanarak rasgele seçilen konumlardan örnek başına.
    4. Örneğin ImageJ görüntü işleme ve analiz yazılımı (https://imagej.nih.gov/ij/) araçları ile toplam (DAPI pozitif) hücrelerle ilişkili olarak olumlu lekeli hücreleri yüzdesini tahmin ediyoruz. Tercihen analiz > örnek başına 500 hücre.
      1. Açık belgili tanımlık imge ImageJ yazılımında analiz edilecek. Yinelenen görüntü ve gürültü çıkarmak için varsayılan Gauss Bulanıklığı filtresi.
      2. Bir eşik oluşturun. Olumlu lekeli hücre çekirdeği en iyi seçim için eşik değerleri ayarlamak ve uygulayın. Çoğaltılmış görüntü şimdi ikili bir görünüme dönüştürülür.
      3. İşlemi ikili işlemciler ile ikili resim "Dolgu delik" ve "havza", otomatik olarak birleştirilmiş alanları tek çekirdek temsil eden ayrı olacak araçları.
      4. Otomatik olarak liste bölgeleri çıkarları (ROIs) komutu uygulamadan üzerine açılacak ROI Yöneticisi penceresi için için "Analiz parçacıklar" aracını kullanın. İkili resim kapatın.
      5. Orijinal görüntüdeki ROIs "ROI Yöneticisi'nde tüm göster" seçerek görselleştirin. Lekeli hücre çekirdeği doğru seçim doğrulayın ve gerekirse, el ile kaldırın ve bireysel seçimleri ekleyin.
  3. Akış Sitometresi Analizi
    1. P63α ifade düzeyleri onaylamak için akış sitometresi için hücreleri leke.
      1. HPSC elde edilen LESCs xeno-Alerjik tripsin-EDTA ile bağlantısını kesin ve 2.4.2. adımda anlatıldığı gibi hücreleri saymak.
      2. Hücreleri iki kez ile 1 mL 1 x DPBS önceden soğutulmuş ve 300 x g. düzeltme, 5 min için santrifüj kapasitesi ve 4 ° C'de 20 dk için kullanıma hazır fiksasyon/permeabilization çözüm ile permeabilize yıkama Bundan sonra yıkayın 1 mL iki kez hücrelerle yıkama arabellek permeabilizing x 1 önceden soğutulmuş.
        Not: Bu adımından hücreleri 4 ° C'de veya buz üzerinde Aksi belirtilmedikçe tutun.
      3. Dikkat: % 4.2 formaldehit fiksasyon/permeabilization çözüm içerir. Bir duman hood tehlikeli çözümde işlemek ve koruyucu giysiler, göz koruması ve eldiven giymek.
      4. Örnekleri 5 mL polipropilen tüpler içine bölün. Her örnek 100.000-200.000 hücreleri içermelidir ve numune hacmi yaklaşık 100 µL yıkama arabellek x 1 için ayarlanmalıdır.
      5. Birleşik fluorochrome p63-α FACS antikor 2 µL ekleyin (önerilen antikor için malzeme ve tesisatlar tablo bkz.) örnek tüpler içine. Bir örnek negatif denetimi hizmet için günahı bırakın. Girdap örnekleri ve ışıktan korunan RT, 1 h için kuluçkaya.
      6. İki kez önceden soğutulmuş 1 yıkama arabellek x 1 mL içeren hücreleri yıkama ve son olarak, granül 300 µL arabelleği ile resuspend. Tüpler buza, ışıktan korunan saklayın.
    2. Akış sitometresi ile örnekleri analiz. Günahı negatif kontrol örnek için doğru hücre nüfus çoğunluğuna ve floresan arka plan sinyal dışlamak için kullanın. En az 10.000 p63-α analiz-hücreleri lekeli. Ayrıntılı teknik uygulama için verilen akış sitometresi Kullanıcı kılavuzuna bakınız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

HPSC-LESCs için hPSCs

FF hPSCs cryostoring hPSC-LESCs için farklılaşma inducing üzerinden tüm süreç yaklaşık 3,5 hafta sürer. Şekil 1A' onun anahtar adımlar vurgulayarak farklılaşma yönteminin şematik genel bakış sunulur. Şekil 1B hücre nüfusun tipik türleri morfoloji protokol farklı aşamalarında gösterir. Sunulan veri Regea08/017 hESC çizgi ile...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Beklenen bu iletişim kuralı başarılı ve sağlam nesil LESCs FF hPSC bir tek hücre süspansiyon üzerinden yaklaşık 3,5 hafta içinde sonucudur. Kornea epitel yüzey ektoderm29geliştirir Protokolü'nün ilk adım hPSCs bu soy doğru direksiyon amaçlamaktadır. Dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-β) antagonisti SB-505124 ve bFGF ile bir kısa 24 h indüksiyon ektodermal farklılaşma, 48 h Mezodermal BMP-4 isteka yüzey ektoderm karşı hücreleri itmek için ardından ikna etmek ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Çalışma Finlandiya (grant numarası 297886) Akademisi, insan yedek parça programı Tèkèsī, Fince finansman ajansı tarafından teknoloji ve yenilik, desteklenmiştir Fin göz ve doku Bankası Vakfı ve Fin Kültür Vakfı. Yazarlar Biyomedikal Laboratuar teknisyenleri bozuştuk Melin, Hanna Pekkanen, Emma Vikstedt ve sonunda Heikkilä mükemmel teknik yardım ve hücre kültürü katkısı için teşekkür ederiz. Profesör Katriina Aalto-Setälä kullanılan hiPSC hattı ve BioMediTech Imaging Core tesisi ekipman floresans görüntüleme için sağlamak için sağlamak için kabul edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Material/Reagent
1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS without Ca2+ and Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm cell culture dishCorning CellBIND#3296Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation
12-well plateCorning CellBIND#3336Culture vessel format for IF samples
24-well plateCorning CellBIND#3337Culture vessel format for IF samples
2-mercaptoethanolGibco#31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachmentCorning Costar#3471Culture vessel format for induction in suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgThermoFisher Scientific#A-21202Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgThermoFisher Scientific#A-21206Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-goat IgThermoFisher Scientific#A-11057Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse IgThermoFisher Scientific#A-10037Secondary antibody for IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)PeproTech Inc.#AF-100-18BAnimal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization SolutionBD Biosciences#554722Fixation and permeabilization solution for flow cytometry
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Washing buffer for flow cytometry
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Cytokeratin 12 antibodySanta Cruz Biotechnology#SC-17099Primary antibody for IF
Cytokeratin 14 antibodyR&D Systems#MAB3164Primary antibody for IF
Cytokeratin 15 antibodyThermoFisher Scientific#MS-1068-PPrimary antibody for IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation
Collagen type IV (human)Sigma-Aldrich#C5533Human placental collagen type IV
CoolCell LX Freezing ContainerSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure tubesSarsted#72.3801.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation
Defined Trypsin InhibitorGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminin 521Biolamina#Ln521Human recombinant laminin 521
ΔNp63α antibodyBioCare Medical#4892Primary antibody for IF
OCT3/4 antibodyR&D Systems#AF1759Primary antibody for IF
p63α antibodyCell Signaling Technology#ACI3066APrimary antibody for IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)Cell Signaling Technology#56687p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry
PAX6 antibodySigma-Aldrich#HPA030775Primary antibody for IF
Penicillin/StreptomycinLonza#17-602E
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich#158127Cell fixative for IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI mountant for hard mounting for IF
PSC Cryopreservation KitThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM non-essential amino acidsGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Permeabilization agent for IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200DAPI mountant for liquid mounting for IF
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin IITharmac
Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6BD Biosciences
Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51Olympus

Referanslar

  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286(2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 140insan embriyonik k k h creleriinsan ind klenen pluripotent k k h crelerkornea limbal epitel k k h crelerxeno freebesleyici alerjikk k molek l ind ksiyony nlendirilmi kornea farkl la ma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır