Explanted Retina doku hücre dışı akı analizi ile enerji metabolizmasında ölçümü

Özet

Bu teknik oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları explanted fare Retina dokularında bir hücre dışı akı çözümleyicisini kullanarak gerçek zamanlı kayıt açıklar.

Özet

Yüksek keskinliği vizyon ağır enerji tüketen bir süreç ve retinanın tam şeffaflık görsel eksen koruyarak böyle taleplerini karşılamak için birkaç benzersiz uyarlamaları geliştirmiştir. Bu hassas denge için tedirginlikler diabetik retinopati gibi kör edici hastalıklar neden. Bu nedenle, enerji metabolizması değişiklikleri retina anlayış hastalığı sırasında vison kaybı çeşitli nedenleri için rasyonel tedavilerin geliştirilmesi şarttır. Piyasada bulunan hücre dışı akı Analizörleri son gelişiyle Retina enerji metabolizması çalışmanın daha erişilebilir yaptı. Bu iletişim kuralı katkıları Retina enerji arzına - Oksidatif fosforilasyon ve glikoliz - iki prensip kolları aracılığıyla yapılan oksijen tüketimi (OCR) miktarının ölçmek için böyle bir çözümleyici kullanımını açıklar ve ekstrasellüler Bu yollar için proxy olarak asitleştirme oranları (D.H.T.). Bu tekniği tek denemede birden çok farmakolojik ajanlara yanıt değerlendirilmesi kolaylaştırılması explanted Retina dokusunda kolayca gerçekleştirilir. Retina çubuk photoreceptor sinyal eksik hayvanlardan metabolik imzalar bu yöntemi kullanarak vahşi-tür denetimlere karşılaştırılır. Bu teknikte önemli bir sınırlama ışık uyarlanmış ve dark-adapted enerji kullanımı, önemli bir fizyolojik göz retina doku arasında ayırımcılık için yetenek eksikliğidir.

Giriş

Retina Merkezi sinir sistemi¹en enerji talep dokularda arasındadır. Çoğu dokular gibi bu mitokondri sitozol ya da yolu ile Oksidatif fosforilasyon adenozin trifosfat (ATP) üzerinden glikoliz oluşturur. Glikoliz glikoz bir molekül ATP üretmek için enerjik avantaj Oksidatif fosforilasyon açıktır: 36 molekül ATP üretilen eski vs 2 ikinci gelen üretilen ATP molekülleri. Buna göre Retina nöronlar mitokondrial solunum enerji arzı için öncelikle bağlıdır ve bu mitokondri²onların yüksek yoğunluklu tarafından yansıtılır. Oksijen bol olsa bile henüz, retina da ağır glycolytic makine üzerinde dayanır. Aerobik glikoliz bu sürecin aslında kim bir kez retina sadece sonrası mitotik doku metabolizması⁴bu tür yetenekli olduğunu kaydetti Otto Warburg³tarafından kanser hücrelerinin içinde tanımlanmıştır. Bu ilk gözlemler beri birçok sonrası mitotik doku glikoliz Oksidatif fosforilasyon ek olarak değişen derecelerde ATP taleplerini karşılamak için girişme tarif edilmistir.

Phototransduction, görsel pigment biyosentezi photoreceptor dış segmentleri ve sinirsel aktivite geri dönüşüm, tüm enerji photoreceptors, baskın nöronal alt sınıfta retina zorlu süreçlerde vardır. Ama karşı onların elektrik iyonları ve konsantrasyon degradeler aktif taşıma gerek en enerjik alıcı bir süreç nöronların¹gereğidir. Photoreceptors Kanal kapatma ve sonraki hyperpolarization hafif bir uyarıcı tetikler Oysa onlar (Yani, karanlık), stimülasyon yokluğunda depolarized anlamda kendine özgü nöronlar vardır. Bu nedenle, karanlıkta, retina ATP olarak yaygın olarak adlandırılan depolarizasyon veya "karanlık akımı" korumak için büyük miktarlarda tüketmek. Adaptif değiştiremeyeceğinden, bu büyük miktarda ATP temin büyük bir meydan okuma optik eksen aracılığıyla görsel netlik sağlamak organizmalar için ihtiyaç vardır. Photoreceptors ışık yolunu uzak tedarik yoğun kılcal ağ tutar olarak modern yaratıkları görmüş ters Retina baskın çözüm mimarisidir. Ama bu hayret doğal Biyomühendislik retina metabolik rezerv açısından bir uçurumun yerleştirir. Hatta küçük hakaret retina için potansiyel enerji arz talep hassas dengesini bozabilir ve görsel fonksiyon bozukluğu veya frank körlüğü hızlı bir şekilde doğmak.

Sinirsel retinanın vasküler kaynağı, onun sıkı kısıtlama ile birleştiğinde, benzersiz enerjik talepleri göz önüne alındığında hastalığı sırasında ATP tüketimi retina ve değişiklikleri doğru ölçüm anlamakta ve tedavi derin etkileri olabilir retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi koşulları kör. Geleneksel olarak, bu ölçümler laboratuar tamamen metabolik aktivite^{2,5,6ölçümleri için adanmış bir avuç çıkan en çalışmaları ile pahalı, özel tasarlanmış ekipman gerektiren, 7,8}. Teknikleri belirli metabolitleri, radyo etiketli öncüleri, oksijen tüketimi kayıt Clark elektrotlar ve⁹profil oluşturma metabolomic kullanarak kullanarak izleme çalışmaları için bireysel testleri içerir.

Gelişmeler ile yüksek-den geçerek teknoloji ve ticari cihazlar, kullanılabilirliğinin artması, giderek erişilebilir ve uygun teknikleri kayıt Retina metabolizma. Burada açıklanan yöntemi hem Oksidatif fosforilasyon ölçer ve glikoliz retina kullanarak doku ve piyasada bulunan hücre dışı akı analyzer^9,10,11,12explanted. Bu Çözümleyicisi ayrı olarak oksijen tüketim oranını (OCR) ve Oksidatif fosforilasyon ve glikoliz, sırasıyla¹³dolaylı göstergeleri olarak hizmet veren hücre dışı asitleştirme oranı (D.H.T.), kaydeder. Bu ölçümler faiz doku üzerinde oluşturulan bir microchamber içinde örtülü bir sonda tarafından yapılır. Daha önce yayımlanmış yöntemleri bu uyum pankreas adacıkları of Langerhans için tasarlanan bir yakalama plaka fare retina küçük, dairesel bölümlerde metabolik etkinliklerini kaydetmek için kullanır. Birden fazla farmakolojik poz doku için sistem 4 enjeksiyon portu her örnek için de içerdiği için bir tek kayıt ders sırasında teslim edilebilir. D.H.T. ve OCR kayıtları için en iyi duruma getirilmiş ayrı protokol ile bu sistemi kullanarak, vahşi tipi Retina yanıt (Gnat1^{- / -}), transducin eksik Retina karşılaştırılabilir bir nedeni konjenital sabit gece körlüğü insanlar¹⁴.

Protokol

İletişim kuralları vizyon Araştırmaları Derneği ve Oftalmoloji deyim için hayvan kullanımı izlemek ve Washington Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. hayvan hazırlık

1. Hayvanlar 12 saat ile standart konut içinde 12 saat ışık-siklet için karanlık tutun. Begin deneyler standart kez sirkadiyen etkileri, genellikle sabah ışıkları yanar kısa bir süre sonra önlemek için.

2. çözüm hazırlık

1. 8.4 mg (GKD₂O) çift distile H₂O toz medya çözülerek temel ortam hazırlamak ve pH HCl ve NaOH 7.4 için ayarlamak, 1 final bir birime L. filtre sterilize bu çözüm 0,22 µm doku kültürü filtre ile.
   1. 1 M glikoz ve 100 mM sodyum pyruvate son 5 mM şekeri konsantrasyonları elde etmek için medya ve 1 mM pyruvate ekleyin.
   2. 37 ° C su banyosu temel medya 50 mL aliquot bir yer.
2. Tris temel ekleyerek 10 mM, Polietilen glikol tert-octylphenyl Eter %0,2 (v/v) ve tüm GKD₂O. tüm bileşenlerini tamamen çözülmüş ve ayarlamak kadar Mix 1 mm EDTA lizis çözüm, doku Nefelometri akı analizi, sonunda hazırlamak 8,0 pH.
3. Mitokondrial stres iletişim kuralı için iyi 1 µM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş oligomycin, bir ATP sentaz inhibitörü 11 µM stokunun hazırlayın. Hazırlamak bir 11 µM stok karbonil siyanür - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), uncoupling ajanı, çözünmüş iyi 1 µM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel medya. Elektron taşıma zinciri inhibitörleri, Rotenon ve antimycin A (RAA Rotenon 11 µM ve antimycin A 22 µM için için ekleyerek) bir kokteyl hazırlamak 1 µM Rotenon ve 2 µM antimycin A içinde son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş de.
4. Glikoliz iletişim kuralı için bir 220 mM hisse senedi iyi 20 mM son bir konsantrasyon hedeflemek için temel ortamda çözünmüş glikoz hazırlayın. Ayrıca 2-deoxyglucose (2-DG) 1,1 M stokunun, glikoz ve glycolytic antagonisti, rekabetçi bir önleyici temel medyada çözülerek hazırlayın. Bu 100 mM 2-DG iyi son bir konsantrasyon hedefleyecektir.

3. aleti kalibrasyon

1. Araçları bir hücre dışı akı tahlil için ayarlamak için sensör kartuş (24 kuyu toplam) her şey için kalibrasyon çözüm 1 mL ekleyin ve CO₂37 ° C'de kuluçkaya-özgür kuluçka geceleme (ya da en az 8 saat).
2. Katkı maddeleri, mitokondrial Stres Protokolü veya glikoliz protokolü için her enjektör bağlantı noktası, A ile D, iyi cilt değişiklikleri için ayarlama sensör kartuþundaki yüklemek.
   Not: Örneğin, tipik bir tahlil bir katkı ilk enjektör bağlantı noktasına 45 µL, ikinci, üçüncü ve 60 µL son, içine içine 54,5 µL 450 µL bir ilk iyi hacmi varsayarak içine 49,5 µL içerir.
3. İlk birkaç deneyler sırasında temel medya bağlantı bir bağlantı noktası enjeksiyon sonra ne kadar doku hareketi/yapay doku oluşur ölçmek için noktası A içine yükleyin.
4. Bir sigara-CO₂ kuluçka için en az 60 dk. 37 ° C'de kuluçkaya için yüklü sensörü plaka izin.

4. yalıtım taze fare Retina dokusunun

Not: Bu adım Dr Barry Winkler¹⁵tekniği adapte olduğunu.

1. Derin anestezi'ni kullanarak yönetme sonra bir standart ketamin/xylazine kokteyl, servikal çıkığı tarafından fareler ötenazi.
2. Kıvrımlı pensler orta ölçekli bir çift optik sinir, posterior dünya kavramak ve yavaşça proptose göz (Şekil 1A) ileri baskı uygulamak için kullanın.
   1. Temiz bir tıraş bıçağı ile bir limbus limbus kesi kornea arasında bir tek, kasıtlı geçmek-in bıçak kullanarak oluşturun.
   2. İyi kullanarak, açılı McPherson tarzı forseps, posterior dünyanın objektif ve korneal kesi dışında anterior hyaloid membran ifade etmek için çimdik. Bu doku atmak.
   3. Kıstırma manevra forseps ile sinirsel retina ifade etmek için yineleyin.
   4. Bir kaşık gibi forseps retina kaldırmak için yerine doku kavramak için kullanarak, korneal kesi uzak retina aktarmak ve 3 cm çanak veya 6-iyi doku kültürü küme plaka sıcak ortamda doğrudan yerleştirin.
3. İyi, açılı McPherson tarzı forseps iki çift yavaşça retina üzerinden kalan vitre incelemek için kullanın. Bu en iyi Retina Kupası çevre vitre açgözlü ve bir bütün olarak Merkezi'nden vitreus vücudun son bir disinsertion ile merkezine doğru çekerek yapılır. Forseps kullanarak, herhangi bir kalıntı retina pigment epiteli retina photoreceptor yüzeyinden kaldırın.
   1. P1000 damlalıklı bahşiş aşırı travma için hassas Retina doku transferi manevralar sırasında önlemek için ~ 4 mm açılış oluşturmak için bir tıraş bıçağı ile kesti.
   2. İzole Retina doku kesme P1000 damlalıklı bahşiş kullanarak yeni medya aktarın.
   3. Retina çevresinde optik sinir 1 mm biyopsi ile 1 mm yumruklardan punch delik (Şekil 1B) saplanmış olur diye doku çıkarmak için bir dalgıç ile donatılmış kesim. Retina yumruklar bir kenara temiz medya 37 ° C blokta tutulabilir ya da yastık Isıtma ayarlayın.

5. tahlil Protokolü

1. Tek tek yumruk 450 µL medya ile birlikte doku alıyorum bir kesim P1000 ucu, kullanarak bir 24-şey adacık yakalama Mikroplaka aktarın.
2. Tamam, yavaşça yumruk Mikroplaka ortasına içine işlemek için düz forseps kullanın. Aynı yönde (Örneğin, ganglion hücre tarafı yukarı doğru) yönelik yumruk tutun.
   1. Yakalama plaka bir ısıtma yastığı veya adımları kalan örnekleri için yinelenir gibi 37 ° C blok kümesine Isıtma üzerinde bekletin.
      Not: Her deneme için 3-4 boş wells 450 µL negatif denetimler olarak hizmet etmek temel medya ile bir kenara koyun. 20-21 wells kalan her biyolojik REPLICATE nüsha olarak sınayın. Bu nedenle, her 24-şey plaka kaydı için 6-7 farklı hayvan veya tedavi koşulları sağlayacaktır.
3. Hava kabarcıkları, yavaşça pozisyon kaçınarak adacık kafes ekler her şey forseps kullanarak yakalamak ve ekler bir metal dalgıç veya bir kesim P1000 damlalıklı ucu (Şekil 1 C) ile güvenli.
   Not: Aşırı doku hareket Merkezi bünyesinde Retina yumruk konumunu örnek microchamber korumak için bu adımı sırasında kaçının. Hava kabarcıkları ciddi OCR okuma deforme. Microchamber tipik fare retina (Şekil 1 c) karşılamak için yeterli derinlik olmasına rağmen zaman zaman kafes ekler işleme hatalarını dokularda aşırı ekran ekleme sırasında sıkıştırılmış haline neden olabilir. Bu durumda, sadece ezilmiş doku not alın ve bu örnek son çözümleme dışı bırakmak.
4. Kuluçkaya doku plaka 37 ° C CO₂-en az 60 dakika için özgür kuluçka makinesi.
5. Kullanarak Mix, bekle, ölçü birimi hücre dışı akı analyzer programı ve komutları yineleyin. Örnek olarak, Retina doku ile tipik bir deneme aşağıdakiler dahil: 2 dakika karıştırın, 2 dakika bekleyin ve 5 dakika ölçmek. Bu üç ile deneme adımlar arasında tekrar 5 - 8 kat (devir) bir temel kayıt için ve sonra çalışma sırasında test edilen her bileşik enjeksiyon.
6. Hücre dışı akı analyzer programı Başlat düğmesine basın ve sensör kartuş kalibrasyon için eklemek için ekrandaki yönergeleri izleyin.
7. Kalibrasyon sonunda calibrant plaka Retina örnekleri içeren plaka ile değiştirmek için ekrandaki yönergeleri izleyin.
8. Çalıştırmak, program programlı olarak izin. Çalışma bitiminde, doku plaka çıkarmak için ekrandaki yönergeleri izleyin. Çalışma sonuçlarını görüntülemek ve veri dosyası depolamak.
9. Bir bükülmüş 20 gauge iğne ve forseps ile retina yumruk geride bırakarak kuyulardan tüm kafes ekler kaldırın.
10. Dikkatle doku medyadan Aspire edin ve doku 0.5 mL soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS) ile iki kez yıkayın. PBS yıkandıktan sonra Aspire edin.
11. 100 µL lizis arabelleği her şey ve damlalıklı yukarı ve aşağı doku homojenize ekleyin.
12. Toplam çift iplikçikli DNA (dsDNA) veya toplam protein içeriği temel giriş düzeylerini quantitate.
    Not: Aşağıda bir piyasada bulunan dsDNA tahlil dayanmaktadır.
13. 100 µL Tris-EDTA (TE) arabelleği ekleyerek lysed örnekleri 1:1 oranında seyreltin ve seyreltilmiş örnek 100 µL 96 iyi bir tabağa aktarın.
    1. 100 µL algılama arabelleği her kuyunun içine ekleyin. 2-5 dakika karıştırdıktan sonra floresan sonra 480 nm, uyarma ve emisyon 520, quantitate nm, standart bir eğri karşılaştırma.
    2. DNA içeriği kuyu içinde ham hücre dışı akı izlemeyi normalleştirmek.
       Not: Burada sunulan sonuçlarında örnekleri 50 ng dsDNA - 1 mm Retina yumruk tipik bir miktar için normalleştirilmiş. Bu nedenle, mutlak değerler burada sunulan "başına Retina yumruk" veri sunma çalışmaları karşılaştırıldığında. Temel koşmak bir glikoz konsantrasyonu 5 mm gibi tracings bir iç standart normalleştirmek.

Sonuçlar

( Şekil 1' de özetlenen) açıklanan teknikleri kullanarak, 8 haftalık vahşi türü (WT) fareler gelen Retina explants yaş ve arka plan eşleşen transducin null fareler için (Gnat1^{- / -}) karşılaştırıldı. Gnat1^{- / -} hayvan kapatmak için makine eksikliği nedeniyle nükleotit döngüsel ışık bizi canlı tutan iyon kanalları geçişli, onların çubuk photoreceptors bile ışık^...

Tartışmalar

OCR ve D.H.T. kolayca açıklanan teknikleri kullanarak bir bioanalyzer kullanarak explanted Retina dokularında ölçülür. Bu, diğer grupların birkaç kritik adımda bu yöntem başlamaktadır. Retina dokularının orijinali Winkler¹⁵tarafından açıklanan dünya, enucleating olmadan büyük bir korneal kesi izole edilmiştir. Bu yöntemi Retina tecrit (genellikle 5 dakika içinde) doku yakalama plaka içine hızlı bir transfer yaşam göz olanak sağlar. Doku hücresel solunum ne zaman buz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer	Agilent, Santa Clara, CA
Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (includes: Islet Capture Microplate, Sensor Cartridge and Calibrant Solution)	Agilent, Santa Clara, CA	101174-100	Includes islet capture microplate, sensor cartridge and calibrant solution
RPMI 1640 Media (Powdered medium)	Millipore-Sigma	R1383	RPMI 1640 Media with L-Glutamine and without glucose or sodium bicarbonate
D-Glucose	Millipore-Sigma	G8270	1M D-Glucose filtered, for media preparation
Sodium pyruvate	Corning	25000CI	100 mM sodium pyruvate
Antimycin-A	Millipore-Sigma	A8674	Mitochondrial stress protocol component
FCCP	Millipore-Sigma	C2920	Mitochondrial stress protocol component
Rotenone	Millipore-Sigma	R8875	Mitochondrial stress protocol component
2-deoxyglucose	Millipore-Sigma	D6134	Glycolysis protocol component
1 mm skin biopsy punches with plunger	Integra-Miltex	33-31AA-P/25	Explanting retinal tissue tool
Dumont Mini-Forceps Straight	Fine Science Tools	11200-10	Explanting retinal tissue tool
Dumont Medical #5/45 Forceps- Angled 45 degrees	Fine Science Tools	11253-25	Explanting retinal tissue tool
Dumont #7 Forceps - Curved	Fine Science Tools	11271-30	Explanting retinal tissue tool
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit	Fisher Scientific	P7589	Loading normalization assay
Trizma base (Tris base)	Millipore-Sigma	T6066	Component of lysis buffer
Triton X-100 (polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)	Millipore-Sigma	X100	Component of lysis buffer
0.5M EDTA pH 8.0	Ambion	AM9262	Component of lysis buffer
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	Strain 000664	Animals
Gnat1-/- and background-matched Gnat1+/+	Vladimir Kefalov, PhD; Washington University School of Medicine	Animals