JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol için ant Vollenhovia emeryiiçin akraba evliliği haçlar iletken ve bu haçlar başarısını değerlendiren yöntemler açıklanmıştır. Bu protokoller seks belirlenmesi sistemlerinde Hymenoptera genetik temeli anlama amaçlayan deneyler için önemlidir.

Özet

Cinsiyet tayini cascade genetik ve moleküler bileşenleri balarısı, Apis mellifera, hymenopteran model organizma kapsamlı bir şekilde inceledik. Ancak, küçük karıncalar gibi diğer sigara modeli hymenopteran takson bulunan seks-belirleme mekanizmaları hakkında bilinir. Hymenopteran türler geliştiğini yaşam döngüleri karmaşık doğası nedeniyle, korumak ve bu organizmaların Laboratuvarı arasında deneysel haçlar yapmak zordur. Burada, akraba evliliği haçlar yürütmek için ve bu haçlar başarısında karınca Vollenhovia emeryideğerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Akraba evliliği emeryi V.kullanarak laboratuvar inducing, bu tür benzersiz biyolojisi nedeniyle oldukça kolaydır. Özellikle, bu tür androgenetik erkek üretir ve kadın reproductives genetik haçlar fenotipleri tanımlaması basitleştirir kanat çok biçimlilik sergilemek. Erkekler sürekli iken normal erkekler yalnızca iyi tanımlanmış bir üreme sezonunda alanında belirir. haçlar, akraba evliliği tarafından üretilmiş olması gibi Ayrıca, akraba evliliği başarısını değerlendirmek basittir. Bizim iletişim kuralı izin karınca türleri seks belirlenmesi sisteminde genetik ve moleküler temeli araştırmak için emeryi bir model olarak kullanmak için.

Giriş

Eusocial Hymenopteran takson, karınca ve arı gibi bir veya daha fazla tamamlayıcı seks belirlenmesi Heterozigoz hangi bireylerde (CSD) loci homo - ya da hemizygous olanları ise kadın olmak bir haplodiploid seks tayin sistemi geliştirmişlerdir olmak erkekler (Şekil 1A)1.

Genetik ve moleküler bileşenleri seks belirlenmesi cascade yer de balarısı, Apis mellifera, hymenopteran model organizma2,3,4inceledik. Son karşılaştırmalı genomik araştırmalar karıncalar ve arıları seks belirlenmesi yolu ilk seks belirlenmesi gene, csd5gibi birçok sözde homologs paylaşmak öneririz. Ancak, bu homologs fonksiyonel korunması için kanıt hala içinde karıncalar bulunmuyor.

Bu sorunu çözmek için akraba evliliği satırların genetik haritalama ve Moleküler çalışmalar için gerekli olduğu gibi gelişmiş olması gerekir. Ancak, korumak ve laboratuvar geliştiğini yaşam döngüleri karmaşık doğası nedeniyle bu organizmalar arasında deneysel haçlar yapmak zordur.

Burada, karıncalar6,7seks belirlenmesi sisteminde genetik ve moleküler temeli araştırmak için bir model olarak Vollenhovia emeryi kullanırız. Akraba evliliği satırları bu türün daha önce nicel Özellik loci (QTL) karıncalar6ilk kez seks belirlenmesi ile ilgili özellikleri için bağlantı eşleştirilmesine geliştirilmiştir. Ayrıca, moleküler cinsiyet tayini cascade incelenen7oldu. Bu tür gynogenesis ve androgenesis (Şekil 1B)8,9istihdam bir olağandışı üreme sistemi gelişmiştir. Clonally en yeni kız ve erkek anne ve baba tarafından genleri sırasıyla üretilmektedir. Buna ek olarak, işçi ve bazı kraliçeler cinsel üretilmektedir8. Bu üreme sistemi cinsel kullanılarak üretilen akraba evliliği haçlar queens üretilen ve erkekler için klasik bir backcross genetik olarak eşdeğerdir Çünkü genetik çalışmalar için özellikle uygundur. Cinsel olarak üretilen queens morfolojik anne genleri10 (Şekil 1B) üretilen queens farklı olduğundan, iletken ve akraba evliliği haçlar değerlendirilmesi büyük ölçüde bu yöntemi kullanarak basitleştirilmiştir.

Bu makaledeki yöntemleri geçiş testi için laboratuar koloniler kurulması için akraba evliliği uygulanması tam-sib çiftleri kullanılarak ve genotipleme koloni üyeleri ve erkek çoluk çocuk diseksiyon kullanarak bu haçlar başarısını değerlendirmek haçlar genital emeryi V.içinde açıklanmıştır.

İstihdam üreme sistemi ne olursa olsun, haçlar akraba evliliği, sık sık önemli ilk adım seks belirlenmesi Hymenoptera sistemlerinde herhangi bir soruşturma uygulamadır. Örneğin Cardiocondyla obscurioriçinde neredeyse tam-sib laboratuvarda çiftleşme, 10 kuşak sonra diploit erkek olmaması CSD locus11yokluğu gösterir. Akraba evliliği haçlar6,12,13' te üretilen erkeklerin oranı düşük CSD loci sayısını tahmin etmek mümkündür.

Protokol

1. toplama ve laboratuvar kolonilerde V. Emeryi bakımından alanından

Not: V. emeryi yuvalarının günlükleri ve düşmüş çürüyen ağaç Accuwest'in ikincil ormanlar boyunca Japonya çürüyen bulunur. Bu tür koloniler, Yani, (1) koloniler sadece uzun kanatlı kraliçeler ve (2) koloniler esas olarak kısa kanatlı kraliçeler uzun kanatlı kraliçeler8,14az sayıda ek olarak üreten üreten iki tür gösterir. Bu protokol için Ishikawa ili, Japonya kolonilerde bu türdeki toplanan.

  1. Emeryi kolonileri erken yaz aylarında toplamak.
    Not: yeterli sayıda cinsel bireylerin Üreme sezonunda elde etmek için 300'den fazla kişi içeren kolonileri tercih edilir.
  2. Karınca numuneler toplanan dallar bir aspiratör (Şekil 2, sol) kullanarak bir cam kapaklı bir yapay sıva yuvaya aktarın.
  3. 25 ° c altında 16:8 h açık/koyu döngüsü yapay yuva kolonilerde korumak. Musluk suyu sıva ıslak bir yıkama şişeyle sağlar.
    1. Yaklaşık 100 mg alüminyum folyo ve kahverengi şeker su dolu İpucu (20 µL tıp) her geçen gün yeni reproductives (kanatlı F1 -queens ve F1 erkek) ortaya kadar sarılmış kuru kriket tozu ekleyin.

2. deneysel laboratuvar haçlar

Not: Yeni reproductives geç yaz sonbahar (Şekil 3) ortaya çıkmaya başlar. Uzun kanatlı kraliçeler cinsel üretilmektedir ve kısa kanatlı kraliçeler clonally üretilmektedir ve anne genom (Şekil 1). Uzun kanatlı kız ve erkek haçlar akraba evliliği için kullanın.

  1. Bireylerin hareket etmesini durdurmak için bir sabit çevre Oda 4 ° C'de 15 dakika kolonilere yerleştirin.
  2. Bacaklar 30 işçi stereoskopik mikroskop altında forseps kullanarak kaldırmak ve haçlar akraba evliliği için yeni küçük sıva yuva (Şekil 2, sağ) içine aktarabilirsiniz.
    Not: Bacaklar sonraki akraba evliliği haçlar tarafından üretilen işçilerin mevcut işçi ayırmak için kaldırılır.
  3. 3-4 larva veya pupa çalışanları içeren bir sıva yuva ekleyin.
    Not: İşçi F0 queens-az kolonisinde keşif faaliyet gösteriyor. Etkili bir şekilde bu işçiler ve yeni reproductives ortasına koloni larva veya pupa geçiş sınaması sırasında çekebilecek. Sonuç olarak, normal koloni yakın deneysel koloninin koşullar tutmak.
  4. Uzun kanatlı kız ve bir erkek haçlar akraba evliliği için 2,3 adımda hazırlanan bir sıva yuva içine aktarın.
  5. 25 ° c altında 16:8 h açık/koyu döngüsü ile yiyecek ve su kadar Kraliçe kanatlarını kaybetmek ve yumurtalarını 1. 3'açıklandığı gibi sağlanan kolonileri tutun.
    Not: Bu bir ay için bir hafta sürüyor.
  6. Stereoskopik mikroskop altında deneysel koloni her gün kontrol edin. Akraba evliliği gerçekleştirmek F1 yavrular arasında haçlar sonra yumurta stereoskopik mikroskop altında görülebilir.
  7. F sonra yumurta1 Kraliçe başlar, F1 erkek ve larva veya yuvadan 2.3 basamaktaki pupa F1 üretimi (kadın ve erkek akraba evliliği haçlar için kullanılan) ve F2 nesil (çoluk çocuk karıştırma önlemek için kaldırma «««üretilen) akraba evliliği haçlar.
    Not: koloni içinde kaç erkek iseniz, bir erkek ve 1-3 queens aynı deneysel kolonisinde kullanarak akraba evliliği haçlar ikna etmek mümkün.
  8. Koloniler F2 yavru ortaya kadar 1. 3'açıklanan aynı conditionsas altında tutun.
    Not: Transfer F1 Kraliçe ve F2 yavru yeni daha büyük alçı (Şekil 2, sol) uzun vadeli koloni tutmak yuva içine.

3. akraba evliliği başarı değerlendirilmesi

  1. DNA ekstraksiyon ve genotipleme ebeveyn nesil (F0)
    1. Ve bacak 100 µL şelasyon ajanı içeren bir 1.5 mL microtube transfer forseps kullanarak F0 kraliçenin bir bacak çıkarın.
    2. Stereoskopik mikroskop altında bir kadın karin Ultrasaf Su forseps kullanarak 300 µL ile dolu cam tabak içinde incelemek ve şeklindeki erkek sperm içeren spermatheca yalıtır.
    3. Peel Away spermatheca doku ve böcek iğne kullanarak erkek dokusundan sperm yalıtır.
      Not: % 100 kadın numuneler spermatheca sperm extraction kolaylaştırmak için saklamak için bir günden fazla diseksiyon önce alkol.
    4. Bir micropipette kullanarak, sperm 100 µL şelasyon ajanı içeren bir 1.5 mL microtube aktarın.
    5. F0 Kraliçe ve adım 3.1.1 ve 3.1.3, anılan sıraya göre hazırlanan spermlerinin kuluçkaya, 20 dk. Flash 95 ° C'de microtube santrifüj kapasitesi ve 4 ° C'de depolayın
    6. Tüm örnekleri yöntemini kullanarak genotip4başka bir bölümünde.
  2. Akraba evliliği için kullanılan karıncalar çifti DNA çıkarma (F1) geçer
    1. Yumurta üretimi sib tarafından teyit F1 Kraliçe şeklindeki sonra kulübe kanatlarını veya bir orta bacak ve genotip 3.1 yukarıdaki bölümde tanımlanan aynı yöntemi kullanarak kullanarak Kraliçe DNA ayıklayın.
    2. Bir bacak ve genotip bunları kullanarak kullanarak DNA F1 erkek ayıklamak 3.1 yukarıdaki bölümde açıklanan yöntemi.
      Not: Örnekleri DNA ekstraksiyon önce alkol ve DNA şelasyon ajanı ' 4 ° C'de iki ay saklanabilir % 100 saklanabilir
  3. Erkeklerde erkek üreme değerlendirilmesi haçlar akraba evliliği üretilen
    Not: diploit erkek akraba evliliği haçlar üretilen çoğu kez steril.
    1. İç üreme organları ile 400 µL PBS çözüm forseps kullanarak bir cam tabak içinde incelemek.
    2. PBS kaldırın ve % 4 paraformaldehyde (PFA) bir micropipette kullanarak ekleyin.
    3. Doku (15-25 ° C) Oda sıcaklığında 30 dakika içinde PFA kuluçka tarafından tamir.
    4. Doku 400 µL bir micropipette kullanarak PBS ile 5 kere yıkayın.
    5. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) çözüm PBS 1 µg/ml oranında seyreltin.
    6. PBS kaldırın ve doku için yaklaşık 300 µL bu seyreltik DAPI boyama çözüm ekleyin.
    7. (15-25 ° C) Oda sıcaklığında karanlık koşul altında 15 dk kuluçkaya.
    8. Doku 400 µL PBS ile 5 kere yıkayın ve doku forseps kullanarak slayt cam merkezi aktarın.
    9. Doku orta içeren Tetramethylrhodamine TRITC Birleşik phalloidin montaj montaj.
    10. Örnekleri 20 X veya 63 X objektif lens kullanarak mikroskobu tarama confocal lazerle gözlemlemek.
    11. 405 nm uyarma lazer ve bir melez Dedektör 410-530 nm DAPI algılaması için kullanabilir.
    12. 561 nm uyarma lazer ve bir melez Dedektör 565-650 nm TRITC algılaması için kullanabilir.
    13. 400 Hz tarama hızını kullanın (400 satırları/s) 1024 × 1024 piksel çözünürlükte.
    14. Esir alma imge istimal a bilgisayar yazılımı peron.

Sonuçlar

F0 ile F1 nesiller kullanarak microsatellite incelemenin sonuçlarını gösterdi akraba evliliği haçlar başarıyla üretildi (Şekil 4)6. Sonuç olarak haçlar akraba evliliği, şeklindeki queens deneysel geçiş koloniler kurulması bir ay içinde elde edilmiştir. Kalan erkek (işçi ve bir kraliçe)6iken tüm yavrular (F2) akraba evliliği haçlar üzerinden çeyrek (27.1...

Tartışmalar

Bu makalede neden akraba evliliği haçlar ve akraba evliliği karınca emeryi V.oluşumunu değerlendirmek için kullanılan iletişim kurallarını gösterir. Deneylerde, Genotipleme haçlar için kullanılan bireylerin akraba evliliği haçlar başarılı sağlamak gereklidir. Ancak, bu geçiş testleri etkinliğini haploit erkekler sadece sonbaharda alan ve laboratuvar6üretilebilir sırasında tüm yıl boyunca, diploit erkek üretilen gibi açıkça belirgindir. Sib şeklindeki quee...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bay Taku Shimada, AntRoom, Tokyo, Japonya, temsilci emeryi V. reproductives onun fotoğrafı ile bize verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu proje Japonya Derneği tarafından bilim promosyon (JSP'ler) araştırma bursu için genç bilim adamları (16J00011) ve Grant genç bilim adamları (B)(16K18626). için yardım için finanse edildi

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Plaster powderN/AN/AAny brand can be used
Charcoal, Activated, PowderWako033-02117,037-02115
Slide glassN/AN/AAny brand can be used
Dry Cricket dietN/AN/AAny brand can be used
Brown shuger N/AN/AAny brand can be used
Styrene Square-Shaped CaseAS ONEAny sizeSize varies by number of ants
IncbatorAny brand can be used
Aluminum block bath Dry thermo unit DTU-1BTAITEC0014035-000
1.5mL Hyper Microtube,Clear, Round bottomWATSON131-715CS
Ethanol (99.5)Wako054-07225
Stereoscopic microscopeN/AN/AAny brand can be used
ForsepsDUMONT0108-5-PO
Chelex 100 sodium formSIGMA11139-85-8
Phosphate Buffer Saline (PBS) Tablets, pH7.4TaKaRaT9181
ParaformaldehydeWako162-16065
-Cellstain- DAPI solutionDojindo Molecular TechnologiesD523
ABI 3100xl Genetic AnalyzerApplied BiosystemsDirectly contact the constructor formore informations.
Confocal laser scanning microscope Leica TCS SP8LeicaDirectly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 20x/0.75 IMMLeicaDirectly contact the constructor formore informations.
HC PL APO CS2 63x/1.20 WATERLeicaDirectly contact the constructor formore informations.
Leica HyDTMLeicaDirectly contact the constructor formore informations.
Leica Application Suite X (LAS X)LeicaDirectly contact the constructor formore informations.

Referanslar

  1. Mable, B. K., Otto, S. P. The evolution of life cycles with haploid and diploid phases. BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).
  2. Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein. Cell. 114 (4), 419-429 (2003).
  3. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).
  4. Nissen, I., Müller, M., Beye, M. The Am-tra2 gene is an essential regulator of female splice regulation at two levels of the sex determination hierarchy of the honeybee. Genetics. 192 (3), 1015-1026 (2012).
  5. Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants. Nature Communications. 3, 895 (2012).
  6. Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees. PLoS Genetics. 11 (11), (2015).
  7. Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).
  8. Ohkawara, K., Nakayama, M., Satoh, A., Trindl, A., Heinze, J. Clonal reproduction and genetic caste differences in a queen-polymorphic ant, Vollenhovia emeryi. Biology letters. 2 (3), 359-363 (2006).
  9. Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Clonal reproduction by males of the ant Vollenhovia emeryi (Wheeler). Entomological Science. 11 (2), 167-172 (2008).
  10. Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).
  11. Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).
  12. De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis. Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).
  13. Paladino, L. C., et al. Complementary sex determination in the parasitic wasp Diachasmimorpha longicaudata. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
  14. Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. No gene flow between wing forms and clonal reproduction by males in the long-winged form of the ant Vollenhovia emeryi. Insectes Sociaux. 58 (2), 163-168 (2011).
  15. Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).
  16. Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. Diploid male production in a leaf-cutting ant. Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).
  17. Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta. Heredity. 82, 142-150 (1999).
  18. Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition. Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).
  19. Hölldobler, B., Wilson, E. O. . The Ants. , (1990).
  20. da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae). Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).
  21. Woyke, J. What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony. Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).
  22. Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect. Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).
  23. Schrempf, a., Aron, S., Heinze, J. Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating. Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 140akraba evlili i ha larHymenopteraVollenhovia emeryicinsiyet belirleme sistemidiploit erkeklertamamlay c cinsiyet belirleyici

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır