JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede genel izolasyon, karakterizasyonu ve kardiyak kök hücreleri (CSCs) Yetişkin fare kalp farklılaşma için protokolü standartlaştırmak için hedeftir. Burada, fare CSCs yalıtmak için bir yoğunluk degrade Santrifüjü yöntemi ve CSC kültür, yayılmasını önleme ve farklılaşma cardiomyocytes içine hazırlanmış yöntemlerini açıklar.

Özet

Akut miyokard infarktüsü (mı) morbidite ve mortalite dünya çapında önde gelen nedenidir. Rejeneratif tıp ana amacı ölü Miyokardiyum MI sonra doldurmak etmektir. Her ne kadar çeşitli stratejiler Miyokardiyum yeniden oluşturmak için kullanılan, kök hücre tedavisi MI kalp ölü Miyokardiyum doldurmak için büyük bir yaklaşım kalır. Kanıt biriken yetişkin kalp ve kalp rejenerasyon endokrin ve/veya parakrin etkileri ikamet kardiyak kök hücreleri (CSCs) varlığını göstermektedir. Ancak, CSC yalıtım ve karakterizasyonu ve farklılaşma miyokard hücreleri, özellikle cardiomyocytes, doğru bir teknik sorun kalır. Bu da çalışmanın, yalıtım, karakterizasyonu ve CSCs farklılaşma yetişkin fare kalp için basit bir yöntem sağladı. Burada, CSCs nerede kalp % 0,2 collagenase II çözüm tarafından sindirilmiş, yalıtım için bir yoğunluk degrade yöntemi açıklanmaktadır. İzole CSCs ayırdetmek için CSCs/kalp işaretleri Sca-1, NKX2-5 ve GATA4 ve pluripotency/stemness işaretleri OCT4, SOX2 ve MicroRNAs ifadesi değerlendirilir. Biz de onları bir kabında kültür ve nükleer silahların yayılmasına karşı işaret Ki-67 ifade değerlendirirken izole CSCs yayılması potansiyelini belirledi. CSCs farklılaşma potansiyeli değerlendirmek için biz yedi - on - gün kültürlü CSCs seçildi. Biz onları cardiomyocyte farklılaşma orta ile yeni bir tabak transfer. Farklılaşma Orta üç günde değişti iken onlar 12 gün boyunca bir hücre kültür kuluçka makinesine inkübe. Cardiomyocyte özel işaretleri farklılaştırılmış CSCs hızlı: Aktinin ve troponin ı. Böylece, stemness ve kardiyak Marker CSCs bu iletişim kuralı ile izole var ve onlar için yayılma ve farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage bir potansiyele sahip.

Giriş

İskemik kalp hastalığı, akut miyokard infarktüsü (mı), dahil olmak üzere ölüm1dünya çapında önemli bir nedenidir. Ölü Miyokardiyum Yenileyici için kök hücre tedavisi bir mı kalp2,3,4,5kardiyak fonksiyon geliştirmek için önemli bir yaklaşım kalır. Kök hücrelerin farklı türleri ölü Miyokardiyum doldurmak için ve bir MI kalp kardiyak fonksiyon geliştirmek için kullanılmıştır. Embriyonik kök hücre6 ve yetişkin kök hücre genel olarak sınıflandırılabilir. Yetişkin kök hücre, kök hücre türleri, mononükleer hücreler kemik iliği elde edilen7,8, kemik iliği9dan,10, yağ dokusu elde edilen mezenkimal kök hücre gibi kullanılmıştır 11,12ve göbek kordonu13ve CSCs14,15. Kök hücre den endokrin ve/veya parakrin eylemler16,17,18,19,20kardiyak rejenerasyon yükseltebilirsiniz. Ancak, kök hücre tedavisi büyük bir sınırlama çoğalırlar ve/veya doğru belirli kardiyak lineage21,22ayırt kök hücreleri yeterli sayıda almaktır. Otolog ve allojenik kök hücre nakli kök hücre tedavisi9önemli bir sorundur. CSCs onlar yürekten türetilmiştir ve onlar daha kolay kalp soy kalp kök hücreler farklı çünkü kardiyak rejenerasyon için daha iyi bir yaklaşım olabilir. Böylece, teratoma riskini azaltır. Buna ek olarak, CSCs, endokrin ve parakrin etkileri exosomes ve CSCs türetilmiş miRNAs gibi daha kök hücreler diğer tür daha etkili olabilir. Böylece, CSCs kardiyak rejenerasyon23,24için daha iyi bir seçenek kalır.

CSCs MI kalp kalp kökenlerine nedeniyle kardiyak rejenerasyon için daha iyi bir aday olmakla birlikte, önemli bir sınırlama CSCs ile daha az verimli yalıtım yöntemini eksikliği nedeniyle verimidir. Başka bir sınırlama CSCs Engelli farklılaşma cardiomyocytes lineage2,25,26,27doğru olabilir. Bu sınırlamaları aşmak için CSC yalıtım, karakterizasyonu ve farklılaşma kardiyak lineage doğru için verimli bir iletişim kuralı geliştirmek önemlidir. CSCs yok tek kabul edilebilir işaretçisi ve bir belirli hücre yüzeyine marker tabanlı yalıtım CSCs, daha az CSCs verim. Burada, düşük maliyetli ve CSCs artan bir verim içinde sonuç fare kalp CSCs yalıtmak için bir basit degrade Santrifüjü yaklaşım standartlaştırmak. Bu izole CSCs floresans aktif hücre kısa devre tarafından belirli hücre yüzeyine işaretler için seçilebilir. CSCs yalıtım ek olarak, biz CSC kültür, karakterizasyonu ve farklılaşma doğru cardiomyocyte lineage için bir protokol sağladı. Böylece, biz izole, karakterize, kültür ve CSCs yetişkin fare kalpler (Şekil 5) ayırt etmek için zarif bir yöntem mevcut.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Konut, anestezi ve kurban farelerin Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi onaylı IACUC protokolüne yapıldı.

1. malzeme

  1. Kullanım 10 - için 12-hafta-yaşlı C57BL/6J siyah erkek fare, kurumsal hayvan tesis, CSCs. CSCs yalıtım için şirket içinde muhafaza-ebilmek da gebe olmayan dişi fareler izole edilmesi.
  2. Cerrahi makas, iyi cerrahi makas, eğri şaftlı forseps ve cerrahi bir bıçak, ısıyla tarafından da dahil olmak üzere tüm gerekli cerrahi aletler, sterilize fare ötenazi önce.
  3. CSC yalıtım arabellekleri sterilize koşuldaki hazırlamak ve onları buz üzerinde 4 ° C'de depolayın. Polysucrose ve 1.077 g/mL bir yoğunluk için ayarlanmış bir sodyum diatrizoate çözüm bu arabellekleri içerir, kartal'ın orta eksik Dulbecco'nın değiştirilmiş, 1 x Ham'ın dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ve kültür-grade 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x hücre. (Filtre uygulanmış ve sterilize) bir % 1 collagenase II stok çözüm ve HBSS içinde % 0,2 çalışan bir çözüm hazırlamak.
  4. Biyogüvenlik steril durumda doku kültürü malzeme dolabı, bir 10 mm Petri, 6-şey plaka, bir 24-şey plaka, T-25 ve T-75 kültür şişeler, 15 mL ve 50 mL konik tüpler ve tek kullanımlık serolojik Pipetler ile 40-µm ve 100 gibi tutmak -µm hücre süzgeçler 0,22-µm filtreleri ile.
  5. 10 µL, 200-µL ve 1.000-µL pipet ipuçları otoklav tarafından sterilize.
  6. Pudrasız nitril eldiven ve % 70 etanol steril bir koşulu deneme boyunca korumak için kullanın.
  7. % 10 çamaşır suyu bir dezenfektan olarak kullanın.
  8. Piyasada bulunan CSC bakım orta ve cardiomyocytes farklılaşma orta kültür ve CSCs, farklılaşma için sırasıyla kullanın.

2. izolasyon yöntemi kardiyak kök hücre

  1. 4-5 Yetişkin erkek (veya gebe olmayan kadın) ötenazi CO2 odası kullanarak fare. Her fare silah ayrı diseksiyon karton üzerinde bağlantıları veya yapışkan bantlar ile düzeltmek.
  2. % 70 etanol dış mikrop kurtulmak ve kalbinde hasat sırasında steril durumu korumak için fareyi sprey. Karın ortasında makasla bir kesi yapmak ve düz bir çizgide kadar toraks karın derisini kesti. Cilt cilt ve saçlar karın bölgesi temizlemek için orta kesim her iki taraftan kaldırın. Makas ve cımbız kullanarak, göğüs kafesi altındaki diyafram kesti.
  3. Göğüs boşluğuna fare kafesi başlık içinde keserek açın. Kalp maruz ve kanın kalp yanına kaldırmak. Çevresi kalp kalp çevresinde hiç kan kurtulmak için buz gibi PBS ile yıkayın.
  4. Cerrahi makas ve cımbız kullanarak kalp incelemek. Buz gibi PBS 10 mL içeren 100-mm Petri kabına kalbinde bir yer.
  5. Eğri şaftlı forseps kullanarak kalp palpitate ve kalan kan kalbin içindeki kaldırın.
  6. Bütün kalp CSCs yalıtımı için kullanma.
  7. Tüm dört ya da beş tüm kalpleri bir 50 mL konik tüp buz gibi HBSS 10 mL içeren aktarın. Tüp buz üzerinde daha fazla işleme kadar tutun.
  8. İçinde ve dışında bir Biyogüvenlik steril bir ortam oluşturmak için % 70 etanol ile kabine silin. Kalp içeren tüp ve diğer gerekli malzemeler % 70 etanol ile sterilize. Kalp içeren tüp Biyogüvenlik kabine için daha fazla alay yerleştirin.
  9. Kalplerini buz gibi HBSS 10 mL içeren bir 100-mm Petri kabına aktarın. Kalbini tekrar kalbin içindeki herhangi bir kalıntı kan kaldırmak için palpating yıkayın. HBSS çözüm kan tümüyle kaldırılmasını sağlamak için her yıkama sonra değiştirin.
  10. Kalpleri bir 100-mm 5-7 mL HBSS çözeltisi içeren kabında iyi cerrahi makas veya cerrahi bir bıçak kullanarak küçük parçalar halinde kes. Forseps ile per: her kalp ve kalp 2 - 4 mm parçalar halinde kesmek için bir çift cerrahi iyi makas veya cerrahi bir bıçak kullanın. Sık sık kan-Alerjik HBSS emin olmak için HBSS çözüm değiştirin. HBSS çözüm kalbimizde kıyma.
  11. 500 x g 5 dk. atma için 4 ° C'de, kıyılmış doku süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet tutun.
  12. Pelet 5-6 mL % 0,2 collagenase II çözeltisi 50 mL konik tüp içinde resuspend. Collagenase çözüm hacmi neredeyse 1.5 - için 2 - kat Pelet hacmi olmalıdır.
    Not: doku, ben ve 2.5 U/mL dispase çözüm % 0,2 collagenase II değiştirebilirsiniz % 0,2 collagenase sindirim için. Dispase çözüm collagenase için neredeyse eşit bir hacmi kullanın ben çözüm.
  13. Tüp Tantanacı veya 45-60 dk 37 ° C'de bir shaker-75 x g de televizyonda sallanan Pelet % 0,2 collagenase II çözüm ile iyice karıştırın Tüp el ile lizis geliştirmek için her 20-30 dakika sonra şiddetle çalkalanır.
  14. 5 mL serolojik pipet ve 1 mL pipet ucu doku yumru tek hücre süspansiyon ayırmak için lysed doku karışımının triturate.
    Not: CSCs en fazla iyileşme elde etmek için en az 5 min için lizis karışımı triturate. Doku topaklar nispeten büyük iseniz, 1 mL pipet ucu ucu makas veya cerrahi bir bıçak ile kesmek ve toz için kullanabilirsiniz.
  15. Doku enzimatik lizis ticari olarak temin CSC bakım orta ekleyerek durdurmak. Neredeyse 2-3 x kadar bakım orta adım 2,14 lysed doku hacmi olarak ekleyin.
  16. Sindirilir hücre süspansiyon herhangi bir sindirilmemiş doku parçaları kaldırmak için 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
  17. 40-µm hücre süzgeç kullanarak 2,16 arasındaki adımları yineleyin.
  18. Yoğunluk gradient Santrifüjü ile hücreleri ayırın. Hücreleri ayırma için hafifçe polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm üzerinde filtrate eşit bir hacmi yerleşimi. Örneğin, ilk olarak, bir 50 mL konik tüp içinde 20 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate çözeltisi ekleyin ve sonra filtrate 20 mL polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm 2.17 adımından ekleyin.
    Not: Prewarm polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm daha önce 37 ° C'de hücreler ile kullanın. Filtrate çok dikkatli ve yavaş adım 2.17 polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm üzerine eklemek herhangi bir iki çözümleri karıştırma önlemek için. Bu çok önemli bir adım olarak kabul edilir.
  19. Her iki çözüm de 500 x g bir salıncak kova santrifüj kullanarak oda sıcaklığında 20 dakika için de içeren tüp santrifüj kapasitesi. Santrifüj iki çözüm karıştırma önlemek için daha düşük bir yavaşlama hızlanma ve hız ve uygun CSCs ayrılması için ayarlayın. CSC izolasyon önemli bir adımdır. Çok yavaş santrifüj içinde karışıklık olmadan degrade karışımı içeren tüpü yerleştirmek ve Santrifüjü için ayarlayın.
  20. Buffy kat ilave bir 15 mL steril tüpe 1 mL pipet ya da plastik bir Pasteur pipet kullanarak üst katmanı çözümden birlikte dışarı çıkar. Buffy bu katman CSCs içerir.
    Not: CSCs için toksik olduğu için polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm katmanı almaya buffy kat pipetting sırasında ilave tedbirleri almak.
  21. CSC bakım orta eşit bir birim hücre süspansiyon 2.20 adımından ve düzgün kalan polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm, etkisiz hale getirmek için varsa karıştırın.
  22. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de yukarıdaki hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
  23. Pelet 7-10 mL eksik DMEM orta resuspend ve 500 x g 4 ° C'de herhangi bir kalıntı polysucrose ve sodyum diatrizoate çözüm kurtulmak için 5 min için de santrifüj kapasitesi.
  24. Arıtılmış CSCs içerir Pelet toplamak.
  25. Pelet CSC bakım orta 1 mL resuspend, CSC saymak ve Pelet kültür için kullanın. CSC saymak için Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanın. Dört erkek fareler kalpleri ile ~1.8 milyon CSCs verimidir.
  26. Tohum bir 6-şey kültür plaka CSCs bir %0.02 jelatin çözüm içeren % 0.5 fibronektin kaplı. Tam bakım Orta 2 mL tohum için kullanın. Kültür plaka bir kuluçka %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
  27. Kültür CSCs orta ile tam CSC bakım orta üçüncü güne kadar her gün değiştirin. Bundan sonra diğer günlerde orta değiştirin.
  28. CSCs büyüme mikroskop altında gözlemleyerek belirlemek.

3. kültür bakım ve kardiyak kök hücre geçirilmesi

  1. Kültür bir piyasada bulunan bakım orta izole CSCs. Kültür orta diğer günlerde taze bakım orta ile değiştirin. CSC kültür confluency ulaştığında CSCs jelatin ve fibronektin, ile kaplı bir yeni plaka adım 2.26 belirtildiği gibi aktarın. Kültürlü CSCs enzimatik hücre ayrılma arabellek ayırmak. Hücre ayrılma standart protokol kültür plaka izleyin. Bu aşamada, CSCs geçiş 0 (P0) sahne olarak kabul edilir.
  2. Kültür P0 CSCs içinde yeni bir jelatin ve fibronektin kaplı plaka tam CSC bakım orta % 5 CO2 kuluçka, 37 ° C'de bunları konfluent izin ve adım geçiş 1 (P1) CSCs. Store P1 CSCs sıvı azot almak veya deney için kullanmak için 3.1 izleyin ments.
  3. 6-şey plaka veya onun ilk aşamada CSC kültürü korumak için T-25 hücrelerde 1 milyon tohum 0.5 milyon hücreler.
  4. Geçit onlar % 85-%90 birleşmesi olunca CSCs. CSCs bakım orta dört ila altı hafta kadar kültürlü.
    Not: daha düşük bir tohumlama yoğunluğu CSCs onların morfolojisi düz ve uzun değiştirmek için CSCs nispeten yüksek (% 40-%50) ilk tohumlama yoğunluğu tutun.

4. kardiyak kök hücrelerin karakterizasyonu

  1. Kültürlü CSCs karakterize etmek için onları fajının kontrast veya alan parlak mikroskop altında gözlemlemek. CSC içeren plaka floresan mikroskop amaçta yerleştirin. Hücreleri odaklanmak için büyütme oranını oldukça düşük (10 X) ayarlayın. Faz kontrast diyafram hücreleri gözlemlemek için kullanın. 20 X büyütme objektif lensi değiştirerek artırmak ve CSCs. artış hedefi 40 X görüntü ve CSCs görüntü. İki gün, CSCs neredeyse yuvarlak şekil, ama zamanla ve yedi gün içinde hücre artar boyutu görünür, CSCs şekli (Şekil 1A - 1 C) neredeyse silindirik görünür.
  2. CSCs immunostaining işaretli pluripotency/stemness (OCT4, SOX2 veya MicroRNAs) yayılması (Ki-67) (Şekil 2A - 2B) ve kardiyak kökenli/progenitor hücreler (Sca-1, NKX2-5 veya GATA4) gerçekleştirmek (Şekil 3A - 3 C).
    1. CSCs immunostaining için bir 24-şey kültür plaka 10.000 CSCs tohum.
    2. (18-24 h) sonra ertesi gün CSCs 300 µL % 4 paraformaldehyde 10 dk için fix.
    3. Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.
    4. CSCs 0,2 Triton X-100 10 dakikadır PBS içinde seyreltilmiş % 300 µL ile permeabilize.
    5. Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.
    6. CSCs PBST içinde seyreltilmiş % 1 BSA 300 µL ile engelleme gerçekleştirmek (PBS + %0,1 ara 20) veya 1 h için PBST içinde seyreltilmiş % 10 normal tavuk serum 300 µL.
    7. Birincil antikor çözüm gecede 4 ° C'de engelleme seyreltilmiş 200 µL CSCs kuluçkaya Birincil antikor antikor veya standardizasyon göre veri sayfası tarafından tavsiye edilen şekilde sulandırmak.
    8. Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.
    9. İkincil antikor çözüm engelleme seyreltilmiş 200 µL CSCs kuluçkaya (bkz. Adım 4.2.6) Oda sıcaklığında 1 h için. İkincil antikor antikor veya standardizasyon göre veri sayfası tarafından tavsiye edilen şekilde sulandırmak.
    10. Buz gibi PBS, 500 µL ile CSCs yıkama 3 x 5 dk aralıklarla.
    11. CSCs DAPI 200 µL ile counterstain (1 µg/mL) seyreltilmiş PBS için 5 dak.
    12. CSCs 1 yıkama x 500 µL buz gibi PBS ile. Daha sonra buz gibi PBS 300 µL her kuyuya ekleyin.
    13. Bir floresan mikroskop kullanarak görüntüleme gerçekleştirmek. Imaging, plaka üzerinde doğrudan güneş ışığı önlemek gibi floresan yönergeleri izleyin. Kültür plaka mikroskop altında tutun. Hücreleri farklı büyüklüklerde, odaklan. Faz kontrast ve/veya farklı uyarma filtreleri altında hücreler gözlemlemek ve görüntüleri kaydetmek.
    14. Plaka karanlıkta 4 ° C'de depolayın

5. Cardiomyocyte içine kalp kök hücre farklılaşma

  1. CSCs farklılaşma için bir 6-şey plaka 2 mL prewarm (37 ° C) ticari olarak temin CSC bakım orta ile 500.000 CSCs tohum.
  2. CO2 kuluçka 37 ° C'de CSCs içeren plaka kuluçkaya CSCs kadar alt konfluent büyüme çoğalırlar ve takmak izin verir. Orta sarı dönüşürse, kültür orta ile taze bakım orta yerine.
  3. % 85-%90 confluency prewarm (37 ° C) cardiomyocytes 2 mL ile bakım orta yerine farklılaşma orta. Plaka CO2 kuluçka 37 ° C'de 2-3 haftaya kadar kuluçkaya.
  4. Her 2-3 ö gözlemlemek CSCs morfoloji iyi kültür koşulları sağlamak için değiştirmek her zaman orta sırasında mikroskopla farklılaşma orta değiştirin.
  5. CSC kültür farklılaşma orta 12 d sonra görüntü CSCs standart bir immunostaining takip ayırt etme belirteçleri için protokol (adımlara 4.2.1 - 4.2.14 bakın). Cardiomyocytes işaretleri (Şekil 4A - 4B) bir ifade için floresan görüntüleri kaydetmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu da çalışmanın, CSCs 10 - için 12-hafta-yaşlı C57BL/6J erkek fareler kalpler izole. Burada, biz CSC yalıtım ve pluripotency işaretçileri kullanarak karakterizasyonu için basit bir yöntem sundu. Biz de CSC farklılaşma için zarif bir yöntemi ve cardiomyocytes lineage doğru Ayrıştırılan CSCs karakterizasyonu sundu. Biz 2 için 3-gün-kültürlü CSCs (Şekil 1A ve 1B) faz kontrast mikroskop altında bir Milli şekil morfo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu CSC yalıtım protokol kritik adımları aşağıdaki gibidir. 1) steril bir koşul fareler kalplerin çıkarılması için muhafaza edilmelidir. Kalp ayıklama sırasında herhangi bir kirlenme CSCs. 2 kalitesini bozabilir) kan tamamen birkaç yıkar bütün kalp ve kalp tarafından HBSS çözüm taşlarla yapılır kalp kıyma önce kaldırılmalıdır. 3) kalp parçaları tamamen içine bir tek hücre süspansiyon collagenase çözüm ile lysed gerekir. 4) polysucrose ve sodyum diatrizoate degrade çözüm hücrele...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser, parçalar, HL-113281 ve HL116205 Paras Kumar Mishra için Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe tarafından desteklenir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
MiceThe Jackson laboratory, USAStock no. 000664
Antibodies:
OCT4-Abcamab18976 (rabbit polyclonal)OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2Abcamab97959 (rabbit polyclonal)SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NanogAbcamab80892 (rabbit polyclonal)Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67Abcamab16667 (rabbit polyclonal)Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca IMilliporeAB4336 (rabbit polyclonal)Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (goat polyclonal)NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4Abcamab84593 (rabbit polyclonal)GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2CSanta Cruzsc-13268 (goat polyclonal)MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin IMilliporeMAB1691 (mouse monoclonal)Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ActininMilliporeMAB1682 (mouse monoclonal)Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANPMilliporeAB5490 (mouse polyclonal)ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbitLife technologyRef no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbitLife technologyRef no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goatLife technologyRef no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouseLife technologyRef no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goatLife technologyRef no. A21468
NameCompanyCatalog NumberComments
Culture medium:
CSC maintenance mediumMilliporeSCM101Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation mediumMilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
Collagenase ISigmaC0130
Dispase solutionSTEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermoscientificA1110501
Other reagents:
BSASigmaA7030
Normal checken serumVector laboratoryS3000
DAPI solutionApplichemA100,0010Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blueBiorad145-0013
TrypsinSigmaT4049
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher ScientificA1110501
FormaldehydeSigma158127
Triton X-100ACROSCas No. 900-293-1
Tween 20Fisher SceintificLot No. 160170
EthanolThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue culture materials:
100 mm petri dishThermo Scientific
6-well plateThermo Scientific
24-well plateThermo Scientific
T-25 flaskThermo Scientific
T-75 flaskThermo Scientific
15 ml conical tubeThermo Scientific
50 mL conical tubeThermo Scientific
40 µm cell stainerFisher Scientific22363547
100 µm cell stainerFisher Scientific22363549
0.22 µm filterFisher Scientific09-719C
10 mL syringBDRef no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tipsFisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipetteThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
Centrufuge machineThermo ScientificLEGEND X1R centrifuge
EVOS microscopeLife technology
Automated cell counterBiorad
Cell counting slideBiorad145-0011
Pippte aidThermo ScientificS1 pipet filler
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Instruments:
Surgical scissorsFine Scientific Tool
Fine surgical scissorsFine Scientific Tool
Curve shank forcepsFine Scientific Tool
Surgical bladeFine Scientific Tool

Referanslar

  1. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146(2017).
  2. Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review. The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).
  3. Emmert, M. Y., et al. Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model. Biomaterials. 122, 48-62 (2017).
  4. Silvestre, J. S., Menasche, P. The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure. EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).
  5. Terzic, A., Behfar, A. Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency. Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).
  6. Yamada, S., et al. Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy. Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).
  7. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).
  8. Vrtovec, B., et al. Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up. Circulation Research. 112, 165-173 (2013).
  9. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).
  10. Guijarro, D., et al. Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial. International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).
  11. Bobi, J., et al. Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction. Journal of the American Heart Association. 6, (2017).
  12. Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease. World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).
  13. Gao, L. R., et al. Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial. BMC Medicine. 13, 162(2015).
  14. Simpson, D. L., et al. A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts. Circulation. , S46-S53 (2012).
  15. Kazakov, A., et al. C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload. Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).
  16. Ong, S. G., et al. Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer. Circulation. 130, S60-S69 (2014).
  17. Sahoo, S., Losordo, D. W. Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction. Circulation Research. 114, 333-344 (2014).
  18. Zhang, Z., et al. Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair. Journal of the American Heart Association. 5, (2016).
  19. Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy. Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).
  20. Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair. Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).
  21. Menasche, P. Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).
  22. Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
  23. Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration. PLoS One. 6, e25265(2011).
  24. Cambria, E., et al. Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types. NPJ Regenerative Medicine. 2, 17(2017).
  25. Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet? Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).
  26. Garbern, J. C., Lee, R. T. Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration. Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).
  27. Oh, H., Ito, H., Sano, S. Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases. Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).
  28. Smith, A. J., et al. Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart. Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).
  29. Rutering, J., et al. Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells. Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).
  30. Saravanakumar, M., Devaraj, H. Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart. Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).
  31. Monsanto, M. M., et al. Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy. Circulation Research. 121, 113-124 (2017).
  32. Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles. European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).
  33. Dergilev, K. V., et al. Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs. Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).
  34. Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts. Circulation. 121, 1992-2000 (1992).
  35. Wang, H., et al. Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue. BMC Biotechnology. 14, 75(2014).
  36. Smits, A. M., et al. Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology. Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyolojisay 143ani kalp durmas 1OCT4MicroRNAsKi 67NKX2 5GATA4 Aktinintroponin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır