JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Erratum Notice
  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Erratum
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

O9-1 multipotent fare nöral crest hücre çizgidir. Burada O9-1 hücre kültürü çalışmalarının, O9-1 hücreleri belirli hücre türleri ayırt ve genetik olarak siRNA aracılı nakavt veya CRISPR-Cas9 genom düzenleme kullanarak O9-1 hücreleri manipüle ayrıntılı adım adım iletişim kuralları açıklar.

Özet

Nöral crest hücreleri (NCCs) da farklı hücre türleri ayırt birden fazla doku ve organların ortaya çıkmasına multipotent kök hücreleri geçiş vardır. O9-1 hücre kültürünü endojen türetilmiştir embriyonik NCCs fare ve onun multipotency korur. Ancak, belirli koşullarda O9-1 hücreler farklı hücre türleri ayırt edebilir ve araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılmak. Son zamanlarda, fare çalışmaları ve O9-1 hücre çalışmaları kombinasyonu ile biz yolu effectors Yap ve Taz nöral crest kaynaklı kraniyofasiyal gelişiminde önemli rol oynarlar sinyal Hippo göstermiştir. O9-1 hücreler için kodlamayla işlem diğer hücre hatlarında kullanılan daha karmaşık olmakla birlikte, O9-1 hücre kültürünü NCCs içinde vitroaraştırılması için güçlü bir modeldir. Burada, farklı hücre tipleri, düz kas hücreleri ve dokusunu gibi içine O9-1 hücreleri differentiating için protokol yanı sıra kendi stemness korumak için O9-1 hücre kültürünü kültür için bir iletişim kuralı mevcut. Buna ek olarak, iletişim kuralları CRISPR-Cas9 silme ve küçük müdahale RNA-aracılı nakavt kullanarak O9-1 hücrelerde gen fonksiyon kaybı çalışmaları gerçekleştirmek için açıklanmıştır.

Giriş

Nöral crest hücrelerdir (NCCs) multipotent gibi kök hücreleri bir göçmen görmeyeteneği ve embriyonik gelişim sırasında geçici varlığı. NCCs yüzey ektoderm ve nöral tüp arasında köken ve embriyo diğer bölümlerine embriyonik geliştirme1sırasında geçiş. İşlevsel etki alanları üzerinde bağlı olarak, NCCs birkaç kafatası dahil olmak üzere farklı türleri, gövde, vagus, sakral ve kardiyak NCCs sınıflandırılabilir. Buna ek olarak, NCCs düz kas hücreleri, kemik hücreleri ve nöronlar, gibi birden çok hücre soy içine ayırt etmek ve çeşitli dokularda2,3' e neden olmaktadır. NCCs gelişimi çeşitli moleküler sinyalleri tarafından ince ayar morfogenetik olaylar karmaşık bir dizi ile karakterizedir. NCCs karmaşık düzenlenmesi ve çok sayıda yapıları onların önemli katkıları göz önüne alındığında, NCC geliştirme bozukluk yaygın konjenital Doğum kusurları, tüm insan konjenital Doğum kusurları yaklaşık % 30 için hangi hesabı açabilir. Anormallikler nöral kret geliştirme sırasında yarık dudak/kusurlu damak için neden olabilir burun oluşumu, sendromlar, kusurları bir arızalı kardiyak çıkış yolu veya bile bebek ölüm1,4,5, gibi 6 , 7. moleküler mekanizmaları NCC gelişiminin en önemli kusurları NCC geliştirme neden olduğu hastalıklar için tedavi geliştirmek için önemli noktadır. 8,9,10,11,12,13,14 çeşitli vitro ve in vivo kullanılarak yaklaşımlar ,15, önemli ilerleme NCC araştırma yapılmıştır. Vivo, tavuk, amfibiler, zebra balığı ve fareler, hayvan modeller NCCs1araştırmak için kullanılmıştır. Ayrıca, ilk insan embriyo gelişimi16NCC geçiş sürecinin çalışmaya insan embriyosu kullanılmıştır. Vitro, hücre modelleri hasta subkutan yağ, kökenli insan NCCs gibi NCCs için Parkinson hastalığı17araştırmak için kullanılmıştır. Aslında endojen NCCs E8.5 fare embriyo18izole kitle kültürü elde, O9-1 kkk satır okuyan NCCs. önemlisi, Sigara ayırt kültür koşullar altında bir güçlü hücre model, O9-1 hücreler Multipotent kök gibi NCCs. Ancak, değişen kültür şartlar altında O9-1 hücreleri içine ayırt edici hücre tipleri, düz kas hücreleri, dokusunu, kondrosit ve Gliyal hücreler18gibi farklı. Bu özellikler göz önüne alındığında, O9-1 hücreleri moleküler mekanizması kafatası yüz kusurları19,20soruşturma gibi NCC ilgili çalışmaları için genel olarak kullanılmıştır.

Detaylı iletişim kuralları O9-1 hücreleri bakımı, farklı hücre tipleri O9-1 hücreleri ayırt ve gen fonksiyon kaybı çalışmalar CRISPR-Cas9 genom düzenleme ve küçük müdahale RNA (siRNA) ile gerçekleştirerek O9-1 hücreleri manipüle sağlamak burada,- devirme teknolojileri aracılık. Temsil edici bir örnek olarak, Yap ve Taz kaybı--fonksiyonu çalışmaya O9-1 hücreleri kullanımı açıklanmıştır. Yap ve Taz hücre çoğalması, farklılaşma ve Apoptozis kritik bir rol oynamaktadır yolu sinyal Hippo aşağı akım effectors vardır. Hippo yol geliştirme ve homeostasis birkaç farklı doku ve organları, hem de farklı hastalık20,21,22,23 patogenezinde önemli olduğu da gösterilmiştir ,24,25,26,27,28. Hippo sinyal bir çekirdek bileşenleri tümör baskılayıcı steril 20 benzeri kinaz Mst1/2, WW etki alanını içeren Salvador iskele protein ve büyük tümör baskılayıcı homolog (Lats1/2) kinaz içerir. Su aygırı sinyal Yap ve Taz etkinliği engeller ve onların yıkımı sitoplazmada teşvik etmektedir. Hippo üzerinden baskı Yap ve Taz çekirdekleri translocate ve transkripsiyon Co aktivatörler işlev. Biz son zamanlarda gösterdi ki özellikle Wnt1cre kullanarak effectors Yap ve Taz Mouse NCCs sinyal Hippo ihracı ve Wnt1Cre2SOR sürücüleri ile şiddetli E10.5, embriyonik ölümcül sonuçlandı Fasiyal kusurları20. Biz de rolü Yap ve NCCs Taz araştırmaya O9-1 hücreleri kullanarak çalışmaları gerçekleştirdiniz. NCC yayılması ve farklılaşma, Yap ve Taz nakavt yap ve Taz işlevinde çalışmaya hücreleri O9-1 hücrelerde siRNA kullanarak oluşturulan ve Yap nakavt hücreleri CRISPR-Cas9 genom düzenlemeyi kullanarak oluşturulan. Aynı gen fonksiyon kaybı stratejileri farklı hedef genlerin diğer yolları içinde uygulanabilir. Buna ek olarak, işlev kazanç çalışmaları ve transfection deneyleri de gen fonksiyon ve yönetmelik çalışmaya O9-1 hücrelere uygulanabilir. Burada açıklanan protokoller müfettişler tarafından multipotent stemness korumak için O9-1 hücre kültürü çalışmalarının, diğer hücre tipleri farklı kültür koşullar altında içine O9-1 hücreleri differentiating için ve için gen işlev eğitim kılavuzları olarak kullanılmak amacıyla ve NCCs moleküler mekanizmaları.

Protokol

1. O9-1 hücre kültürü öncesi hazırlık

Not: Bazal medya O9-1 hücre kültürü için kullanılan yakın akraba evliliğinden doğan Sandos fareler thioguanine/ouabain-dayanıklı (STO) fare fibroblast hücreleri tarafından şartına edilmiştir gerekir; Bu nedenle, STO hücreleri elde edilen ve O9-1 hücre kültürü başlamadan önce aşağıda açıklandığı gibi hazırlanan gerekir.

  1. Etkin STO hücre kültürü
    1. Tam Dulbecco'nın yaparak etkin STO hücreleri kültür modifiye kartal medya (DMEM) % 7 fetal Sığır serum (FBS) (embriyonik kök hücre kültür grade), 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 2 mM L-glutamin (son konsantrasyonları ile ortam hazırlamak gösterilir).
      Not: Tanrı'nın askerleri orta etkin STO besleyici hücreler ekimi için kullanılır. Penisilin, streptomisin ve L-glutamin yağış depoda oluşabilir; kullanmadan önce pipetting tarafından tamamen erimesi.
    2. Kat % 0,1 jelatin, oda sıcaklığında 30 dakika ile bir standart 100 mm hücre kültür plaka. Kuluçka dönemi sonra ilave jelatin Aspire edin. Kalenin hemen kaplama sonra kullanın.
      Not: Alternatif olarak, Tanrı'nın ASKERLERİ'ni medya ile plaka kapak ve plaka (Bu ve precoated levha saklamak değil sadece kısa süreli depolama için içindir) plaka kurutma önlemek için oksijen bir kuluçka bırakın.
    3. Tanrı'nın Askerleri hücrelerinde hızla 37 ° C su banyosu çözülme; cryovial açmadan önce % 70 etanol ile silin ve hemen bütün şişeyi hücre bir santrifüj tüpü aktarın.
    4. Tanrı'nın ASKERLERİ'ni medya dropwise santrifüj tüpü ekleyin; Medya hücrelere hacmen oranı 1: 10'dur.
    5. 180 x g 3 dk RT. az için hücreleri santrifüj kapasitesi
    6. Jelatin kaplı levha nazik pipetting ve transfer hücreleri tarafından karıştırın.
    7. STO hücreleri 24 h (37 ° C, % 5 CO2) standart bir kuluçka için büyümeye izin.
    8. (Yalnızca uygun hücreleri sonra) orta değiştirmek sonra tohum ve atma eski orta 24 h.
    9. STO hücreleri bir mikroskop ve geçiş, %80 confluency altında her gün kontrol edin.
      1. Tanrı'nın ASKERLERİ'ni hücre passaging başlamadan önce % 0,1 jelatin ile plakalar kat (Jelatin cilt büyüme ortam birimi bu geminin yarısı eşittir), oda sıcaklığında 30 dakika.
      2. STO hücreleri geçiş için büyüme medya Aspire edin ve hücreleri fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile iki kez yıkayın (PBS büyüme medya eşit bir birim eklemek).
      3. PBS Aspire edin ve % 0.25 tripsin-EDTA ekleyin (geminin büyüklüğüne göre ses seviyesini); sonra 5 min için 37 ° C'de kuluçkaya.
        Not: 10 mL büyüme ortamının ve 3 mL tripsin çözeltisi 100 mm saç için kullanın. 150 mm plaka için büyüme ortamının 20 mL ve 8 mL tripsin çözeltisi kullanın. Kullanılan yıkama arabellek hacmi büyüme medya birime eşittir.
      4. Tripsin STO medya eşit bir birimdeki devre dışı bırakabilirsiniz. Tohum STO hücrelere yeni pilakalar ve bir oranı 1:3 1:10.
        Not: Bir cryovial içine bir 100 mm plaka, sonra bir 150 mm plaka sonra dört 150 mm plakalar, genişletmek için ortak bir genişleyen düzeni olduğunu ve sonunda 16 150 mm plakalar için.
  2. İnactivation ve Tanrı'nın ASKERLERİ'ni hücrelerin dondurulması
    1. Ortam buz gibi x 2 hazırlamak için aşağıdaki STO ortamına Ekle (son konsantrasyonları belirtilir): %20 FBS, % 20 dimetil sülfoksit (DMSO).
    2. Karıştırma sonra filtre sterilize medya (gözenek boyutu 0,22 µm) dondurma x 2 ve 4 ° C'de kadar kullanmak saklayın. Kullanın ve kullanılmayan dondurucu medya atın 2 x dondurucu medya aynı gün yapmak.
    3. PBS Mitomycin C çözümde 0,5 mg/mL bir konsantrasyon, hazır olun. Mitomycin C PBS içinde çözülmeye, şişe üzerinde bir vortexer ve girdap parçacıklar tamamen erimesi için yaklaşık 45 dakika için ayarlama bir düşük bant.
      Not: Mitomycin C hassas ve zor çözülmeye hafif.
      Dikkat: Mitomycin C akut toksik ve kansere neden. Sadece uygun kişisel koruyucu ekipman ile başa.
    4. STO hücreleri varolan bir medya için 0.01 mg/mL mitomycin C son bir konsantrasyon ekleyerek devre dışı bırakın. Standart bir kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) içinde 2 h için kuluçkaya.
    5. Tabak (150 mm) inactivation mitomycin C. ile sonra iki kez 20 mL PBS ile yıkayın
    6. PBS çözüm Aspire edin, 8 mL % 0.25 tripsin-EDTA kullanarak hücreleri ayırmak ve bir standart oksijen kuluçka makinesi (37 ° C, % 5 CO2) içinde 5 min için kuluçkaya.
    7. Tripsin STO medya 8 mL ile devre dışı bırakabilirsiniz.
    8. Hücre çözümü bir santrifüj tüpü aktarın. Birden fazla plaka zaman kazanmak için bir santrifüj tüpüne birleştirin. Santrifüj 180 x gde 5 min için.
    9. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 5 mL PBS resuspend.
    10. Hücre çözümü 10 µL bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için kullanın. Merkez gridded meydanında hücreleri saymak ve 10 tarafından elde edilen sayı çarpma 1 mL başına hücre sayısını belirlemek için4 . İki kez saymak ve mililitre başına hücre sayısı son tahmini elde etmek için iki sayı ortalaması.
    11. Hücreler için 180 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.
    12. PBS Aspire edin ve 1:1 (miktar tarafından) Tanrı'nın ASKERLERİ'ni medya ve 2 x dondurucu medya hücre Pelet ekleyin. 4 x 106 hücre/mL (Bu tutar bir 100 mm plaka için iyidir) son hücre konsantrasyon için ses düzeyini ayarlayın.
      Not: Örneğin, cryovial, başına 4 x 106 hücre hücre çözümü 1 mL içeren her cryovial ile toplam 60 x 106 hücre oluşturan dört 150 mm plakalar dondur. Dört tabak verim yaklaşık 15 cryovials (60/4 = 15). Tanrı'nın ASKERLERİ'ni medya ve medya hücre Pelet, resuspend ve aliquot 1 mL her cryovial buz gibi x 2 7,5 mL 7,5 mL ekleyin.
    13. Yavaş yavaş dondurma medya hücre Pelet ile pipetting tarafından resuspend. Her cryovial için hücre çözümü 1 mL transfer ve buna göre etiket.
    14. Cryovials (Bu hücre survival artırır yavaş bir soğutma hızı sağlar) bir tepecikte polistren kutusunun içine yerleştirir. Kutuyu-80 ° C dondurucu için en az 24 saat cryovial için sıvı azot aktarmadan önce aktarın.
      Not: en iyi sonuç için hücrenin arasında 2 x dondurucu medya hücrelere ve şişeleri-80 ° C'ye aktarma saatin yanı sıra zaman sayma en aza indirmek

2. O9-1 hücre kültürü

  1. DMEM içinde aşağıdakileri ekleyerek O9-1 hücre kültürü için bazal ortam hazırlamak (son konsantrasyonları belirtilir): % 15 FBS, 0,1 mM minimum temel medya (MEM) gerekli olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin, 2 mM L-glutamin, 103 adet/mL lösemi inhibitör faktörü (LIF; kullanımdan hemen önce eklendi, hisse senedi biberondan eklemeyin) ve 25 ng/mL fibroblast büyüme faktörü-basic (bFGF; kullanımdan hemen önce eklendi, hisse senedi biberondan eklemeyin).
  2. Filtre bazal medya (gözenek boyutu 0,22 µm) sterilize ve ışıktan korumak için folyo şal.
  3. Klimalı bazal medya Inaktif STO hücreleri toplamak.
    Not: sadece Inaktif STO hücreleri alındıktan sonra devam edin. O9-1 bazal medya STO hücre plakalar toplanan bundan böyle şartına bazal medya olarak söz edilecektir.
    1. Tezcan inaktive STO hücreleri hızla yukarıda açıklandığı gibi (4 x 106 hücreleri içeren bir cryovial bir 100 mm plaka için iyi ve yaklaşık 100 mL şartına bazal medya toplama 10 gün sonra verim). Tohum STO hücreleri jelatin kaplı levha STO medyasını kullanarak inaktive olur. Hücreleri gecede standart bir oksijen kuluçka makinesine (37 ° C, % 5 CO2) eklemek izin verir.
    2. STO hücreleri, çözdürme sonra 24 h mevcut STO medya atmak ve bazal ortamı ile değiştirin.
      Not: LIF ve bFGF Inaktif STO hücre kültür yemekleri eklemeyin; Sadece O9-1 hücre kültür yemekleri için ekleyin.
    3. Her 24 h O9-1 bazal medyasını kullanarak medya değiştirmek ve bazal medya STO hücre plakalar bir şişe içine toplamak. Işıktan korumak için folyo şartına bazal ortamı içeren şişe kaydır. 4 ° C'de toplanan medya saklamak
      Not: hücreler inaktive çünkü onlar koleksiyon birkaç gün sonra yaptıkları gibi sağlıklı görünmüyor olabilir; Bu beklenen bir şey.
    4. İsteğe bağlı olarak kirlenme için kontrol etmek için Folyo sarılı bazal medya koleksiyonu hergün farklı tüpler (yerine bir şişe) için toplamak. 24-şey plaka kullanarak, her gün medyadan 1 mL her kuyunun içine yerleştirin ve gecede mikroskop altında bakteriyel kontaminasyon denetlemek için standart bir kuluçka kuluçkaya.
      Not: Hayır kirlenme ama değişiklikler bakteriyel kirlenme varsa sarı ise kırmızı bir renk medya kalır.
    5. Topladıktan sonra bazal medya şartına 10 gün boyunca STO hücreleri atın. Birleştirme (varsa) tüm koşullu bazal medya toplanan ve filtre sterilize (gözenek boyutu 0,22 µm) bir steril şişe içine. Işıktan korumak için folyo şişe kaydır. Filtre uygulanmış şartına bazal medya en fazla filtre tarihten bir ay 4 ° C'de tutun.

3. O9-1 hücreleri korumak

Not: Çalışma O9-1 bazal ortamdır filtre sterilize şartına bazal medyaya hangi LIF (son konsantrasyonu 103 adet/mL) ve bFGF (son toplama 25 ng/mL) hemen kullanmadan önce hücre kültür çanak için eklenir. Işıktan korunacak ve 4 ° C'de depolanan bu ortama gereksinim

  1. O9-1 hücre kurtarma
    1. Yavaş yavaş membran matris (Örneğin, Matrigel) hisse senedi şişe gecede 4 ° C aliquots hazırlamak için çözülme.
    2. DMEM 5 mL % 10 ile ekleyin FBS hisse senedi membran matris membran 5 ml. -20 ° C'de depolanan soğuk pipet ipuçları ile de pipetting tarafından mix Orijinal şişe ve aliquot tüpler buz üzerinde tutun. Aliquots deney gereksinimlerine bağlı olarak farklı birimlerdeki (0.5 mL veya 1 mL aliquots) dondur. Donma-çözülme membran matris birden çok kez kaçının.
      Not: membran matris hızla oda sıcaklığında polymerizes; soğuk pipet ipuçlarını kullanın ve tüpler kasıtsız polimerizasyon önlemek için çalışırken soğuk tutmak.
    3. Bir aliquot membran Matrix 4 ° C'de veya buz 2 h üzerinde deney başlamadan önce çözülme. 4 ° C'de matris uzun süre tutmayın.
    4. Filtre sterilize DMEM % 10 ile kullanmak FBS membran matris tabakaları kat için 0,5 mg/mL nihai bir konsantrasyon için sulandırmak için. 1 h. ( Şekil 1' de gösterildiği gibi) plaka tamamen gelebilmektedir sağlamak için oda sıcaklığında membran matris (0,5 mg/mL) ile plakalar kat.
    5. Plaka boyalı yüzeylere önlemek için membran matris aspirating zaman eğme; plakalar için 30 dk 37 ° C'de kuru. Kaplamalı plakalar aşırı kuru değil.
      Not: yalnızca tüm medya ve Reaktifler kullanıma hazır olduğunda devam (bazal medya, steril filtre % 10 şartına FBS DMEM, LIF ve bFGF).
    6. O9-1 hücreleri hızla bir 37 ° C su banyosunda cryovial yerleştirerek kurtarmak; yavaş yavaş şişeyi çözüm kadar tamamen sıvı döner girdap ve hemen sonraki adıma geçin.
    7. Tüm hücre çözümü 15 mL santrifüj tüpü cryovial (yaklaşık 1 mL) aktarın. DMEM 5 Cilt %10 ile eklemek FBS (0,22 µm filtre gözenek boyutu ile sterilize filtre) ve resuspend.
    8. 180 x gde 3 dk santrifüj. Süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. (Yanında pıtırtı) hücre Pelet şartına bazal medya LIF ve bFGF ile resuspend. Hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanma.
      Not: LIF ve bFGF ile desteklenmiş şartına bazal medya O9-1 hücre kültürünü multipotency korumak için önemlidir. Kasıtsız hücre farklılaşması önlemek için doğru ortam eklemek için kullanım bakım.
    9. 10.000 tohum hücrelerden 15.000 hücre/cm2 6-şey plaka. Gecede medya değiştirmeden önce hücreleri eklemek ve (37 ° C, % 5 CO2) bir standart hücre kültür kuluçka makinesine büyümeye izin.
    10. Hücreleri medya (sağlıklı ekli hücreleri bak bu Şekil 2' de gösterildiği gibi) değiştirmek için geçmeden önce eklenen emin olun.
    11. Her zaman kültür medya O9-1 hücreleri (LIF ve bFGF ile desteklenmiş şartına bazal medya kullanın) kurtarma sonra ertesi gün değiştirin.
  2. O9-1 hücreleri geçirilmesi
    1. O9-1 hücreleri % 80 confluency ulaştığınızda, membran matris çözülme ve matris kaplı membran plaka yukarıda açıklandığı şekilde hazırlayın. LIF ve bFGF gemisine ile takıma şartına bazal medya ekleyin. Alternatif olarak, DMEM membran matris kurumasını tutmak ve en fazla 3 gün için bir standart oksijen inkübatör içinde saklamak için FBS olmadan ekleyin.
    2. İçeren 1 O9 wells (6-şey plaka) Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) 2 mL ile iki kez durulama ve yavaşça hücreleri kaybetmemek için pipet.
    3. 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA 3 dk. nötrleştir tripsin DMEM eşit miktarda % 10 için 37 ° C'de hücrelerle ayırmak FBS. Tekrar tekrar sıvı plaka mümkün olduğunca çok sayıda hücre ayırmak için iyi bütün yüzey üzerinde pipette.
      Not: %0,25 yerine % 0.05 tripsin bölgedir. Hisse senedi şişeden sulandırmak için DPBS kullanın.
    4. Plaka hücrelerden dissociating zaman kabarcıklar oluşturulmasını engellemek.
    5. Tüm hücre çözümü bir santrifüj tüpü ve 180 x g, 3 dk santrifüj aktarın. Süpernatant hücre Pelet bozmadan Aspire edin. Hücre Pelet santrifüj tüpü nazik şartına bazal medya LIF ve bFGF ile pipetting tarafından resuspend.
    6. Bir hemasitometre yukarıda açıklandığı gibi toplam cep numarasını kullanın. 3.1.4-3.1.8 adımlarda açıklandığı gibi hazırlanan kuşe plaka tohum hücrelere (10.000-15.000 hücreler/cm2). 6-şey plaka bir şey tohum 100.000 hücrelere gerektirir.
    7. Hücreleri eklemek ve (37 ° C, % 5 CO2) bir standart hücre kültür kuluçka makinesine büyümeye izin. Her zaman kültür medya O9-1 hücreleri passaging sonra ertesi gün değiştirin.
  3. O9-1 hücrelerin dondurulması
    1. O9-1 hücreler için medya dondurma x 2 hazırlamak için aşağıda DMEM, seyreltik (son konsantrasyonları belirtilir): % 40 FBS ve % 20 DMSO.
    2. Filtre medya dondurma x 2 sterilize ve 4 ° C'de tutmak Ortam buz gibi x 2 kullanıldığı gün yapılmalıdır. Tüm kullanılmayan dondurucu medya atmak.
      Not: O9-1 hücreleri % 80 confluency, dondur.
    3. Wells DPBS ile iki kez durulayın; Pipet yavaşça hücreleri kaybetmemek için.
    4. Hücreler için 3 dk. 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA ile ayırmak, o zaman % 10 eşit miktarda tripsin nötralize FBS DMEM içinde. Tekrar tekrar sıvı plaka mümkün olduğunca çok sayıda hücre ayırmak için iyi bütün yüzey üzerinde pipette.
    5. Bütün plaka içeriği bir santrifüj tüpü ve 180 x g, 3 dk santrifüj aktarın. Süpernatant Aspire edin ve PBS 2 mL ekleyin ve dokunarak resuspend.
    6. Hücre çözümü 10 µL yukarıda açıklandığı gibi bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için kullanın.
    7. Hücre çözümü için 180 x g, 3 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve bazal medya gerekli miktarını ayarlamak; sonra 2 x dondurucu medya eşit miktarda ekleyebilirsiniz.
      Not: 1 x 106 hücre/mL (cryovial başına 1 mL) bir konsantrasyon, hücreleri donmuş.
    8. Hücreleri cryovials için transfer ve buna göre etiket. Cryovials için sıvı azot aktarmadan önce yavaş soğutma hızı en az 24 h için-80 ° C'de bir tepecikte polistren kutusu içine yerleştirin.
      Not: en iyi sonuç için hücre sayım zamanı ve 2 x medya donma ve şişeleri-80 ° C'ye aktarma ekleme arasında geçen zamanı en aza indirmek

4. O9-1 hücreleri manipülasyon

  1. O9-1 hücrelerde siRNA nakavt gerçekleştirme
    1. Çözülme ve deney başlamadan önce (adımları 3.1.4–3.1.8) açıklandığı gibi bir 24-şey plaka membran matris ile ceket. Yeniden elde etmek ve onları % %80 60'a confluency büyümeye izin O9-1 hücreleri temel olarak belirler.
    2. Serum-ücretsiz medya uygun iyi hacmine göre lipozomlar sulandırmak. SiRNA serum-ücretsiz medya final sulandırmak. Üretici tarafından önerilen bir oranda seyreltilmiş lipozomlar seyreltilmiş siRNA ekleyin. De pipetting tarafından mix ve kuluçkaya.
      Not: kullanılan birim, zaman ve sıcaklık, kuluçka üreticinin kılavuz izleyin.
    3. Hücrelere göre üreticinin önerilerini ilgili birimlere siRNA-lipid karmaşık ekleyin.
    4. Hücreler için bir standart hücre kültür kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) 24 saat kuluçkaya. Aşağı akım adımları izleyerek uygun (özü RNA, özü proteinler, boyama, vs.)
      Not: siRNA devirme kez ve konsantrasyonları bireysel deney bağlı olarak değişebilir.
  2. CRISPR-Cas9 genom düzenlemeyi kullanarak O9-1 hücrelerde gen nakavt gerçekleştirme
    Not: CRISPR-Cas9 memeli hücre hatları29kullanmak için daha önce yayımlanmış protokolü için bakın. CRISPR-Cas9 genom düzenleme ve ilgili adımları basitleştirilmiş bir açıklama burada olması koşuluyla.
    1. SgRNA dizileri sgRNA tasarım aracı kullanarak elde.
    2. PSpCas9 için sgRNA ligate (bb) - 2a - GFP vektör30.
    3. O9-1 hücreleri vektör ile üreticinin önerilerini göre standart lipofection protokolünü kullanarak transfect.
    4. Hücreleri bir standart hücre kültür kuluçka %5 CO2 37 ° C'de 24 h için kuluçkaya.
    5. Floresans aktif hücre (FACS) GFP/7-AAD göre sıralama yapın. Tohum GFP + tek hücrelere 96-şey plakaları.
    6. Kuluçka makinesi hücrelerde bir ek 4 gün boyunca büyümeye. Birden fazla koloni var bütün wells atmak.
    7. PCR silme işlemini algılamak için tasarlanmış astar ile gerçekleştirin. PCR sonra PCR ürünleri Grup boyutu değerlendirmek için bir özel jel üzerinde çalıştırın. CRISPR-Cas9 editingby ( Yap nakavt sonuçları örneği Şekil 3' te gösterilen) Western blot performans kullanılarak elde nakavt verimliliği doğrulayın.

5. O9-1 hücre farklılaşması

  1. O9-1 hücrelere farklılaşma dokusunu içine
    1. Osteojenik farklılaşma ortam hazırlamak için aşağıda Alfa-MEM, seyreltik (son konsantrasyonları belirtilir): 0,1 mM deksametazon, 100 ng/mL kemik morfogenetik protein 2 (BMP2), 50 µg/mL askorbik asit, 10 mM b-gliserofosfat, % 10 FBS, 100 U/mL Penisilin ve 100 mg/mL streptomisin.
    2. Osteoblast marker, osteokalsin, Şekil 4' te gösterildiği gibi immunostaining tarafından farklılaştırılmış dokusunu tespit edebilir.
      Not: Osteojenik farklılaşma Alizarin kırmızı boyama veya alkalen fosfataz boyama ile dokusunu veya diğer işaretleri kullanarak da değerlendirilebilir.
  2. O9-1 hücrelere farklılaşma kondrosit içine
    1. Kondrosit farklılaşma ortam hazırlamak için aşağıda Alfa-MEM, seyreltik (son konsantrasyonları belirtilir): % 5 fetal buzağı serum (FCS), % 1 insülin-transferrin-selenyum (ITS), 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin, 10 ng/mL dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-b3), 50 mg/mL askorbik asit, 10 ng/mL BMP2, 0,1 mM deksametazon ve 1 mM sodyum pyruvate.
    2. İlk kültür monolayer O9-1'in bir osteojenik medya ile 3 gün boyunca hücreleri trypsinize ve kondrosit farklılaşma medya micromass biçimlerinde bir izleyen 7 gün boyunca kültür.
    3. Alcian mavi boyama veya kondrosit işaretleri ile eşek chondrogenic farklılaşma.
  3. O9-1 hücrelere farklılaşma düz kas hücreleri
    1. Düz kas hücre farklılaşması ortam hazırlamak için aşağıda DMEM, seyreltik (son konsantrasyonları belirtilir): 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve % 10 FBS.
    2. Eşek düz kas hücre farklılaşması ile ayirt işaretleri gibi düz kas aktin (SMA), düz kas hücrelerinin karşı antikor kullanarak bir örnek olarak Şekil 5gösterilen boyama.
  4. O9-1 hücrelere farklılaşma gliyal hücreye
    1. Gliyal hücre farklılaşması ortam hazırlamak için aşağıda DMEM/F12, seyreltik (son konsantrasyonları belirtilir): 1 x B-27 ek, 2 mM L-glutamin, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin, 50 ng/mL LIF ve % 1 ısı FBS inaktive.
    2. Gliyal hücre farklılaşması ayirt gliyal hücreye işaretleri gibi yağ asidi bağlayıcı protein 7 (FABP7) karşı antikor ile boyama işlemi yaparak değerlendirin.

Sonuçlar

Devirme ve nakavt deneylerimiz amacı Yap ve Taz kaybı--fonksiyonu O9-1 hücrelerdeki etkilerini incelemek oldu. Devirme ve nakavt deneyler önce emin olmak bazal medya ve (örneğin, Şekil 1ve kurtarılan O9-1 hücreleri gösterildiği gibi bütün tabağı kapsayacak şekilde membran matris ihtiyaçlarını yukarıda açıklandığı gibi kültür O9-1 hücreler için hazırlamak zorundayız sıvı azot Şekil 2

Tartışmalar

NCC sırasında embriyonik morfogenez farklı doku ve organların için çok yönlü ve önemli bir katkıda bulunuyor. O9-1 hücre kültürünü birçok farklı hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel tutar ve NCCs, yapım o gen fonksiyon ve moleküler NCCs Yönetmelikte çalışmak için yararlı vitro aracı vivo içinde özelliklerini taklit eder. O9-1 hücrelerinin farklı durum farklı nöral crest Döl içinde vivo, O9-1 hücre kültürü şartlarına bağlı olarak aynı olmayabili...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, Teksas Kalp Enstitüsü, Bilimsel yayınların editoryal destek sağlamıştır. Biz de aşağıdaki finansman kaynakları teşekkür: Amerikan Kalp Derneği'nin Ulusal Merkezi bilim adamı kalkınma hibe (J. Wang 14SDG19840000), (J. Wang için Rolanette ve Berdon Lawrence kemik hastalığı Texas Program 2014 Lawrence Araştırma Ödülü ) ve Ulusal Sağlık (DE026561 ve DE025873 J. Wang, DE016320 ve DE019650 R. Maxson için) Enstitüleri.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Active STO feeder cellsATCCATCC CRL-1503Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X
O9-1 mouse cranial neural crest cell lineMillipore SigmaSCC049
DMEM, high glucose, no glutamineGibco11960-044
DMEM, high glucoseHycloneSH30243.01
FBS (fetal bovine serum)Millipore SigmaES-009-B
Penicillin - streptomycinGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
Gelatin from porcine skinSigmaG1890
Trypsin-EDTA 0.25% in HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) without calcium or magnesiumLonza17-512F
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
2-MercaptoethanolSigmaM-7522
ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/mLMillipore SigmaESG1106
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)R&D Systems233-FB-025
Mitomycin CRoche10107409001
Matrigel matrixCorning356234
DMSO (dimethylsulfoxide)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimum essential medium, alpha 1x with Earle's salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, & L-glutamineCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Non-targeting PoolDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (fetal calf serum)
ITS (insulin-transferrin-selenium)
TGF-b3
Ascorbic acid
BMP2 (bone morphogenetic protein 2)
Dexamethasone
B-27 supplement

Referanslar

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208 (2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetikyay n 140CRISPRCas9O9 1 h crelerigen nakavtgen devirmen ral crest h creleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır