Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Özet

Biz floresan etiketlemeyi yüzeysel geçirme yöntemleri tarif Hücre çoğalmasıyla tarafından ve geçiş görselleştirmek için bir düz-mount kültür etiketli hücre hareketinin hızlandırılmış görüntüleme için hücre gelişmekte olan piliç optik tectum davranış .

Özet

Hızlandırılmış görüntüleme geçirme hücre davranış analiz etmek için güçlü bir yöntemdir. Etiketleme floresan hücre sonra etiketli hücre kültüründe hareket video mikroskobu altında kaydedilir. Gelişmekte olan beyin hücre göç analiz için dilim kültür, hücre göç radyal hücre geçiş gibi dilim bölümüne paralel gözlemlemek için yaygın olarak kullanılır. Ancak, sınırlı bilgi hücre göç teğet hücre geçiş gibi dilim bölümüne dikey analiz etmek için dilim kültür yönteminden elde edilebilir. Burada, gelişmekte olan piliç optik tectum geçişinde teğet hücre görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüleme iletişim kurallarını mevcut. Hücre çoğalmasıyla ovo içinde ve bir sonraki düz-mount kültür üzerine hücre kültür yerleştirin etiketleme bir arada yatay düzlemde geçirme hücre hareketinde tespiti sağlar. Ayrıca, bizim Yöntem, tek tek hücre davranış ve bir grup hücreyi toplu eylem uzun vadede kolaylaştırır. Bu yöntem yapının floresan etiketli mikro-aksonal uzama olmayan sinir dokusu sinir doku veya hücre deplasman dahil olmak üzere sıralı değişikliği algılamak için potansiyel olarak uygulanabilir.

Giriş

Hücre göç çalışmanın ilerleyen canlı görüntüleme tekniği ile ilerleme. Etiketleme floresan hücre sonra etiketli hücre kültür çanak veya vivo içinde geçici hareket video mikroskobu altında kaydedilir. Sinirsel gelişim çalışmada, hücreleri geçiş veya aksonlar elongating morfolojik değişiklikleri analiz edilmiştir hızlandırılmış Imaging'i kullanma. Etkin görüntüleme için deney ve analiz amacına bağlı floresan hücre ve doku etiketleme hazırlık için uygun bir yöntem uygulamak esastır. Gelişmekte olan beyin hücre göç analiz için dilim kültür hücre göç gibi radyal hücre geçiş^1,2,3dilim bölümüne paralel gözlemlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Dilim kültür sistemi de teğet hücre geçiş^4,5algılamak için kullanılır, ama nerede hücreleri dikey dilim bölümüne dağıtmak durumlarda yönlü analiz için uygun değildir.

Optik tectum radyal ve teğet hücre geçiş embriyonik gelişim sırasında oluşturduğu çok katmanlı bir yapı oluşur. Tectal tabaka oluşumu ventrikül bölgeden postmitotic nöronal öncü hücrelerinin radyal geçiş öncelikle bağlıdır ve gidecekleri katmanlarındaki Doğum tarihlerine ventrikül bölge⁶' ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Teğet göç gelince, daha önce iki gelişmekte olan bir piliç optik tectum orta ve yüzeysel katmanlarda geçişlerde streams bildirdi. E6 E8 sırasında Orta katmanlarında dorso-ventrally⁷çalıştırmak tectal efferent aksonlar axon bulunduğu dorsally veya ventrally kadar önde gelen bir işlemi ve ince sondaki işlemi ile bipolar hücreler göç eder. Bu axophilic geçişten sonra içine derin katmanlarda yer alan multipolar nöron hücreleri ayırt etmek. E7-E14 sırasında yüzeysel katmanlarda geçirme hücreleri yatay dallı önde gelen işlem ve dağılım birden fazla yönde⁸içine reform tarafından dağıtmak. Geçiş dağıtırken sonra ikinci hücre sonunda çeşitli türleri morfoloji yüzeysel nöronların ayırt etmek. Her iki durumda da, bir düz-mount kültür hücre hareketi pial yüzeyine paralel gözlemlemek için etkilidir.

Burada, teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik tectum^7,8görselleştirmek için hızlandırılmış görüntüleme için bir iletişim kuralı mevcut. Hücre çoğalmasıyla ovo içindeve bir sonraki düz-mount kültür üzerine hücre kültür yerleştirin etiketleme birlikte geçirme hücre hareketi ve geçiş yönünü tespiti sağlar. Bu yöntem, uzun vadeli ve bir grup hücreyi yatay düzlemde toplu eylem her iki tek hücre davranış algılama kolaylaştırmak için hedeftir.

Protokol

1. Elektroporasyon Ovo içinde

1. İfade plazmid DNA floresan yüksek konsantrasyon etiketleme için hazırlayın. DNA 200 mL bakteriyel kültürünün üreticinin iletişim kuralı (Tablo reçetesi) göre anyon-Satım sütunları kullanarak alkalin lizis yöntemi tarafından izole et. PCAGGS-EGFP ve pCAGGS-mCherryNuc 4 µg/µL her son bir konsantrasyon, karıştırın.
   Not: Plazmid DNA arıtma endotoksin-Alerjik Elektroporasyon için tercih edilebilir.
2. Yatay olarak 38 ° C'de % 70 bağıl nem içinde verimli tavuk yumurtası kuluçkaya.
3. 2.5 gün sonra 18 gauge iğne ile 20 mL şırınga kullanarak yumurta sivri tarafındaki Album (yumurta akı) 5 mL ortadan kaldırmak ve bant ile iğne deliği kapatın.
4. Yumurta kabuğu üst çapı 2 cm delik açıp stereomicroscope (sahne 17 Hamburger ve Hamilton⁹) altında embriyonun gelişim aşaması denetlemek için eğri makas ile kesme. Kaseti o deliği tekrar kapatın.
   Not: Bu adımı E2.5-E3.0 içinde herhangi bir zamanda yapılabilir. Adım 1.3 ve 1.4 üst kabuk artan embriyo ve kan damarlarının sıkı bir eki önlemek için yumurtayı embriyo seviyesi düşük.
5. Kuluçka E5.5 kadar devam edin.
6. Elektroporasyon önce 10 µL penisilin (100 adet/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) ve yapılan Mikropipetler içeren hızlı yeşil (25 mg/mL), 0,5 µL ile autoclaved fosfat tamponlu 10 mL serum fizyolojik renkli bahsedilen plazmid DNA'ın (PBS) hazırlamak Cam kılcal tüpler micropipette işlemci kullanarak. Gözenek enjeksiyon için DNA miktarına bağlı olarak uygun bir boyuta getirmek için micropipette distal ucu kesilmiş.
7. 2.5 cm çapında bir delik açın ve stabil stereo mikroskop altında yumurta ayarlamak için makas ile kapalı üst kabuk kesti. PBS birkaç damla yumurtanın içine ekleyin. Embriyo iki iyi forseps kullanarak kanama kapsayan allantoic membran akasındaki. Amnion embriyo başından kaldırın.
8. Bir microspatula ile baş dönüm, 0.1-1 enjekte bir micropipette kullanarak sol optik tectum ventrikül boşluğuna renkli DNA'ya μL bağlı bir emme borusu.
   Not: DNA enjekte deneme bilerek bağlıdır. Konsantre DNA çözüm lavabo ve ventrikül duvar boyunca ekleyebilirsiniz.
9. Optik tectumis hedef alan (Şekil 1, adım 1arasında) yerleştirilir bir çift forcep tipi elektrot (3 mm kare elektrotlar 7 mm mesafe ile) yerleştirin.
   Not: Electroporated anot tarafı için DNA'sı.
10. Şarj öncesi nabız 30 V, 1 ms 5 ms aralığı ve 6 V dört sonraki darbeleri ile nabız jeneratör kullanarak 10 ms aralığı ile 5 ms.
    Not: Elektronik koşulu büyüklük ve mesafe elektrot bağlıdır. Verimli transfection ulaşmak için güçlü olmalıdır, ancak hedef doku normal gelişimini sağlamak için mütevazı olması gerekir.
11. Teyp delikle mühür ve kuluçka devam. Elektrotlar albümin interdental bir fırça ile bir plastik tabak içinde kaldırmak için PBS emmek. 1.7-1,11 her yumurta için yineleyin.

2. düz-Mount kültür hücre ekleme

1. Bir gün önce düz-mount kültür, kaplamalı hücre kültür Ekle hazırlayın. Bazı hücre kültür ekler bir 10 cm hücre kültür tabak autoclaved distile su üzerinde yüzer. 8 µg/mL laminin ve 80 µg/mL poli-L-gece süzülüyor ekler hücre kültür CO₂ kuluçka 37 ° C'de bırakın ve ekler kapağı lizin bir çözüm yükleyin.
   Not: 4 ° C'de kaplamalı ekler ertesi gün saklanabilir
2. Kültür, E7.0 gününde, laminin-poli-L-lizin çözüm gelen Ekle Kaldır ve kültür orta (%60 indirimli serum orta, F12, % 10 fetal Sığır serum, %10 20 1.1 mL ile dolu bir cam alt çanak (Şekil 1Adım 2) eklemek yer % piliç serum, 50 adet/mL penisilin, 50 μg/mL streptomisin). Yemeğin hücre kültür CO₂ kuluçka makinesine 37 ° C'de tutmak.
   Not: Orta kültür süresi değişiklik olmadan üç gün boyunca kullanılabilir.
3. Kültür kurulum hazırlamak. Nemli odası birim % 40 O₂ ve %5 CO₂ (gaz denetleyicisi) 38 ° c (sıcaklık denetleyicisi) bir gaz akışını ters bir confocal mikroskopla ayarlayın.
4. Embriyo Başkanı makasla kesme. Dışarı kafa içine buz gibi Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 6-cm hücre kültür tabağına forseps ile çimdik.
5. İki iyi forseps kullanarak electroporated optik tectum izole et. Tectum bir plastik Damlalık ile buz gibi HBSS ile dolu başka bir çanak içine aktarın. Bir daire kesme olarak siyah silikon ile temel concaved cam tabak kullanın.
6. Floresans stereoskopik mikroskop altında etiketleme konumunu kontrol edin. Mikrocerrahi bıçakla etiketleme alanı çevreleyen tectal doku kesip. Doku yönünü tectum (ön-arka, ventral dorsal) emin olun.
7. Böylece pia yan Ekle'nin üzerine bağlı olduğu bir plastik Damlalık ile etiketlenmiş doku Ekle'nin üzerine aktarın. Tectal doku istenen yönde yatıyordu ve aşırı HBSS (Şekil 1Adım 2) kaldırın.
8. 2,4-2,7 diğer dokulara aynı hazırlamak için Ekle yineleyin. Ters confocal mikroskop (Şekil 1Adım 3) prewarmed odasında çanak yerleştirin.

3. zaman hata görüntüleme

1. Floresan etiketleme kontrol ve ters confocal mikroskop mikroskobik alanına odaklanmak. Lazer confocal birimleri başlatın ve örnekleme yönünü ve X ve y ekseni boyunca dokusunun bulunduğu alanı ayarlamak için confocal tarama deneyin. X 10 ya da 20 X objektif lens olmadan Daldırma yağ kullanın.
2. Tarama boyutu seçin (Örneğin, 512 x 512 dpi). Aralığı ve toplam z ekseni boyunca confocal tarama aralığını karar. 5 veya 10 µm aralığı 100 µm Aralık için al. Confocal görüntüleme ve süresi (Örneğin, 10 dk aralıklarla 48 h üzerinden) görüntüleme toplam zaman aralığını karar.
   Not: lazer fototoksisite önlemek için yüksek tarama boyutu uzun z aralığının kısa z aralıklarla veya uzun görüntüleme süresi sırasında kısa zaman aralıkları ile tarama yasaklamaktadır. Örneğin, bir yüksek tarama boyutu (Örneğin, 1024 x 1024 dpi) uygularken, z ekseni boyunca taramaları sayısını azaltın.
3. Confocal çalışan parametrelerinin açıklandığı 3.2 programı ve görüntüleme başlatmak küme.
4. Görüntüleme sonra her zaman noktasında hassas odak ayar ile z-yığın görüntüleri sağlamak için farklı z-ekseni, confocal görüntüleri birleştirmek.
5. Z-yığın görüntüleri farklı zaman-nokta ekleme ve AVI formatında hızlandırılmış bir film oluşturur.

Sonuçlar

Şekil 2 kayıt başlangıcından sonra bir süre (0, 9, 18, 27 h) adlı bir düz-mount kültür görüntülenmeyecektir yüzeysel teğet geçiş gösterir. Film 1 bir 28 saat 50 dk boyunca 10 dk aralıklarının hızlandırılmış bir filmdir. Çerçeve etiketlenmemiş alanı (Şekil 3A) geçirme hücrelere çerçevenin etiketli sol alt köşesinden odaklanan için seçilir. Geçirme hücre (GF...

Tartışmalar

Yukarıda açıklanan protokol yüzeysel katmanları^6,8' hücre göç algılamak için optimize edilmiştir. Sadece değişen Elektroporasyon (E4.5 E5.5) zamanlaması ve kültür başlangıcı ve (E6.0 E7.0) görüntüleme tarafından orta tabaka göç akışları (film 5)^6,7, algılamak için geçerlidir.

Sunulan yordamı etiketleme Hücre ç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF	MACHEREY-NAGEL	740422.5	endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe	TERUMO	SS-20ESZ
18 gauge needle	TERUMO	NN-1838R
Fast Green	Wako	061-00031
100x penicillin and streptomycin	Gibco	15140-122
glass capillary tube	Narishige	G-1
cell culture insert	Millipore	Millicell CM-ORG
Laminin	SIGMA	L2020	coating of culture insert
poly-L-Lysine	Peptide Institute	3075	coating of culture insert
glass bottom dish	Matsunami	D11130H
Opti-MEM	Gibco	31985-070	culture medium
F12	Gibco	11765-054	culture medium
fetal bovine serum	Gibco	12483	culture medium
chick serum	Gibco	16110082	culture medium
10xHBSS	Gibco	14065-056
microsurgical knife	Surgical specialties cooperation	72-1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
curved scissors	AS ONE	No.11
micropipette processor	SUTTER INSTRUMENT	P97/IVF
forceps-type electrode	BEX	LF646P3x3
pulse generator	BEX	CUY21EX	electroporator
fluorescence stereoscopic microscope	Leica	MZ16F
inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
gas controller	Tokken	MIGM/OL-2
temperature controller	Tokai Hit	MI-IBC
laser confocal unit	Olympus	FV300