JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, hem insan bağışıklık sistemi hem de karaciğer hücreleri ile insanlaşmış fareler kurmak için güvenilir bir yöntem sağlar. İnsan hepatositlerinin intrasplenik enjeksiyonu ve CD34+ hematopoetik kök hücrelerin insplektik enjeksiyonu ile elde edilen çift immünoeksik fareler insan immün yetmezlik virüsü-1 enfeksiyonuna yatkındır ve gözlendiği gibi karaciğer hasarına recapitulate HIV bulaşmış hastalar.

Özet

İnsan immün yetmezlik virüsü-1 (HIV-1) ile enfekte hastaların artan yaşam beklentisi rağmen, karaciğer hastalığı morbidite ortak bir nedeni olarak ortaya çıkmıştır. HIV-1'in neden olduğu karaciğer immünpatolojisi hala zor. İnsan hepatositleri ve insan bağışıklık sistemi ile küçük ksenogreft hayvan modelleri hastalığın patogenezinin insan biyolojisini özetleyebilir. Burada, insan heatositleri ve CD34+ hematopoetik kök/progenitor hücreleri (HSPCs) transplantasyonu ile hiv hastalarında gözlenen karaciğer immünopatolojisini incelemek için çift insanlaştırılmış fare modeli oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Çift reconstitution elde etmek için, erkek TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) fareler intraperitoneally gansiclovir enjekte edilir (GCV) dozları fare transgenik karaciğer hücrelerini ortadan kaldırmak için, ve nonmiyeoablative klima için treosulfan ile, her ikisi de insan hepatosit (HEP) engraftment ve insan bağışıklık sistemi (HIS) gelişimini kolaylaştırmak. İnsan albumini (ALB) düzeyleri karaciğer engraftment için değerlendirilir, ve kanda insan bağışıklık hücrelerinin varlığı kanda akış sitometri tarafından tespit insan bağışıklık sisteminin kurulmasını doğrular. Burada açıklanan protokol kullanılarak geliştirilen model, HIV-1 enfeksiyonundan kaynaklanan karaciğer hasarının birden fazla bileşenini andırmaktadır. Kurulması hepatit virüsü ortak enfeksiyon çalışmaları ve antiviral ve antiretroviral ilaçların değerlendirilmesi için gerekli olduğunu kanıtlayabilir.

Giriş

Antiretroviral tedavinin gelişinden bu yana, HIV-1 monoenfeksiyona bağlı ölümlerde önemli bir azalma olmuştur. Ancak, karaciğer hastalığı HIV-enfekte hastalarda morbidite ortak bir nedeni olarak ortaya çıkmıştır1,2. HIV-1 enfeksiyonu ile hepatit virüslerinin coenfeksiyonlar daha yaygındır, 10% için muhasebe - 30% ABD'de HIV enfektekişilerin% 30,4,5.

HIV-1 ve hepatit virüslerinin ev sahibi özgüllüğü, küçük hayvan modellerinin insana özgü bulaşıcı hastalıkları incelemek veya HIV-1 ile ilişkili karaciğer patogenesinin çeşitli yönlerini araştırmak için yararsağlar. İnsan hücrelerinin ve/veya dokuların engraftment izin immunodeficient fareler (insanlı fare modelleri olarak da adlandırılır) preklinikçalışmalariçin kabul edilebilir hayvan modelleri 6,7,8. 2000'li yılların başında insanlaşmış farelerin piyasaya sürülmesinden bu yana, kolestatik insan karaciğer toksisitesi, HIV-1 ve HIV ile ilişkili nörobilişsel bozukluklar, Epstein Barr virüsü, hepatit ve diğer dahil olmak üzere insana özgü patojenler, birden fazla preklinik çalışmalar bulaşıcı hastalıklar, bu farelerde araştırılmıştır6,9,10,11. CD34+ HSPCs ve / veya insan hepatosit transplantasyonu için birden fazla fare modelleri uzun geliştirilmiş ve Hepatit B virüsü (HBV) ilişkili karaciğer hastalığı hastalığı patogenezini incelemek için zaman içinde geliştirilmiş12, 13.000 , 14. HSPC ve insan hepatosit (HEP) transplantasyonu için çeşitli modeller NOG (NOD) olarak bilinen suşlara dayanmaktadır. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12ve fah-/- NOD rag1-/- il2rγnull fare16. Ancak, her modelin kendi avantajları ve sınırlamaları vardır; örneğin, Bir Balb/C-Rag2üzerinde HEP'ler ve insan kök hücreleri (HSC'ler) için AFC8 çift insanlaştırılmış fareler , bağışıklık hücreleri ve HSC'lerin başarılı bir şekilde engraftment sağlar, ancak bir antijene özgü T- ve B-hücre yokluğu var bu modelde yanıt12. Çift insanlı farelerin yeniden konumlanmasındaki en önemli endişeler arasında suboptimal engraftment, farklı dokuları destekleyecek uygun modellerin olmaması,uyumsuz koşullar, immün ret veya greft-versus-host hastalığı (GVHD) ve teknik metabolik anormalliklere bağlı olarak yenidoğanlarda riskli manipülasyonlar ve yüksek mortalite oranları gibi güçlükler13.

İnsanlaştırılmış fareler uzun yıllar HIV araştırma için kullanılan olmasına rağmen17,18,19, HIV-1 neden olduğu karaciğer hasarı incelemek için insanlaşmış farelerin kullanımı20sınırlı olmuştur . Biz daha önce bir çift insanlaştırılmış TK-NOG fare modeli ve HIV ilişkili karaciğer hastalığı8onun uygulama kurulması bildirdi. Bu model karaciğer ve bağışıklık hücrelerinin sağlam engraftment gösterir ve HIV enfeksiyonu patogenezini recapitulates. Bu tartışma, insan hepatositlerinin naklinde en kritik adımları içeren ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. HEP'lerin başarılı bir şekilde engreftlemesi ve TK-NOG farelerde fonksiyonel bir bağışıklık sisteminin kurulması için gerekli olan HSP'lerin tanımı da sunulmuştur. Bu farelerin HIV ile ilişkili karaciğer immünopatogenezi üzerinde çalışması için kullanımı ayrıntılıdır. Karaciğere özgü herpes simpleks virüsü tip 1 timidin kigaz (HSV-TK) transgeni taşıyan TK-NOG erkek fareler kullanılır. Bu transgeni ifade eden fare karaciğer hücreleri, toksik olmayan bir GCV dozuna kısa bir maruzktan sonra kolayca ablated olabilir. Nakledilen insan karaciğer hücreleri eksojen ilaçlar olmadan fare karaciğeri içinde stably korunur21. Fareler de insan hücreleri için fare kemik iliği bir niş oluşturmak için treosulfan nonmyeloablative dozlarda ön koşulluvardır 8. İmmün eksikliği olan TK-NOG farelere intrasplenik olarak HEP ve çok güçlü HSP'ler enjekte edilir. Fareler daha sonra düzenli olarak kan immünofenotiyonu ve serum insan-albumin düzeyleriölçümleri ile kan ve karaciğer reconstitution için izlenir, sırasıyla. Hem insan bağışıklık hücreleri hem de HEP'ler için %15'ten fazla başarılı bir reconstitution ile fareler intraperitoneally HIV-1 enjekte edilir. HIV'in karaciğer üzerindeki etkisi enfeksiyon sonrası 4- 5 hafta kadar erken değerlendirilebilir. HIV-1 kullanıldığından, virüsün kullanımı ve farelere enjekte edilmesi sırasında gerekli tüm önlemlerin alınması gerektiği ne kadar önemlidir?

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokol, Nebraska Üniversitesi Tıp Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Hayvanlar üzerinde deneyler yapmadan önce yerel IACUC'den onay alın.

1. Göbek Kordon Kanının İşlenmesi ve İnsan HSP'lerinin İzolasyon

  1. Laminar akış dolaplarında steril koşullar altında protokolün tüm adımlarını gerçekleştirin.
  2. Heparinize tüplerde toplanan göbek kordon kanı (CB) alın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek hacmi 35 mL'ye kadar yapın. Örnek, Şekil 1'de gösterildiği gibi lenfosit ayırma ortamının (LSM) üzerine yerleştirin ve LSM'yi 400 x g'de 400 x g'de, 4 °C'de frensiz olarak merkezleyin.
    NOT: Arayüzün karışmasını önlemek için kanı dikkatlice ve nazikçe seyreltin.
  3. Üst LSM ve plazma tabakasını dikkatlice çıkarın ve aktarım pipetini kullanarak beyaz buffy coat arayüzünü yeni bir tüpe aktarın.
  4. 30 - 40 mL buz gibi tampon (PBS + %0.5 sığır serum albumini [BSA] + 2 mM ethylenediaminetetraacetic asit [EDTA]) içinde buffy kat resuspend. Bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 20 μL'sini %0,4'lük trypan mavisi ve pipet 10°L karışımını sayma kaydırağının iki bölmesinden birinin dış açılımına birleştirin ve hücreleri saymak için slayı otomatik bir hücre sayacına yerleştirin.
    NOT: Hücreleri canlı tutmaya yardımcı olduğu için tüm adımlarda buz gibi tampon kullanın.
  5. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 10 dakika için santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice aspire edin. Daha sonra, buz gibi tampon 300 μL ekleyin.
  6. 1 x 108 hücreye kadar 100 μL insan fc reseptör bloke reaktifi ve 100 μL monoklonal fare anti-insan CD34 antikor konjuge mikroboncuklar ekleyin (Malzeme Tablosunabakın). 4 °C'de 30 dakika kuluçka, hücreleri yıkamak için 10 mL buz gibi tampon ekleyin ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
    NOT: 1 x 108'den fazla hücre varsa bunu hücre sayısına göre ölçeklendirin.
  7. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın, 500 μL arabellekte peleti yeniden askıya alın ve HSP'leri zenginleştirmek için manyetik ayırma adımına devam edin.
  8. Pozitif bir seçim LS sütunu yerleştirin (Malzemeler Tablosu'nabakın) manyetik olarak aktive edilmiş hücre sıralama alanına yerleştirin ve 3 mL arabellekile geçirin.
  9. Numuneyi, insan CD34+'ya bağlı mikroboncukları numunelere sığdırabilen ve yerçekiminin etkisi yle toplama tüpüne akmasını sağlayan LS sütununa yükleyin.
  10. Tampon ile sütun 3x yıkayın ve CD34 aynı toplama tüpü nde elute toplamak- hücrelerin fraksiyonu.
  11. CD34+ hücreleri yeni bir toplama tüpüne dönüştürmek için 5 mL arabellek içeren sütunu daldırın. >%90 saflık elde etmek için yordamı tekrarlayın.
  12. Hemositometrede trypan mavi boya kullanarak eluted CD34+ hücreleri sayın. Saydıktan sonra, 5 dk için 300 x g CD34+ hücreleri santrifüj ve supernatant atın.
  13. Cd34+ hücreleri 25 μL PBS'de naklatımda hemen kullanılmak üzere yeniden askıya almak veya dondurucu ortamda 1-2 milyon/mL konsantrasyonda hücreleri kriyokorunmuş olarak (Roswell Park Memorial Institute medium [RPMI 1640 orta] + %50 fetal transplantasyonda daha fazla kullanılmak üzere sığır serumu (FBS) + %10 dimetil sülfoksit [DMSO])
    NOT: Her zaman naklatabilmede kullanmadan önce canlı hücreleri yeniden sayın.
  14. CD34+ elute'nin saflığını kontrol etmek için süspansiyonun 50 μL'sini alın ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 10 μL PE-konjuge anti-insan CD34 antikor ile kuluçkaya yatırın. Antikor inkübasyon sonra, PBS ile lekeli hücreleri yıkayın, PBS 100 μL onları yeniden askıya, ve sonra, akış sitometri gerçekleştirmek için devam. Akış sitometrede kapıyı tasarlamak için antikorsuz ek bir hücre tüpü ekleyin.
  15. Edinmeden sonra, ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) çiziminde ilgi alanını seçerek verileri analiz edin ve ardından FSC-alan ve FSC yüksekliği çizimlerinde tek hücreler için gating elde edin. PE kanalındaki tek hücrelerdeki CD34 pozitif hücreleri ve SSC alanı çizimini geçitlendirin.

2. Transplantasyon için İnsan Hepatosithazırlanması

  1. Sıvı nitrojenden kriyosayrılmış hepatositleri çıkarın, şişeyi su banyosuna hızla batırın ve yaklaşık 90-120 s kadar çözülün.
  2. Vial kapağı çıkarın ve ısıtılmış erime ortamının 50 mL konik tüpüiçine çözülmüş hepatositler dökün.
  3. 50 mL'lik tüpü elle sallayarak hücreleri birkaç saniye askıya alın.
    NOT: Tüpü girdap etmeyin.
  4. Hücre100 x g oda sıcaklığında 8 dk. PBS'deki peletli hücreleri %0,1 BSA ile yıkayın ve pbs'de taze veya çözülmüş HSP'lerle (oran 10:1) 80 μL/fare son hacminde havuzlayın.

3. İnsan HSPC ve Hepatosit Transplantasyonu için Hayvan Taşıma, Tarama, Genotileme ve Tedavi

  1. Hayvan taşıma
    1. Şiddetli immün yetmezlik sonucu, cins, ev, ve aseptik koşullar altında TK-NOG fareler kolu.
    2. Potansiyel patojen mikroorganizmalarla enfeksiyonu önlemek için her zaman bir laboratuvar önlüğü, eldiven, ayakkabı kılıfı ve yüz maskesi giyin.
    3. Ameliyat için steril eldiven ve aletleri kullanın ve ameliyat boyunca hayvanları aseptik olarak kullanın.
  2. Deney için TK-NOG fare seçimi
    1. Dişi TK-NOG farelerini erkek tk-NOG olmayan çöplerle besleyerek TK-NOG suş kolonisini koruyun ve genotipleyerek transgenik yavruları seçin.
      NOT: Kesilme sırasında yeni doğan erkek ve dişi farelerde transgenin varlığını veya yokluğunu belirlemek için genotipleme yapın (bkz. adım 3.3).
    2. HSV-TK transjen ekspreshepatlarının GCV aracılı tükenmesine karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle transplantasyon için 6 -8 haftalık erkekleri seçin21.
    3. Tanımlamayı kolaylaştırmak için fareleri kesişme veya ameliyat sırasında kulak etiketiyle etiketle. Hayvanların ağırlık ve sağlık durumlarını not edin.
  3. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak HSV-TK transgeninin varlığı için genotipleme
    1. (Genellikle 3 -4 haftalık yaşlarda) suiisma sırasında genotipleme yapın. Genotipleme için, bir laminar akış biyolojik güvenlik kabininde fare kulağının bir parçası kesilmiş sterilite korumak ve genomik DNA izolasyon kiti kullanarak genomik DNA ayıklamak.
    2. HSV-TK transgeni için insan albumin promotörü kontrolünde ki 1 μL ileri astar 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL ters astar 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0.5 μL ekleyerek kulak parçasından çıkarılan genomik DNA'yı yükseltin FAM prob 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', ve 10 μL ana karışımı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) alet22.
    3. Gerçek zamanlı PCR ayarlarını şu şekilde ayarlayın: 30 s (ön okuma aşaması) için 60 °C, 10 dakika (bekleme aşaması) için 95 °C, 15 s için 95 °C 40 devir ve 1 dk için 60 °C (PCR aşaması) ve 30 s (okuma sonrası aşama) için 60 °C.
      NOT: HSV-TK transgeni için 22'nin altındaki eşik (Ct) döngüsü pozitif olarak kabul edilir.
  4. Gansiclovir ve treosulfan kullanılarak tedavi
    1. 27 G iğne kullanarak, TK-NOG farelere 7 gün 2 kat intraperitoneal GCV enjeksiyonları (6 mg/kg) enjekte edin ve ameliyattan önce 100 μL'de 5 tuzlu su enjekte edin (Şekil 2'dekideneysel stratejide gösterildiği gibi )23 .
    2. Ameliyattan önce 3, 2 ve 1.
    3. Ameliyattan bir gün önce submandibular venden 2-3 damla (~100 μL) kan çekin ve degr'i değerlendirmek için alanin aminotransferaz (ALT) tahlili için 10 dakika (10 dk için 1.500 x g) santrifüj ederek serumu izole edin karaciğer hasarı ee.
  5. Ameliyata hazırlık
    1. Ameliyattan önce kesi bölgesini (periton duvarının solunda) çevreleyen farenin kürkü için makas kullanın.
    2. Fare anestezi makinesi ni kullanarak oksijen akışını 1 L/dk'ya, izofluran akışını ise %3 -5%'e ayarlayın. Anestezi için indüksiyon odasına bir seferde bir fare yerleştirin.
    3. Steril uzatma tüpünün bir ucunu (550 μL süspansiyon tutma kapasitesine sahip olarak; teknik özellikler için Malzeme Tablosu'na bakın) 30 G iğneye ve diğer ucunu 1 mL şırıngaya takın.
    4. Şırıngayı havuzlu HEP'lerin ve HSP'lerin süspansiyonuyla (80 μL/fare) doldurun (bölüm 2'ye bakın), şırıngayı tekrarlayan dağıtım pipetinin çentikine sığdırın ve dağıtıcıyı her prese 10 μL dağıtacak şekilde ayarlayın.
    5. Fareler anestezi edildikten sonra (genellikle 3 - 4 dk sonra), burun konisine isofluran akışını değiştirin ve isofluran akış hızını %2-%3'e düşürün.
  6. Farelerde insan HSPC'leri ve hepatositlerin intrasplenik transplantasyonu
    1. Steril koşullar altında laminar akış dolabında tüm cerrahi adımları gerçekleştirin.
    2. Çalışma yüzeyinin üzerine temiz bir steril perde yerleştirin ve bir kesi yapmadan önce, % 10 povison-iyot ve % 70 izopropil alkol takip ile her farenin vücudunun sol tarafında ovmak.
    3. Küçük bir kesi (~ 1 - 1,5 cm uzunluğunda ve 5 mm derin) deri, kas ve periton vanna tipi makas ile periton duvarının solunda yaklaşık 5 mm göğüs kafesi alt kenarının altında periton boşluğu girmek için olun.
    4. Dalağını bulun, kolay erişim için forsepslerle hafifçe çalışma alanına çekin ve 30 G iğneyi dalak alt kutbuna takın.
    5. Dağıtım pipetinin pistonunun kilidini açın ve dalak başına 60 - 80°L limitiyle hacmin 10°L'ini bir seferde dağıtın. İğneyi yavaşça geri çekin ve bir ligasyon aplier kullanarak dalağını bağlama klipleri ile kırpın.
    6. Dalağını steril PBS ile ıslak pamuk uçlu aplikatörlerle vücut boşluğuna geri itin.
    7. Emilebilir bir dikiş kesilmiş dikiş deseni (sürekli değil) kullanarak karın duvarının kas tabakasını kapatın. Emilemeyen dikişler kullanarak kesilen dikiş deseni ile cilt kapanmasını gerçekleştirin.
    8. Ameliyat sonrası fareleri hipotermiden korumak için ılık su sirkülasyonlarını kullanın.
    9. Ameliyattan 10-14 gün sonra emilmeyen dikişleri çıkarın.
  7. Ameliyat sonrası bakım
    1. Ekilen hayvan uyandığında analjezik çıkıntı (0.1 mg/kg) intraperitoneal olarak, günde 2 x art arda 3 gün enjekte edin.
    2. Normal fiziksel koşullara dönene kadar hayvanları günde en az 1 x gözlemleyin.
      NOT: Bazı fareler ameliyat sonrası kilo verebilir, çünkü her hayvanın vücut ağırlığını kontrol edin. Fareler genellikle 1 ila 2 hafta içinde orijinal ağırlıklarını geri kazanırlar.

4. ELISA ve Akış Sitometri ile İnsan Bağışıklık Sistemi tarafından İnsan Karaciğerinin Engraftment Doğrulama

NOT: Enzime bağlı immünosorbent tsay (ELISA) ve akış sitometrisi ile 1 aylık posttransplantasyondan başlayarak, insan karaciğerinin ve bağışıklık sisteminin yeniden yapılandırılmasını aylık olarak değerlendirin.

  1. EDTA tüplerinde mızraklar kullanarak submandibular ven kan örnekleri toplamak ve 4 °C'de 10 dakika için 1.500 x g santrifüj. İlenmiş insan hepatositleri için fare karaciğerinin engraftment verimliliğini değerlendirmek için insan albumin düzeylerini kontrol etmek için serum izole, bir insan albumin ELISA quantitation seti kullanarak (Malzemeler Tablosubakınız) üreticinin aşağıdaki tarafından Talimat -ları.
    NOT: Pelet atmayın ve insan bağışıklık sisteminin yeniden değerlendirmek için bir akış sitometri analizi için peletli hücreleri kullanmayın.
  2. 35 μL FACS tamponunda (PBS + %2 FBS) serumsuz hücre peletini yeniden askıya almak ve 5 μL fareye özgü CD45 (konsantrasyon 0.5 mg/mL), 5 μL insana özgü antikorcd45 (0.1 mg/mL), CD3 (0.2 mg/mL), CD8 (0.1 mg/mL) ve CD19 (0.5 mg/mL) , ve 20 μL CD4 (0.25 mg/mL) ve CD14 (0.25 mg/mL) her biri için 30 dakika 4 °C, CD34 fonksiyonel bir bağışıklık sisteminin gelişimini kontrol etmek için+ HSPCs.
    NOT: Lekeli hücrelerin gating belirlemek için lekesiz hücrelerin bir ek tüp eklemeyi düşünün.
  3. Kuluçkadan sonra, polistiren yuvarlak alt akış sitometri tüpünde lekeli süspansiyonu (~100 μL) aktarın ve 10x lysis tamponunun 1 kısmını seyrelterek ve 10 parça distile su ile 10 adet kuluçka yada 10 - Kırmızı kan hücrelerini lyse için 15 dk.
    NOT: Kırmızı kan hücresi lisisini değerlendirmek için bulanıklığı gözlemleyin. Örnek netleştikten sonra, lysis tamamlanır.
  4. Lysis sonra, bir pelet almak için 5 dakika için 4 ° C 300 x g 300 x g FACS tampon 3 mL ekleyin. 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de 3 mL FACS tamponu ekleyerek yıkamayı tekrarlayın.
  5. Taze yapılmış hücreleri düzeltmek 1% paraformaldehit (PFA) ve akış sitometre üzerinde lekeli hücreleri elde, akış yazılımı ile analiz.
  6. Analiz için, bir FSC/SSC çiziminde gating lenfositler seçin, ardından FSC-alan/FSC yüksekliğinde tek hücreli gating.
  7. Ayrıca, tek hücreli popülasyonda insana özgü CD45 (hCD45) kapısı ve murine kökenli hücrelerin dışlanması için fareye özgü CD45 (mCD45) içerir. Lekesiz hücrelerin gating dayalı lekeli popülasyonun strateji gating.
  8. Kapı hCD45+ hücreleri CD3+ T hücreleri ve CD19+ B hücrelerinin sıklığını belirlemek için. CD4 ve CD8 alt kümelerini belirlemek için T hücreleri kapısı. Monositleri değerlendirmek için CD14+ monositleri belirlemek için hCD45'te geçit.

5. TK-NOG Farelerin HIV Enfeksiyonu ve İnsan Karaciğeri ve Bağışıklık Sistemi Üzerindeki Etkisi

  1. HIV-1 virüsünü ve tüm enfekte fareleri belirlenmiş bir biyogüvenlik seviyesi 2 tesisinde ele alın.
    DİkKAT: Otoklav ve çift biyolojik tehlike torbaları tüm HIV enfekte atıklar atın. Güvenlik nedenlerinden dolayı, HIV bulaşmış fareleri teslim ederken kesmeye dayanıklı eldivenler giyin.
  2. Virüsle çalışırken tek kullanımlık tulum gece elbisesi, ayakkabı kapakları, yüz maskesi ve çift eldiven içeren kişisel koruma ekipmanı (PPE) giyin.
  3. İnsan CD45+ hücrelerinin %15'inden fazlasının yeniden yapılandırılması (adım 4.7'de test edilmiş) ve serumda HIV-1 enfeksiyonu için insan albumini bulunan fareleri seçin (adım 4.1'de test edilmiştir).
  4. Farelere fare başına 100 - 200 μL hacimde 1 x 103 ila 1 x 104 doku kültürü enfeksiyöz dozları 50 (TCID50)ADA enjekte edin.
  5. Hiv ile enfekte fareler 5 hafta postenfeksiyon kullanarak ötanazi isoflurane (bir isofluran buhar konsantrasyonu ile >5%).
  6. Fareler ötenazi sonra, serum izolasyonu için bir kardiyak delinme ile EDTA tüplerde kan toplamak, ELISA tarafından insana özgü albumin düzeylerini değerlendirerek karaciğer üzerinde HIV-1 etkisini görmek için (bkz. adım 4.1) ve kan hücreleri insan bağışıklık değişiklikleri olup olmadığını kontrol etmek için akış sitometrisi kullanan hücreler (bkz. 4.2 - 4.8. adımlar).
    NOT: Farelerin enfekte olup olmadığını doğrulamak için periferik viral yükü 5 hafta postenfeksiyon bir biyoanalizör üzerinde değerlendirin.
  7. Kan aldıktan sonra, ötenazi farelerden karaciğeri çıkarmak.
  8. Karaciğer eksizyonu için, ksikphoid deri, kas ve periton derin1.5 - 2 cm uzunluğunda ve 0.5 cm derin bir kesi yaparak karın boşluğu ortaya çıkarmak. Karaciğer ve diyafram arasında omurgaya dik bir kesim yapın. Karaciğeri kaldırın ve mide ve bağırsaklara takılan tüm zarları ayırın.
  9. Toplamak ve% 4 paraformaldehit karaciğer düzeltmek ve insana özgü CK18 antikor kullanarak CK18+ hepatositler HIV etkisini değerlendirmek için standart bir immünohistokimyasal protokol izleyin8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İnsan karaciğeri ve bağışıklık hücreleri ile çift insanlı fare modelinin kurulması, sırasıyla çok basit ELISA ve akış sitometrisi ile her adımda kolayca izlenebilir. Akış sitometrisi fonksiyonel bir bağışıklık sisteminin gelişimini değerlendirmek ve HIV enfeksiyonunun bağışıklık hücreleri üzerindeki etkisini görmek için düzenli olarak yapılır. Çift insanlaşmış farelerde, fonksiyonel bağışıklık hücrelerinin gelişimi lenfosit kapısının% 15...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Karaciğer, HIV'li hastalarda24. HIV-1 varlığında insan karaciğer hastalıkları nın incelenmesi için deneysel küçük hayvan modelleri son derece sınırlıdır, CD34 ile birkaç cotransplanted hayvan modelleri durumuna rağmen+ HSPCs ve hepatosit7 ,12, 25. yıl. In vitro deneylerde hepatositlerin düşük seviyeli HIV-1 enfeksiyonu olduğu gösterilmiştir26. ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü hibe R24OD018546 (L.Y.P. ve S.G.) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Weizhe Li, Ph.D., cerrahi işlemlerde yardım için teşekkür etmek istiyorum, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng immünohistoloji için, UNMC akış sitometri araştırma tesisi üyeleri Direktörü Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., ve Samantha Wall, B.S., UNMC gelişmiş mikroskopi çekirdek tesis üyeleri Janice A. Taylor, B.S., ve James R. Talaska, B.S., teknik destek için. Yazarlar Dr Mamoru Ito ve Hiroshi Suemizu CIEA tk-NOG fareler ve Dr Joachim Baumgart treosulfan sağlamak için sağlamak için kabul. Yazarlar Dr Adrian Koesters, UNMC, onun editoryal katkılarından dolayı el yazması teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
27 G1/2" needlesBD biosciences305109
30 G1/2" needlesBD biosciences305106
5 mL polystyrene  round-bottom tube 12 mm x 75 mm styleCorning352054
BD 1 mL Tuberculin Syringe Without NeedleBD biosciences309659
BD FACS array bioanalyzer BD BiosciencesFor purity check of eluted CD34+ cells 
BD FACS array softwareBD BiosciencesSoftware to analysis acquired CD34+ cell on FACS array
BD FACS lysing solutionBD Biosciences349202To lyse red blood cells
BD LSR IIBD BiosciencesInstrument for acquisiton of flow cytometry samples
BD Vacutainer Plastic Blood Collection TubeBD biosciencesBD 367874To collect Cord blood
Bovine Serum Albumin Sigma-aldrichA9576
BuprenorphineControlled substance and pain-killer
CD14-PEBD Biosciences555398Specific to human
CD19-BV605BD Biosciences562653Specific to human
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-046-702For isoation of   CD34+ HSPC
CD34-PE, humanMiltenyi Biotec130-081-002Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells 
CD3-AF700BD Biosciences557943Specific to human
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105Specific to human
CD4-APCBD Biosciences555349Specific to human
CD8-BV421BD Biosciences562428Specific to human
Cell counting slidesBio-rad1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue KitThermofisher scientificCS11204for extraction of genomic DNA from ear piece
Cobas Amplicor system v1.5 Roche Molecular Diagnosticsbioanalyzer to measure viral load
Cotton-tipped applicators  McKesson24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18)DAKOM7010Specific to human
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path SterileBD biosciences30914Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion
FACS Diva version 6BD Biosciencesflow cytometer software required for  acqusition of sample
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10438026
FLOWJO analysis software
v10.2		FLOWJO, LLCflow cytometry analysis software
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110Prescripition drug
Greiner MiniCollect EDTA TubesGreiner bio-one450475
Hepatocytes thawing medium Triangle Research Labs MCHT50
Horizon Open Ligating Clip AppliersTeleflex537061To hold the ligating clips
Hospira Sterile Water for InjectionACE surgical supply co. Inc.001-1187For dilution of Buprenorphine (pain-killer)
Human Albumin ELISA Quantitation SetBethyl laboratoriesE80-129For assesing human albumin levels in mouse serum
Human hepatocyteTriangle Research Labs HUCP1 Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified 
Iris Scissors, StraightTed Pella, Inc.13295
LancetMEDIpointGoldenrod 5 mm
LS columns Miltenyi Biotec130-042-401Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection)
Lymphocyte Separation Medium (LSM)MP Biomedicals50494For isoation of   lymphocytes from peripheral blood
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303holds Qudro MACS seperator and LS columns
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605Used to make an incision on skin to expose spleen
Micro Dissecting ForcepsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5157 to hold and pull out spleen from peritoneal cavity
mouse CD45-FITCBD Biosciences553080mouse-specific
PBS (Phosphate Buffered Saline)HycloneSH30256.02
Qudro MACS separator Miltenyi Biotec130-090-976holds four LS columns
RPMI 1640 mediumGibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR Applied BiosystemsInstrument used  to  genotype
Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1mlDYMAX CORPT15469Used to  dispense  HSPC and HEP supension in controlled manner
Suturevet PGA synthetic absorbale sutureHenry Schein Animal Health41178Suturing of skin and peritoneum
TaqMan Gene Expression Master MixThermofisher scientific4369016
TC20 automated cell counterBio-rad1450102
TK-NOG mice Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu)
TreosulfanMedac GmbHProvided by  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan BlueBio-rad1450022
Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm LTed Pella, Inc.1346Used to make an incision on skin to expose spleen
Weck hemoclip traditional titanium ligating clipsEsutures523700To ligate the spleen post-injection

Referanslar

  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820(2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817(2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 151ift insanla m fareleralbuminhepatositlerinsanla m karaci erinsan ba kl k sistemiinsan imm n yetmezlik vir s 1 HIV 1hematopoetik k k h crelerhematopoetik ata h creleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır