JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı ex vivo karakterizasyonu immunomodulators, kızamık virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama kullanarak ifade oncolytic virüslerin ve nesil için ayrıntılı bir iş akışı açıklar. Uygulama ve uyarlama diğer vektör platformları ve transgenes klinik çeviri için roman immunovirotherapeutics gelişimi hızlanır.

Özet

Başarılı kanserli hastalarda uzun süreli tümör kontrolü elde etmek için potansiyeli vardır. Son klinik başarılara rağmen bireysel tümör bağışıklık profillerine uygun güvenli ve etkili tedaviler için acil bir ihtiyaç kalır. Oncolytic virüs anti-tümör bağışıklık yanıtı hem de tümör sınırlanmış gen ekspresyonu indüksiyon etkinleştirin. Bu iletişim kuralı immunomodulatory oncolytic vektörler üretimi ve ex vivo analizini açıklar. Kızamık aşı virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama odaklanan, diğer virüs türler ve transgenes genel metodoloji adapte edilebilir. Sunulan iş akışı tasarımı, klonlama, kurtarma ve rekombinant virüslerin yayılmasını içerir. Kinetik ve Yöneyin litik aktivite yanı sıra ex vivo izole Immünomodülatör işlevselliğini çözümlemek için deneyleri dahil, böylece roman ajanlar üretimi daha da geliştirilmesi preklinik modelleri için kolaylaştırmak ve sonuçta klinik çeviri.

Giriş

Oncolytic virüs (OVs) özellikle içinde çoğaltmak ve sağlıklı dokulara olduğu gibi bırakarak tümör hücrelerini öldürmek anti-kanser tedavi olarak geliştirilmektedir. Bu, şimdi bu oncolytic virotherapy (OVT), çoğu durumda anlama yaygın hale gelmiştir yalnızca tam Tümör lizis verimli yineleme ve yayılan virüs tarafından dayanmaz ancak tedavi başarı için ek mekanizmaları eylem gerektirir dahil olmak üzere vasküler ve stromal hedefleme ve daha da önemlisi, immün stimülasyon1,2,3,4. Birçok erken OV çalışma değiştirilmemiş virüs kullanılan iken, mevcut araştırma anlama, potansiyel olarak Roman OVs ve gelişmiş OV oluşturmak için genetik mühendisliği tarafından sunulan olanakları içeren virüs biobanks geliştirilmiş bir biyolojik kazançlı platformlar5,6,7.

İmmünoterapi son başarısı göz önüne alındığında, OVs. genetik mühendisliği ile ilgili özel ilgi immunomodulatory transgenes vardır Tür gen ürünlerin OV-enfekte tümör hücreleri tarafından hedeflenen ifade için sistemik yönetim karşılaştırıldığında toksisite azaltır. Hedefleme ile doğal oncoselectivity virüs kullanarak veya viral tropism8değiştirme elde edilir. Yerel immunomodulation OVT çok yönlü anti-tümör mekanizmalarının geliştirir. Ayrıca, bu virüs, tümör hücreleri ve ana bağışıklık sistemi arasında Interplay sorguya enstrümantal bir stratejidir. Bu amaçla, bu iletişim kuralını tasarlama, clone, kurtarmak, yaymak ve oncolytic paramyxovirus (özellikle kızamık virüsü) vektörel çizimler böyle transgenes kodlama doğrulamak için bir uygulanabilir ve ayarlanabilir iş akışı sağlar.

Modülasyon bağışıklık yanıtının çok çeşitli kanser-bağışıklık döngüsü9tümör antijen tanıma [Örneğin, tümör ilişkili antijenleri (TAAs) veya indükleyicileri, geliştirilmesi de dahil olmak üzere, farklı adımları hedefleme transgene ürünleri tarafından elde edilebilir MHC kompleksi (MHC) sınıf ı molekülleri] dendritik hücre olgunlaşma verimli antijen sunumu (sitokinler); destekleyen üzerinde işe alma ve istenen bağışıklık hücreleri gibi etkinleştirme sitotoksik ve yardımcı T hücreleri [kemokinler, bispecific T hücre engagers (BTEs)]; hedefleme süpresif hücreleri gibi düzenleyici T hücreleri, myeloid kaynaklı bastırıcı hücreler, makrofajlar tümör ilişkili ve kanser ilişkili fibroblastlar (antikorlar, BTEs, sitokinler); ve efektör hücre inhibisyonu ve bitkinlik (denetim noktası inhibitörleri) önlenmesi. Böylece, bir bolluk biyolojik ajanlar kullanılabilir. Bu tür virüs kodlanmış immunomodulators terapötik etkinlik ve olası sinerji ile ilgili olarak hem de kendi mekanizmaları anlama değerlendirilmesi kanser tedavisi geliştirmek gereklidir.

Negatif anlamda tek iplikçikli RNA virüsleri Paramyxoviridae ailesine oncolytic vektör olarak çeşitli özellikler bunların kullanımı için elverişli karakterizedir. Bunlar doğal oncotropism, transgenes (daha--dan 5 kb)10,11, syncytia formasyonu ve yüksek immünojenisite12gibi yayılan verimli geniş genomik kapasite bulunmaktadır. Bu nedenle, Canine distemper virüs13, kabakulak virüsü14, Newcastle hastalığı virüsü15, Sendai virüs16,17, simian virüs 518ve Tupaia paramyxovirus19 temel OV platformlar geliştirilmiştir. En belirgin, canlı zayıflatılmış kızamık virüsü aşı suşları (MV) preklinik ve klinik geliştirme20,21' ilerlemiştir. Bu virüs suşları bir mükemmel Emanet kayıt22ile rutin aşılama için yıllardır kullanılmaktadır. Ayrıca, paramyxovirusler kesinlikle sitozolik çoğaltma nedeniyle insertional mutagenesis için hiçbir risk yok. Transgenes ek transkripsiyon birimleri (ATUs) içine ekleme için sağlayan Anti-genomik cDNA dayalı bir çok yönlü ters genetik sistem mevcut11,23,24' tür. Sodyum iyodür simporter (MV-NIS) viral gen ifadesinin bir surrogate marker olarak görüntüleme ve radyoterapi veya çözünür carcinoembryonic antijen (MV-CEA) için kodlama MV vektörel çizimler klinik deneylere (NCT02962167, NCT02068794, şu anda değerlendirilen NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 ve NCT00408590). Güvenli yönetim doğruladı ve vaka anti-tümör etkinliğinin önceki çalışmalar25,26,27,28,29, rapor 30 (Msaouel et al.31tarafından gözden geçirilmiş), ek oncolytic kızamık virüs, geliştirilen ve preclinically test için önünü. Kanser-bağışıklık döngüsünün farklı adımları hedefleme molekülleri tümör büyüme gecikme ve/veya immün aracılı etkinlik ve uzun süreli koruyucu bağışıklık bellekte syngeneic için kanıt ile fareler, hayatta kalma uzatmak için gösterilen immunomodulatory kodlama MV fare modelleri. Transgenes vektör kodlamalı granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)32,33, H. pylori nötrofil aktive protein34, bağışıklık denetim noktası inhibitörleri35dahil, İnterlökin-12 (IL-12)36, TAAs37ve BTEs38, hangi bir tümör bölünmelerini CD3 ile HCV ve bu nedenle anti-tümör faaliyet T hücre reseptör özgüllük ve Co stimülasyon (bakılmaksızın poliklonal T hücreleri tarafından neden Şekil 1). Bu yapıları talep daha fazla translasyonel çabaları için elde edilen umut verici preklinik sonuçları.

Talimogene laherparepvec (T-VEC), bir tür ben GM-CSF, kodlama herpes simpleks virüsü tek oncolytic tedavi Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanmış olduğunu. Onayları için geç 2015 yılında önde gelen Faz III çalışmada yalnızca gelişmiş melanom39etkinlik içi tumoral enjeksiyon, aynı zamanda abscopal etkileri (yani, remisyon sigara enjekte lezyonların) yerinde gösterilen değil. T-VEC beri ek denemeler kombinasyonu terapileri, özellikle bağışıklık denetim noktası ile değerlendirilmesi ve uygulama diğer tümör varlıklarda (örneğin, Sigara Melanom cilt kanseri, NCT03458117; pankreas kanseri, NCT03086642) için girdi inhibitörleri (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 ve Ribas et al.40).

Bu sadece da OVT ve immunomodulation üstün birleşimlerini tanımlamak daha fazla araştırma ihtiyacını oncolytic immünoterapi potansiyelini gösterir. Ek vektörel çizimler ve preklinik test etmek için geliştirme rasyonel tasarım bu girişim için anahtardır. Bu da temel mekanizmaları anlayışı ilerletmek ve daha fazla kişiselleştirilmiş kanser tedavisi doğru ilerleme için sonuçları vardır. Bu amaçla, bu yayın için değişiklik ve geliştirme için hedeflenen kanserli hastalarda paramyxovirusler ve daha ayrıntılı olarak, oncolytic kızamık virüs T hücre ilgi çekici antikorlar (Şekil 2) kodlama yöntemi sunar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: [O], [P] ve [alt bölümleri için geçerli göstermek M]: genel, (en) paramyxovirusler veya yalnızca, MV OVs sırasıyla. [B] bölümleri özel BTE transgenes için gösterir.

1 Immünomodülatör kodlama Transgenes kızamık virüsü vektörel çizimler klonlama

  1. [O] tasarım sıra ekleyin.
    1. [O] karar üzerinde bir Immünomodülatör edebiyat araştırma veya genetik ekranlar41 gibi keşif verileri temel ilgi ve GenBank, Avrupa nükleotit arşiv gibi uygun veritabanları ilgili cDNA sıra türetin veya Uluslararası ImMunoGeneTics bilgi sistemi (IMGT).
    2. [O] ek özellikler transgene sıra (Şekil 3) ekleyin. Bir önceki Kozak sırası ve species-specific Kodon optimizasyonu ifade geliştirebilirsiniz. Sinyal dizileri salgılanması için gereklidir. N - ve/veya C-terminal protein Etiketler algılama ve arıtma42için kodlama dizileri içerir. Vektör içine ekleme için kısıtlama siteleri içerir.
      Not: [M] MV polimeraz geni barındıran ek transkripsiyon birimleri (ATUs) başlatmak ve durdurmak sinyalleri rekombinant MV genleri ifadeden transgene için gereklidir. Uygun Anti-genomik cDNA vektörler, CMV rehberleri ve olumlu anlamda transgenes tanımlanmış pozisyonlarda, giriş için benzersiz kısıtlama sitelerle içeren ATUs tarafından kontrol daha önce11geliştirdik. [P] viral çoğaltma ve transgene ifade ifade degrade paramyxovirusler43için tipik nedeniyle etkiler yeterli transgene konumlandırma çok önemlidir. Anti-genom 3' sonuna yakın bir ATU giriş (i.e., lider konumda veya P gen aşağı akım) genel olarak sonuçları yüksek transgene ifade azaltılmış viral çoğaltma pahasına. Artan çoğaltma ve transgene ifade düzeyi düşük aşağı H gen ATU kullanırken beklenebilir. Ambalaj kızamık virüsü, dahil olmak üzere birkaç paramyxovirusler genomunun her nükleokapsid proteini44tarafından altı nükleotit bağlama gerektirir. Transgenes öyle virüs içine sokmak için komple genom nükleotit sayısı altıya kadar bölünebilir olmasını sağlamak. Bu da "kural altı"45,46anılır. Gerekiyorsa, ek nükleotit olmadan tanıtan çerçeve vardiya veya erken kodon Ekle (Kozak sırası akış yukarı veya aşağı kodonu) ekleyin. [M] MV gen başlangıç (AGGRNCMARGW) benzer ve (RTTAWANAAAA) sinyalleri ve RNA dizileri (AAAAAGGG) düzenleme durdurmak belirli transgene serilerinde kaçının. Böyle bir fikir birliği dizileri yayınlandı (örneğin, Parklar ve ark.47bakınız).
    3. [O] istenen sırayı oligonükleotid satın alabilir veya kullanılabilir dizileri standart moleküler klonlama48kullanarak birleştirin.
      Not: [O] ters yönde kısıtlama site ve ilk 15-20 nükleotit ekleme ve son 15-20 nükleotit ucun aşağı akım kısıtlaması tarafından takip de dahil olmak üzere geriye doğru bir astar gibi ileri bir astar transgene PCR amplifikasyon için Tasarla site.
  2. [O] clone sokmak içine DNA genom viral (anti-) kodlama.
    1. [O] ekleme DNA vektörel çizimler clone ya da DNA RNA virüsleri Anti-genleri standart moleküler klonlama teknikleri48 (DNA ligasyonu tarafından takip yani, enzimatik kısıtlama) tarafından.
      1. [O] uyumlu olmayan kısıtlama siteleri kullanarak veya ligasyonu önce de-fosforilasyon Yöneyin yeniden ligasyonu önlemek.
      2. [O] tüp ligasyonu ürüne göre özel Jel Elektroforez ve piyasada kitleri kullanarak sonraki jel arıtma izole et. Genel olarak, en iyi tüp ligasyonu verimliliği vektör için INSERT molar 3:1 oranında elde edilir.
    2. [O] yetkili bakteri ligasyonu üründe büyük plazmid verimli kurtarma için uygun dönüşüm (yani, Isı şok E. coli49gerçekleştirmek) ve bakteriyel klonlar doğru DNA koloni PCR50 tarafından yataklık tanımlamak .
    3. [O] izole DNA piyasada bulunan DNA hazırlık kitleri kullanarak tek bir bakteriyel klon güçlendirilmiş. Uygun enzimleri ile denetim digest tarafından genomik bütünlüğünü onaylamak (örneğin, HindIII MV genleri [M] için). Sıralama tarafından doğru ekleme ve transgene bütünlüğünü doğrulayın.
      Not: [M] MV H- ATU, eklenen transgenes Sanger gerçekleştirmek için aşağıdaki astar ile sıralama: H-9018 [ileri astar, bağlar MV genom konuma 9018 H çerçeve (ORF) okuma açık]: 5' GTGTGCTTGCGGACTCAGAATC 3'; L-9249 + ( L ORF 9249 astar, MV genom pozisyon bağlanır ters): 5' CAGATAGCGAGTCCATAACGG 3'.

2. tahlisiye rekombinant kızamık virüs parçacıkları Immunomodulators kodlama

  1. [O] rekombinant virüs parçacıkları (anti-) genomik DNA via transfection virüs yapımcı hücre göre ilgili virüs için standart iletişim kuralı oluşturmak. Steril koşullarda çalışmak için yönergeleri izleyin. Hücre kültürü altında başlıklar, özellikle Sınıf II biyolojik emanet dolapları virüs içeren tüm adımları gerçekleştirin.
    1. [M] için kurtarma kızamık virüs cDNA23,24, MV yapımcı plaka (Afrika yeşil maymun böbrek kaynaklı Vero) hücreler eşit bir tabakta 6-Peki 24 saat önce transfection. Tohum 2 x 105 2 mL % 65-75 confluency transfection anda ulaşmak için de ücret Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) % 10 fetal Sığır serum (FBS) içeren hücreleri.
      Not: [P] virüs kaynaklı syncytia oluşumu önce hücreleri sarmak hücre sayıları azaltın.
    2. [P] Transfect hücreleri DNA ile viral Anti-genom, gerekli yardımcı plazmid kodlama ve istenirse, bir plazmid kodlama transfection etkinliğini değerlendirmek için floresan bir muhabir.
      1. [M] Mix 5 µg rekombinant DNA kızamık virüs anti-genom, 500 kodlama her memeli ifade plazmid kodlama kızamık virüsü N ve m proteinleri ve 100 ng her P protein ve 200 µL DMEM toplam hacmi floresan bir muhabiri kodlama plazmid ng.
      2. Hemen tüp flicking tarafından karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 25 min için kuluçkaya liposomal transfection reaktif 18.6 µL ekleyin.
      3. [P] değiştirmek orta DMEM, % 2 FBS, 50 µg/mL sefaloridin (veya diğer antibiyotiklere kontaminasyonu önlemek için) ile 1,8 mL iyi, o zaman transfection karıştırmak dropwise kuyuya ekleyin ve dikkatle girdap. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2hücreleri kuluçkaya. Orta ile 2 mL taze DMEM, %2 FBS ve 50 µg/mL sefaloridin ertesi gün yerine; Orta asidik hale geldiğinde bu işlemi yineleyin.
        Uyarı: [O] başa hücreleri ve biyogüvenlik düzenlemeler, malzemeleri gibi virüs transfection aşağıdaki adımlarda üzerinden mevcut olabilir. (Potansiyel olarak) bulaşıcı kaybı uygun şekilde atın.
  2. [P] toplamak ve virüs parçacıkları aktarabilirsiniz.
    1. [P] hücre günlük Mikroskopi için muhabir gen ifade ve syncytia oluşumu (Şekil 4) tarafından gözlemlemek. Hasat virüs 20 veya daha fazla hücre oluşan büyük syncytia görünür olduğunda veya hücreleri çok yoğun olunca (i.e., genellikle 7-9 gün sonra birden çok katman içinde büyümeye başladıklarında).
      Not: [P] Eğer hiçbir syncytia için verilen vektör yapı gözlenir, bu mutlaka kurtarma başarısız olduğunu anlamına gelmez. Bulaşıcı virüs yine de örnek mevcut olabilir gibi passaging için taze yapımcı hücreleri aktarın.
    2. [P] tohum yaklaşık 1.5 x 106 üretici hücreler 12 FBS, 10 cm üzerinde beklenen hasat veya 2.5 x 106 hücre başına önce 24 h yemekleri ml DMEM % 10 ile % 65-75 confluency virüs inoculat anda ulaşmak için virüs passaging önce 4-6 h plaka İyon.
    3. [P] virüs Döl toplamak için dikkatle yapisan yapımcı hücreleri kullanarak bir hücre sıyırıcı plaka scrape ve hücreleri içeren bir santrifüj tüpüne süpernatant aktarmak. Santrifüjü 2500 x g de 5 min ve 4 ° c için hücre artıkları çıkarın
      Not: Alıntı hücreleri doğrudan Santrifüjü virüs ertelenmiş suboptimal kültür koşulları ve potansiyel mikroskobu eserler pahasına en üst düzeye çıkarmak için olmadan transfer edilebilir.
      Dikkat: ne zaman hücre kazıma medya dökülmesini [O] kaçının. Aerosol oluşumu en aza indirmek.
    4. [P] inoculum boş hücre süpernatant adım 2.2.3 serum-Alerjik orta ve 4 mL son hacmi ile karıştırılarak hazır olun. Yapımcı hücreleri üzerinde orta inoculum tarafından değiştirin ve hücreler için en az 2 h 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya. DMEM 6 mL % 10 ile ekleyin FBS ve gecede orta taze DMEM % 10 ile 12 ml değiştirmeden önce hücreleri kuluçkaya FBS.
    5. [P] gözlemlemek günde en az iki kez hücre ve hasat virüs syncytia patlama önce (yanizarı bozulma görünür olduğunda, ). Virüs ilk geçiş hasat için süpernatant plaka, 600 µL serum-Alerjik orta eklemek, bir hücre lifter hücrelerle kazımak ve temiz bir tüp transfer çıkarın.
      Not: [M] virüs suşu51,52 ve enfeksiyon ilerleme bağlı olarak, enfekte hücreleri ile plakalar 32 ° C için viral çoğaltma ve yayılmasını kolaylaştıracak aktarın. Genel olarak, MV Schwarz suşları 32 ° C sonuçlarında daha yavaş syncytia oluşumu ama daha yüksek titreleri Edmonston B zorlanma virüs ile enfekte hücreleri transferi sırasında 37 ° C de yaymak.
      Not: [P] Bu viral parçacıkların azaltılmış infektivite içinde yol açar gibi hasat sırasında kurumaya hücre katmanı hasarların. Bazı virüs ne zaman enfekte hücreleri süpernatant atarak kayıp olmasına rağmen daha yüksek titreleri hücre katmanı elde edilebilir.
    6. [P] hemen virüs süspansiyon sıvı azot dondur. Mağaza için ayrıntılı sağlamak en az 24 saat-80 ° C'de buz gibi. Birkaç gün için yordamı, böldüğüm için gerekirse genişletir.
    7. Viral parçacıkların 37 ° C'de çözdürme tarafından serbest bırakmak Vortexing ve santrifüj 2500 x g de 5 min ve 4 ° c için homojenize Etiketli cryotubes ve mağaza-80 ° C'de supernatants transfer
      Not: [O] virüs sonraki deneyler için yeterli aliquot boyutlarda tercihen yalnızca bir kez çözdürülen ve hemen kullanılan depolamalısınız. [P] daha fazla donma-döngüleri veya depolama viral titreleri önemli azalma birkaç gün sonucu üzerinde 4 ° C'de çözülme.
    8. [P] gerekli miktar ve titresi, elde etmek için daha fazla passaging önce bir gün 4 x 106 yapımcı hücrelerde DMEM 12 mL % 10 ile tohum FBS 15 cm yemekleri. Virüs enfeksiyonu (MOI) 0.03 çokluğu, aşılamak. 8 ml serum-Alerjik orta plaka başına bulaştırmak ve orta DMEM için % 10 ile değiştirin FBS birden çok plakaları kullanarak hücreleri en az 2 h. ölçek için kuluçka sonra.
    9. Hasat açıklandığı gibi adım 2.2.5, ne zaman syncytia bütün hücre katmanı arasında yayıldı. 50 mL tüpler ve süreç içinde elde edilen süspansiyonlar adımları 2.2.6–2.2.7 içinde açıklandığı gibi bilardo.
      Not: [O] Bu hasat önce görsel olarak bakteriyel ve mantar kirlenme için tüm plakaları kontrol etmek önemlidir. Genel olarak, tüm hücre hatları ile Mikoplazma ya da çok katmanlı PCR adventif virüslerin bulaşma için düzenli olarak kontrol edin.
  3. [P] değerlendir viral titreleri. 96-şey plakaları kullanarak aliquot başına octuplicates virüs stoklarının titreleri belirlemek. Virüs kurtarma başına üç bireysel aliquots titrasyon gerçekleştirmek ve deneylerde kullanılmak üzere virüs süspansiyon miktarını hesaplamak için ortalama değerini kullanın.
    1. [P] Yapımcı hücreleri, sayısı ve 1.5 x DMEM mL % 10 ile başına 105 hücre küçültme/büyütme havuzu FBS.
    2. [P] DMEM damlalıklı 90 µL % 10 ile FBS 96-şey plaka her kuyuya.
    3. [P] 10 µL virüs hisse senedi bir aliquot plaka ilk sütundaki tüm 8 wells ekleyin ve yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın.
    4. [P] virüs seri 10 kat dilutions gerçekleştirin. Her kuyudan 10 µL aktarmak çok kanallı damlalıklı kullanarak ikinci sütun için ilk. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından iyice karıştırın ve taze damlalıklı ipuçlarını her seyreltme adım için kullanın. Son sütunun her kuyudan 10 µL atmak.
      Not: Her 96-şey plaka için 12 seri seyreltme adımları sağlar. [M] MV vektörler, 10 kat dilutions 8 adımlar genellikle yeterli, 1 x 109 hücre bulaşıcı birimleri yukarıda titreleri olarak (UKÜ) /mL nadiren elde edilir 2.2. adımda anlatılan yayma yöntemi tarafından. [P] denetim wells virüs olmadan ürününü karşılaştırma listesine ve kirlenme izlemek için kullanılabilir.
    5. [P] her şey için hücre süspansiyon, 100 µL ekleyin ve 37 ° c, % 5 CO2 48 h. hücreleri homojen dağılımı elde etmek için süspansiyon hücre kümeleri yokluğu sağlamak için kuluçkaya.
    6. [P] syncytia hafif bir mikroskop kullanarak denetle. Syncytia her iyi sütun görünür syncytia içeren en yüksek seyreltme faktörü ile saymak.
    7. [P] syncytia toplam sayısı sekiz tarafından bölerek syncytia o sütun bir kuyu başına ortalama sayısını hesaplayın. O ortalama 102 UKÜ mL için ilk sütun53 başına başlayan sütun, seyreltme faktörü ile çarpın (bkz Şekil 5 örnek olarak).

3. Viral vektörler Immunomodulators kodlama ikileştirici ve sitotoksik kapasiteleri belirleme

  1. [O] kinetik oluşturulan rekombinant virüs ve değiştirilmemiş vektör tek veya çok adımlı büyüme eğrileri (GCs) ile karşılaştırın. Tek adımlı GCs için viral Döl tüm hücrelerin (teorik olarak, % 100 enfeksiyon) eşzamanlı enfeksiyon takip değerlendirilir. Birkaç takip etmek enfekte hücreleri düşük yüzdesi çok adımlı GCs başında mermi virüs çoğaltma.
    1. [M] kızamık virüsü kinetik analizi için 1 x 105 Vero hücreleri DMEM 1 ml % 10 ile tohum FBS iyi 12-şey plakaları enfeksiyonu önce bir gün başına. Her timepoint ilgi için en az iki kuyu teknik çoğaltır plaka.
    2. [O] bulaştırmak virüs çok adım için düşük MOI veya tek adımlı GCs [M] için yüksek MOI hücrelerle (0.03 ve MV çoğaltma Vero tarih için 3 hücreleri, sırasıyla). Virüs ilgili miktarı içeren serum-Alerjik orta 300 µL ile orta yerine ve 37 ° C ve % 5 CO2 en az 2 h. Kaldır inoculum için kuluçkaya, DMEM 1 mL % 10 ile eklemek FBS ve kuluçka devam.
    3. [P] 12, 24, 36, 48, 72 ve enfeksiyon sonra 96 h gibi ilgili timepoints, viral Döl doğrudan hücre orta kazıma hasat. İçeriği her kuyudan için bireysel bir tüp aktarın, ek-sıvı azot donma ve titrasyon kadar-80 ° C'de depolayın.
      Not: [P] Çoğalt örnekleri ortalama titreleri çözümlenmesi için bu adımı havuza alınmış.
    4. [P] tüm timepoints örnekler toplamak. Aynı anda 37 ° C'de viral Döl değerlendirilmesi için çözülme. Girdap ve Pelet hücre artıkları Santrifüjü 2500 x g ve 4 ° c, 5 min için tarafından
    5. [P] her yapı ve yukarıda açıklandığı gibi timepoint ortalama titreleri hesaplayın. Titreleri zaman içinde arsa. Vektörel çizimler ve eklenen transgenes, farklı transgenes ya da transgenes farklı konumlarda takılı olmayan büyüme eğrileri incelemenizi öneririz (bkz. Şekil 6A).
  2. [O] Immünomodülatör kodlama ve unmodified virüslerin litik faaliyetleri karşılaştırın.
    1. [O] seçin empedans ölçümleri, laktat dehidrogenaz (karaciğer) dahil olmak üzere mümkün metodolojileri tahlil yayınlama veya Renkölçer hücre metabolizması tabanlı canlılık [Örneğin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT deneyleri ) ve 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) deneyleri].
      1. [M] kızamık sitotoksisite analiz etmek için XTT kullanarak virüs vektörel çizimler tahlil, 3.1.1. adımda açıklandığı gibi tohum Vero hücreleri. Her timepoint için sigara enfekte denetiminin çoğaltır içerir.
        Not: [O] performans XTT tahlil farklı timepoints de aynı örnek üzerinde teknik hatalar sınırlayabilirsiniz, ancak tekrarlanan yıkama ve XTT reaktif maruz hücrelerin sayısını etkiler. Empedans alternatif bir okuma için sürekli ölçümler sağlar.
    2. [M] bir MOI 3.1.2. adımda açıklandığı gibi 1 Vero hücreleri enfekte.
      Not: [M] bazı fare tümör hücre hatları gibi daha az izin veren hedef hücrelerin enfeksiyonu için 3 veya 5 daha yüksek bir MOI gerekli olabilir.
    3. [O] adlı timepoints ilgi (e.g., 12, 24, 36, 48, 72 ve enfeksiyon sonra 96 h) XTT reaktifi (i.e., iyi artı % 10 fazla 300 µL) gerekli miktarda hazırlamak. Işığa maruz kaçının.
    4. [M her timepoint] Orta ilgili kuyulardan kaldırın. XTT reaktif 300 µL tarafından eski yerine koymak ve karanlıkta 37 ° C'de kuluçkaya. Reaktif kontrol Wells genellikle 15 dk ile 2 saat arasında sürer, koyu kırmızı açıldığında supernatants toplamak ve -20 ° C'de dondurmak
      Not: [O] kuluçka kez virüs yapısı, hücre tipi, yoğunluk ve cytopathic etkisi bağlıdır.
    5. [O] toplama sonra tüm örneklerini, çözülme aynı anda. Her örneğinin 100 µL bir 96-şey tabağa aktarın ve optik 450 absorbans ölçmek nm ile 630 nm olarak bir referans dalga boyu.
    6. [O] timepoints (x ekseni) vs. optik absorbans örnekleri denetimler, hücre canlılığı (y ekseni) için bir vekil olarak metabolik etkinliğini göstermek göre arsa. Zaman içinde göreli absorbans azalan viral sitotoksisite anlamına gelir (bkz. Şekil 6B).

4. virüs kodlanmış Immunomodulators salgılanan enfekte hücreleri faaliyetini çözümleme

  1. [O] ayrı tut moduyla salgılanan transgene ürünleri virüs bulaşmış hedef hücreleri tarafından dile getirdi.
    1. [P] virüs yapımcı % 70 confluency T175 şişeler içinde hücrelerin büyümesine izin verin.
    2. [P] Orta hücrelerdeki kaldırmak ve serum kaldırmak için PBS iki kez 12 mL ile yıkayın. Hücre ile virüs 0.03 12 mL serum-Alerjik orta bir MOI, aşılamak ve 37 ° C ve % 5 CO2 adlı gecede kuluçkaya. Orta ile 12 mL taze serum-Alerjik orta yerine.
      1. [M] Edmonston B virüs, hücreleri, kuluçka enfeksiyon kolaylaştırmak ve erken syncytia patlama önlemek için başka bir 24 h için 40 h sonra 32 ° C-37 aktarın. En iyi protein verim ve saflık için51,52 ve syncytia ilerleme, kuluçka sıcaklıklar ve kez virüs suşu bağlı olarak ayarlanabilir.
    3. [P] dikkatle supernatants olmadan önce syncytia patlama ayırmayı hücreleri toplamak. Syncytia en iyi şekilde, tüm hücre katmanı arasında yayıldı. 50 mL tüpler havuzu supernatants.
      Not: [P] için transgene ürün etkili arınma, syncytia patlama önlemek ve hücre artıkları enfekte hücreleri supernatants hasat zaman en aza indirmek.
    4. [P] hücre artıkları süpernatant Santrifüjü 2500 x g ve 4 ° C ve geçen, 5 min için 0,22 µm filtreler aracılığıyla kaldırın. Filtrate toplam hacmine bağlı olarak, bu bir şırınga veya bir vakum pompası kullanılarak gerçekleştirilebilir.
    5. [O] bir uygun arıtma yöntemi kullanarak transgene ürün izole et. Proteinler bir hexa-histidin (onun) etiketi ile Ni-NTA mini spin sütunları38 burada kısaca açıklandığı gibi kullanarak benzeşme Satım Kromatografi tarafından (adımları 4.1.5.1–4.1.5.4) arındırmak.
      Not: [O] hızlı ve buz üzerinde tüm adımları gerçekleştirin. Arabellekleri ve önceden serin santrifüj ile 4 ° c önceden chill
      1. [O] 20 mM (tampon 2, WB2 yıkama) ve 500 mM (elüsyon arabellek, EB) 100 mL her arabellek PBS, 200 mM sodyum klorür ve 10 mm (çamaşır tampon 1, WB1), son konsantrasyonlarda imidazole hazırlamak. PH WB1 ve WB2 8.0 ve EB 7.0 için ayarlayın. Saf bağlı olarak protein, imidazole konsantrasyonları ayarlanması gerekebilir.
      2. [O] WB1 ve açık bir kapak ile 2 min için vasıl 800 x g santrifüj 600 µL sütunlarla equilibrate.
      3. [O] sütun üzerine süzülmüş supernatants 600 µL yükleyin. Kapalı bir kapak ile 5 min için 200 x g de Santrifüjü tarafından sütun matris için O'nun öğesini proteinlerin bağlantısına izin. Yükleme ve bağlama 300 µg O'nun öğesini protein sütun başına düşen toplam tekrar edilebilir.
      4. [O] üç kez WB1 ve WB2 ile ya da akış yoluyla renksiz olana kadar bir kez ile yıkayın. Arabellek ve spin 600 µL 800 x g açık kapak ile 2 min için ekleyin.
      5. [O] protein taze bir tüpe vasıl 800 x g2 min için 300 µL EB ve Santrifüjü ile iki elüsyon adımları uygulayarak elute.
      6. [O] desalt ve ürün büyüklüğüne göre Santrifüj filtreleri kullanarak ürün konsantre. PBS hacmi 15 mL ve filtre yoluyla Santrifüjü 4.000 x gde 10 dakika için ekleyin. İstenen saflık kadar yineleyin ve konsantrasyon elde edilir. Protein konsantrasyonu artırmak için son hacim için yaklaşık 200 µL Santrifüjü 4.000 x gde 40 min için azaltın.
  2. [O] saflık ve ürün kimliğini onaylayın.
    1. [O] bicinchoninic asit (BCA) veya Bradford tahlil54,55gibi standart Renkölçer deneyleri kullanarak yalıtır toplam protein miktarını ölçmek. [M] tipik değerler 1-3 µg transgene ürün mL süpernatant enfekte hücre başına arasında olabilir.
    2. [O] için göreli miktar protein yalıtır ve yolu ile Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ayrı ve Coomassie56boyama gerçekleştirmek.
    3. [O] belirli antikor protein veya bir ilişkili peptid etiketi57hedefleme kullanarak immunoblotting tarafından arıtılmış ürünler kimliğini onaylamak.
    4. [O] protein bağlayıcı özgüllük enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) içeren veya akış sitometresi uygun yöntemlerle analiz (bkz. Şekil 7). Son zamanlarda açıklanan manyetik açılan tahlil38kullanarak hücre bağlama onaylanabilir.
      Not: [O] uygun denetimleri kullanın. Hücre bağlama deneyleri, hedeflenen molekül ( Şekil 9gibi) cinsinden ifade değil hücreleri ve hedefleme-protein vekilleri (Şekil 8) ile olumsuz denetimler bulunur. Akış Sitometresi denemelerinde olumlu, dahil negatif ve izotip kontrol eder (Şekil 7).
      1. [O] ortak hedef kuluçkaya hücreleri ve protein izole bağlantısına izin için. [B] periferik kan BTEs analizini bağlama için mononükleer hücreler (PBMCs) insan kanı58, izole kuluçkaya 2.5 x 200 106 hücrelerle BTE ng PBS 100 µL % 1 içinde FBS (bağlama arabellek, BB) buz üzerinde 1 h için.
      2. [B] yıkama hücrelerle BB ilişkisiz protein kaldırmak için 1 mL. 300 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve Pelet BB 100 µL içinde resuspend. Biotinylated antikor protein ilgi veya bir ilişkili peptid etiket hedefleme ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya. Grip hemagglutinin (HA) etiketi, kullanım 100 ng anti-HA-biotin (klon 3F10) ile BTEs için.
      3. [B] 1 mL BB iki kez hücrelerle yıkama ve BB 80 µL içinde resuspend. Manyetik lastikteki streptavidin birleştiğinde 20 µL ekleyin ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
      4. [B] aşırı boncuk kaldırmak ve 2 mM EDTA (sütun arabellek, CB) ile desteklenen BB 500 µL Pelet resuspend için bir kez yıkama.
      5. [B] hücreleri sütunlar ve sağlayıcının kılavuzuna göre manyetik bir stand izole et.
        1. [B] sütunu boyunca yerçekimi akış tarafından geçmesi için CB 500 µL izin vererek equilibrate.
          Not: [B sütun hiç kuru çalıştırmanız gerekir. Damlalıklı dikkatle ve kabarcıklar önlemek için arabellekleri degas.
        2. [B] sütununun altında temiz bir tüp yerleştirin ve hücre/boncuk süspansiyon sütun için geçerlidir. Sütun CB 500 µL yıkama başına üç kez yıkayın. Örnekler süspansiyon ve en az ilk çamaşır adımda tüp akışı aracılığıyla toplamak sonra buz üzerinde depolamak.
        3. [B] boncuk bağlı hücreler tarafından manyetik alan muhafaza elute. Bu amaçla, manyetik standından sütun kaldırmak, temiz bir tüp yerleştirin, CB 1 mL ekleyin ve hızlı bir şekilde arabellek sütunu boyunca bir dalgıç kullanarak tüp içine itin. Tüp buz üzerinde tutun.
      6. [B] santrifüj tüpleri içeren akış yoluyla ve elüsyon örnekleri 16.000 x g ve hücreleri cips 4 ° C, 20 dk için. Supernatants atmak ve radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek hücreleri parçalayıcı (önerilen: 75 µL). SDS-sayfa56gerçekleştirin.
      7. [B] immunoblotting uygun bir birincil antikor kullanarak gerçekleştirin. Antikorlar hedef transgene ürün veya hücresel protein (e.g., β-aktin, Şekil 8) BTE hücreli bağlama değerlendirmek için.
  3. [O] izole immunomodulators immünolojik işlevselliğini değerlendirmek.
    1. [O] ilgili deneyleri kodlanmış Immünomodülatör özelliklerine göre tanımlayın. Beklenen immunomodulatory aktiviteyle ilgili geçiş, olgunlaşma, etkinleştirme veya sitotoksisite hücre çoğalması, değerlendirme yöntemleri uygulanabilir.
      Not: [O] hücre çoğalması CFSE59 etiketleme veya Ki67 boyama60tarafından çözümlenebilir. Transwell veya çizik deneyler hücre göç61analiz etmek kullanılabilir. Olgunlaşma ve Hücre aktivasyonu için ilgili işaretleri uygun boyama protokolleri kullanarak tespit edilebilir. [B] hücresel sitotoksisite BTE aracılı değerlendirmek için kullanılabilir teknikler şunlardır empedans ölçümleri ve krom yayın tahlil. Krom sürüm tahlil için gözle, radyoaktif malzeme işleme uygun güvenlik önlemleri gözlemleyebilirsiniz.
    2. [B] radyoaktif olmayan bir alternatif olarak, aşağıda ayrıntılı olarak karaciğer yayın tahlil (daha önce açıklanan kısa38) tarafından BTE kaynaklı, hücre-aracılı sitotoksisite değerlendirmek açıklar.
      1. [B] karar koşullara deneme sırasında test edilecek (örnek olarak bkz: Şekil 9 ). Timepoints (gün saat) konsantrasyonları Immünomodülatör (µg/ml pg/mL) ve efektör hedef hücre (E:T) oranları (1:50 ve 50: 1, örneğin arasında) değişmekteydi. Her zaman triplicates örneklerinde hazırlayın.
      2. [B] örnekleri olmadan protein içerir ve olmayan efektör hücreler, spontan karaciğer denetimlerinde tek hücre türleri (Tsp ve Esp), bir hedef hücre maksimum lizis denetimini (Tmax) okuma önce bir orta eklendi deterjan ile bırak Sadece kontrol ve ses kontrolü için Tmax.
        Not: [B] gerekli sayıda hedef hücreleri ve kuluçka süreleri değişiklik gösterebilir. İlk test çalıştırmalarını efektör hücreleri ve immunomodulators en uygun parametreleri belirlemek için olmadan gerçekleştirmek. Tsp ve Tmax örnekleri ve farklı hücre sayıları ve timepoints değerlendirmek için ilgili denetimleri içerir.
      3. [B] (yoğunluk gradient Santrifüjü insan kanı PBMCs58 elde etmek için) ya da fare splenocytes62fare T hücre negatif seçim tarafından Örneğin, bağışıklık efektör hücreleri izole et.
      4. [B] tohum hedef hücreleri adım 4.3.2 göre (örneğin, 5 x 10³ iyi başına) bir U-alt 96-şey plaka.
      5. [B] ilgili örnekleri için istenen konsantrasyonlarda izole protein ekleyin. Bağışıklık efektör hücreleri istenilen oranlarıyla ekleyin. Orta bir şey başına 100 µL hacmi ekleyin.
      6. [B] Incubate için belirlenen zaman dilimi içinde adım 4.3.2, tipik arasında 4 ve 48 s (24 unstimulated PBMCs için ve taze izole fare T hücreleri için; 48 saat daha kısa kuluçka süreleri için prestimulated bağışıklık hücreleri uygulayabilirsiniz s), 37 ° C ve % 5 CO2' de.
      7. [B] örnekleri, toplama önce 45 dakika 10 x lizis çözüm 10 µL Tmax örnekleri ve karşılık gelen orta denetimleri içeren wells için ekleyin. Kuluçka devam.
      8. [B] 250 x g 4 dk. Transfer 50 µL her süpernatant düz-alt 96-şey plaka için için hücreleri aşağı spin. Hücreleri hücre bağlı karaciğer önlemek için aktarılmaz.
      9. [B] üreticiye göre substrat çözeltisi hazırlamak. Her şey için 50 µL ekleyin ve RT 30 dk ya da koyu kırmızı Tmax örnekleri çevirmek kadar karanlıkta kuluçkaya.
      10. [B] 50 µL durmak eriyik için her şey ekleyin. Hava kabarcıkları Santrifüjü 1 dk 4000 x gve el ile içi boş bir iğne ile çıkarın. Ölçmek optik absorbans 490 nm.
      11. [B] her örnek % belirli lizis değerlerini hesaplamak.
        1. [B] ortalama orta denetimleri ile ve lizis çözüm olmadan çoğaltır için hesaplayın. Elde edilen değerler deneysel örnekleri ve Tmax ve spontan yayın denetimleri, sırasıyla çıkarma. Bu arka plan-düzeltilmiş değerleri daha da hesaplamalar için kullanın.
        2. [B] Ortalama arka plan-düzeltilmiş Tmax, Tspve Esp denetimler için hesaplayın. Bu ortalama değerleri kullanarak, aşağıdaki denklemi her örnek için belirli lizis yüzdesini verir:

          figure-protocol-29560
        3. [B] protein konsantrasyonu vs % belirli lizis değerleri veya E:T oranı çizmek ve hedefleme-kontrol örnekleri için karşılaştırın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1 oncolytic kızamık virüs bispecific T hücre engagers kodlama etki mekanizması gösterilmiştir. Bu protokol iş akışı gösteren bir akış çizelgesi Şekil 2' de sunulmuştur. Şekil 3 değiştirilmiş oncolytic kızamık virüsü genom bir örneği gösterilir. Bu kızamık virüs anti-genom ve belirli özellikleri eklenen transgenes için uygulanan belirli değiş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Oncolytic immünoterapi (i.e., immunomodulation ile birlikte OVT) kanser tedavisi, daha da geliştirilmesi ve optimizasyonu immunomodulatory protein kodlama oncolytic virüslerin talep için büyük söz sahibidir. Bu iletişim kuralı oluşturmak ve ilgili preklinik modelleri ve potansiyel gelecek klinik çeviri roman anti-kanser tedavi içine sonraki test etmek için böyle vektörel çizimler doğrulamak için yöntemler açıklanır.

Çok sayıda farklı oncolytic virüs farklı a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

CE Engeland kanser Heidelberg Üniversitesi tarafından sahip olunan Immunovirotherapy için bir patent ile ilgili olarak RNA virüsleri eş mucidi olarak listelenir. J.P.W. Heidbuechel ifşa etmek yok.

Teşekkürler

Bu yöntemler Virotherapy tümör hastalıkları Heidelberg için Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts Ulusal Merkezi liderliğindeki grup kuruldu. Biz onu ve laboratuvar ekibi, özellikle Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler ve Jessica Albert tüm üyeleri için borçlu bulunmaktadır. Bu eser başka Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından desteklenmiştir (Grant 2015_A78 CE Engeland için) ve Alman Ulusal Bilim Vakfı (DFG, C.E. Engeland için EN 1119/2-1 vermek). J.P.W. Heidbuechel bir maaşa Helmholtz International Graduate School tarafından kanser araştırmaları için alır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Rapid DNA Dephos & Ligation KitRoche Life Science, Mannheim, Germany4898117001
CloneJET PCR Cloning KitThermo Fisher Scientific, St. Leon-RotK1231
AgaroseSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyA9539-500G
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN, Hilden, Germany28704
NEB 10-beta Competent E. coliNew England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, GermanyC3019I
LB medium after LennoxCarl Roth, Karlsruhe, GermanyX964.1
AmpicillinCarl Roth, Karlsruhe, GermanyHP62.1
QIAquick Miniprep KitQIAGEN, Hilden, Germany27104
Restriction enzyme HindIII-HFNew England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, GermanyR3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Invitrogen, Darmstadt, Germany31966-021
Fetal bovine serum (FBS)Biosera, Boussens, FranceFB-1280/500
FugeneHDPromega, Mannheim, GermanyE2311may be replaced by transfection reagent of choice
KanamycinSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyK0129
Vero cellsATCC, Manassas, VA, USACCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46J. Heidbuechel, DKFZ Heidelbergavailable upon request
Granta-519DSMZ, Braunschweig, GermanyACC 342
Opti-MEM (serum-free medium)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT)PromoKine, Heidelberg, GermanyPK-CA20-300-1000includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS)Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin ColumnsQIAGEN, Hilden, Germany31014
Sodium chlorideCarl Roth, Karlsruhe, Germany3957.3
ImidazoleCarl Roth, Karlsruhe, GermanyI5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDaMerck, Darmstadt, GermanyUFC901024
BCA Protein Assay KitMerck Milipore71285-3
IgG from human serumSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyI4506
Anti-HA-PEMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-092-257RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibodyBD Biosciences, Heidelberg, Germany555749RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany12158167001RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeadsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-090-485
MS ColumnsMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-201
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-102
MACS MultiStandMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany130-042-303
RIPA bufferRockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USAMB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity AssayPromega, Mannheim, GermanyG1780includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifterCorning, Reynosa, Mexico3008
10 cm dishesCorning, Oneonta, NY, USA430167
15 cm dishesGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany639160
96-well plates, U-bottomTPP, Trasadingen, Switzerland92097
96-well plates, flat bottomNeolab, Heidelberg, Germany353072
6-well platesNeolab, Heidelberg, Germany353046
12-well platesNeolab, Heidelberg, Germany353043
50 mL tubesnerbe plus, Winsen/Luhe, Germany02-572-3001
T175 cell culture flasksThermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot159910
0.22 µm filtersMerck, Darmstadt, GermanySLGPM33RS

Referanslar

  1. Lichty, B. D., Breitbach, C. J., Stojdl, D. F., Bell, J. C. Going viral with cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (8), 559-567 (2014).
  2. Cassady, K. A., Haworth, K. B., Jackson, J., Markert, J. M., Cripe, T. P. To Infection and Beyond: The Multi-Pronged Anti-Cancer Mechanisms of Oncolytic Viruses. Viruses. 8 (2), (2016).
  3. Twumasi-Boateng, K., Pettigrew, J. L., Kwok, Y. Y. E., Bell, J. C. Oncolytic viruses as engineering platforms for combination immunotherapy. Nature Reviews Cancer. , (2018).
  4. Achard, C., et al. Lighting a Fire in the Tumor Microenvironment Using Oncolytic Immunotherapy. EBioMedicine. 31, 17-24 (2018).
  5. Kelly, E., Russell, S. J. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 15 (4), 651-659 (2007).
  6. Russell, S. J., Peng, K. W., Bell, J. C. Oncolytic virotherapy. Nature Biotechnology. 30 (7), 658-670 (2012).
  7. Russell, S. J., Peng, K. W. Oncolytic Virotherapy: A Contest between Apples and Oranges. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (5), 1107-1116 (2017).
  8. Seymour, L. W., Fisher, K. D. Oncolytic viruses: finally delivering. British Journal of Cancer. 114 (4), 357-361 (2016).
  9. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  10. Gao, Q., Park, M. S., Palese, P. Expression of transgenes from newcastle disease virus with a segmented genome. Journal of Virology. 82 (6), 2692-2698 (2008).
  11. Billeter, M. A., Naim, H. Y., Udem, S. A. Reverse genetics of measles virus and resulting multivalent recombinant vaccines: applications of recombinant measles viruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 329, 129-162 (2009).
  12. Matveeva, O. V., Guo, Z. S., Shabalina, S. A., Chumakov, P. M. Oncolysis by paramyxoviruses: multiple mechanisms contribute to therapeutic efficiency. Molecular Therapy Oncolytics. 2, (2015).
  13. Suter, S. E., et al. In vitro canine distemper virus infection of canine lymphoid cells: a prelude to oncolytic therapy for lymphoma. Clinical Cancer Research. 11 (4), 1579-1587 (2005).
  14. Ammayappan, A., Russell, S. J., Federspiel, M. J. Recombinant mumps virus as a cancer therapeutic agent. Molecular Therapy Oncolytics. 3, 16019(2016).
  15. Schirrmacher, V. Oncolytic Newcastle disease virus as a prospective anti-cancer therapy. A biologic agent with potential to break therapy resistance. Expert Opinion on Biological Therapy. 15 (12), 1757-1771 (2015).
  16. Saga, K., Kaneda, Y. Oncolytic Sendai virus-based virotherapy for cancer: recent advances. Oncolytic Virotherapy. 4, 141-147 (2015).
  17. Matveeva, O. V., Kochneva, G. V., Netesov, S. V., Onikienko, S. B., Chumakov, P. M. Mechanisms of Oncolysis by Paramyxovirus Sendai. Acta Naturae. 7 (2), 6-16 (2015).
  18. Gainey, M. D., Manuse, M. J., Parks, G. D. A hyperfusogenic F protein enhances the oncolytic potency of a paramyxovirus simian virus 5 P/V mutant without compromising sensitivity to type I interferon. Journal of Virology. 82 (19), 9369-9380 (2008).
  19. Engeland, C. E., et al. A Tupaia paramyxovirus vector system for targeting and transgene expression. The Journal of General Virology. 98 (9), 2248-2257 (2017).
  20. Russell, S. J., Peng, K. W. Measles virus for cancer therapy. Current Topics in Microbiology and Immunology. 330, 213-241 (2009).
  21. Aref, S., Bailey, K., Fielding, A. Measles to the Rescue: A Review of Oncolytic Measles Virus. Viruses. 8 (10), (2016).
  22. Demicheli, V., Rivetti, A., Debalini, M. G., Di Pietrantonj, C. Vaccines for measles, mumps and rubella in children. The Cochrane Database of Systematic Reviews. (2), 004407(2012).
  23. Radecke, F., et al. Rescue of measles viruses from cloned DNA. The EMBO Journal. 14 (23), 5773-5784 (1995).
  24. Martin, A., Staeheli, P., Schneider, U. RNA polymerase II-controlled expression of antigenomic RNA enhances the rescue efficacies of two different members of the Mononegavirales independently of the site of viral genome replication. Journal of Virology. 80 (12), 5708-5715 (2006).
  25. Russell, S. J., et al. Remission of disseminated cancer after systemic oncolytic virotherapy. Mayo Clinic Proceedings. 89 (7), 926-933 (2014).
  26. Hardcastle, J., et al. Immunovirotherapy with measles virus strains in combination with anti-PD-1 antibody blockade enhances antitumor activity in glioblastoma treatment. Neuro-Oncology. 19 (4), 493-502 (2017).
  27. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  28. Galanis, E., et al. Phase I trial of intraperitoneal administration of an oncolytic measles virus strain engineered to express carcinoembryonic antigen for recurrent ovarian cancer. Cancer Research. 70 (3), 875-882 (2010).
  29. Galanis, E., et al. Oncolytic measles virus expressing the sodium iodide symporter to treat drug-resistant ovarian cancer. Cancer Research. 75 (1), 22-30 (2015).
  30. Kurokawa, C., et al. Constitutive Interferon Pathway Activation in Tumors as an Efficacy Determinant Following Oncolytic Virotherapy. Journal of the National Cancer Institute. , (2018).
  31. Msaouel, P., et al. Clinical Trials with Oncolytic Measles Virus: Current Status and Future Prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  32. Grote, D., Cattaneo, R., Fielding, A. K. Neutrophils contribute to the measles virus-induced antitumor effect: enhancement by granulocyte macrophage colony-stimulating factor expression. Cancer Research. 63 (19), 6463-6468 (2003).
  33. Grossardt, C., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-armed oncolytic measles virus is an effective therapeutic cancer vaccine. Human Gene Therapy. 24 (7), 644-654 (2013).
  34. Iankov, I. D., et al. Expression of immunomodulatory neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori enhances the antitumor activity of oncolytic measles virus. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 20 (6), 1139-1147 (2012).
  35. Engeland, C. E., et al. CTLA-4 and PD-L1 Checkpoint Blockade Enhances Oncolytic Measles Virus Therapy. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (11), 1949-1959 (2014).
  36. Veinalde, R., et al. Oncolytic measles virus encoding interleukin-12 mediates potent antitumor effects through T cell activation. Oncoimmunology. 6 (4), 1285992(2017).
  37. Hutzler, S., et al. Antigen-specific oncolytic MV-based tumor vaccines through presentation of selected tumor-associated antigens on infected cells or virus-like particles. Scientific Reports. 7 (1), 16892(2017).
  38. Speck, T., et al. Targeted BiTE expression by an oncolytic vector augments therapeutic efficacy against solid tumors. Clinical Cancer Research. , (2018).
  39. Andtbacka, R. H., et al. Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 33 (25), 2780-2788 (2015).
  40. Ribas, A., et al. Oncolytic Virotherapy Promotes Intratumoral T Cell Infiltration and Improves Anti-PD-1 Immunotherapy. Cell. 170 (6), 1109-1119 (2017).
  41. Patel, S. J., et al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature. 548 (7669), 537-542 (2017).
  42. Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of affinity tags for protein purification. Current Protocols in Protein Science. 73, Unit 9.9 (2013).
  43. Cattaneo, R., Rebmann, G., Baczko, K., ter Meulen, V., Billeter, M. A. Altered ratios of measles virus transcripts in diseased human brains. Virology. 160 (2), 523-526 (1987).
  44. Gutsche, I., et al. Structural virology. Near-atomic cryo-EM structure of the helical measles virus nucleocapsid. Science. 348 (6235), New York, N.Y. 704-707 (2015).
  45. Kolakofsky, D., et al. Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. Journal of Virology. 72 (2), 891-899 (1998).
  46. Kolakofsky, D., Roux, L., Garcin, D., Ruigrok, R. W. Paramyxovirus mRNA editing, the "rule of six" and error catastrophe: a hypothesis. The Journal of General Virology. 86, Pt 7 1869-1877 (2005).
  47. Parks, C. L., et al. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. Journal of Virology. 75 (2), 921-933 (2001).
  48. JoVE Science Education Database. Molecular Cloning. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  49. JoVE Science Education Database. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  50. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  51. Rota, J. S., Wang, Z. D., Rota, P. A., Bellini, W. J. Comparison of sequences of the H, F, and N coding genes of measles virus vaccine strains. Virus Research. 31 (3), 317-330 (1994).
  52. Bankamp, B., Takeda, M., Zhang, Y., Xu, W., Rota, P. A. Genetic characterization of measles vaccine strains. The Journal of Infectious Diseases. 204, Suppl 1 533-548 (2011).
  53. Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. The Journal of Experimental Medicine. 99 (2), 167-182 (1954).
  54. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  55. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  56. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  57. JoVE Science Education Database. The Western Blot. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  58. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), e51554(2014).
  59. Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. Journal of Visualized Experiments. (44), (2010).
  60. Gerdes, J. Ki-67 and other proliferation markers useful for immunohistological diagnostic and prognostic evaluations in human malignancies. Seminars in Cancer Biology. 1 (3), 199-206 (1990).
  61. JoVE Science Education Database. The Transwell Migration Assay. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. JoVE Science Education Database: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology (2018).
  62. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (116), e54596(2016).
  63. Ungerechts, G., et al. Moving oncolytic viruses into the clinic: clinical-grade production, purification, and characterization of diverse oncolytic viruses. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 3, 16018(2016).
  64. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (12), 717-734 (2017).
  65. Yu, F., et al. T-cell engager-armed oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 22 (1), 102-111 (2014).
  66. Fajardo, C. A., et al. Oncolytic Adenoviral Delivery of an EGFR-Targeting T-cell Engager Improves Antitumor Efficacy. Cancer Research. 77 (8), 2052-2063 (2017).
  67. Freedman, J. D., et al. Oncolytic adenovirus expressing bispecific antibody targets T-cell cytotoxicity in cancer biopsies. EMBO Molecular Medicine. 9 (8), 1067-1087 (2017).
  68. Wing, A., et al. Improving CART-Cell Therapy of Solid Tumors with Oncolytic Virus-Driven Production of a Bispecific T-cell Engager. Cancer Immunology Research. 6 (5), 605-616 (2018).
  69. Myers, R. M., et al. Preclinical pharmacology and toxicology of intravenous MV-NIS, an oncolytic measles virus administered with or without cyclophosphamide. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (6), 700-710 (2007).
  70. Rittner, K., Schreiber, V., Erbs, P., Lusky, M. Targeting of adenovirus vectors carrying a tumor cell-specific peptide: in vitro and in vivo studies. Cancer Gene Therapy. 14 (5), 509-518 (2007).
  71. Nakamura, T., et al. Rescue and propagation of fully retargeted oncolytic measles viruses. Nature Biotechnology. 23 (2), 209-214 (2005).
  72. Campadelli-Fiume, G., et al. Retargeting Strategies for Oncolytic Herpes Simplex Viruses. Viruses. 8 (3), 63(2016).
  73. Leber, M. F., et al. MicroRNA-sensitive oncolytic measles viruses for cancer-specific vector tropism. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19 (6), 1097-1106 (2011).
  74. Baertsch, M. A., et al. MicroRNA-mediated multi-tissue detargeting of oncolytic measles virus. Cancer Gene Therapy. 21 (9), 373-380 (2014).
  75. Ruiz, A. J., Russell, S. J. MicroRNAs and oncolytic viruses. Current Opinion in Virology. 13, 40-48 (2015).
  76. Miest, T. S., Cattaneo, R. New viruses for cancer therapy: meeting clinical needs. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 23-34 (2014).
  77. Phuong, L. K., et al. Use of a vaccine strain of measles virus genetically engineered to produce carcinoembryonic antigen as a novel therapeutic agent against glioblastoma multiforme. Cancer Research. 63 (10), 2462-2469 (2003).
  78. Dingli, D., et al. Image-guided radiovirotherapy for multiple myeloma using a recombinant measles virus expressing the thyroidal sodium iodide symporter. Blood. 103 (5), 1641-1646 (2004).
  79. Abate-Daga, D., et al. Oncolytic adenoviruses armed with thymidine kinase can be traced by PET imaging and show potent antitumoural effects by ganciclovir dosing. PLoS One. 6 (10), 26142(2011).
  80. Ungerechts, G., et al. Lymphoma chemovirotherapy: CD20-targeted and convertase-armed measles virus can synergize with fludarabine. Cancer Research. 67 (22), 10939-10947 (2007).
  81. Ketzer, P., et al. Artificial riboswitches for gene expression and replication control of DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (5), 554-562 (2014).
  82. Freedman, J., et al. Targeting T-cells to human cancer associated fibroblasts using an oncolytic virus expressing a FAP-specific T-cell engager. Keystone Symposia & Digitell, Inc. , (2018).
  83. Nishio, N., et al. Armed oncolytic virus enhances immune functions of chimeric antigen receptor-modified T cells in solid tumors. Cancer Research. 74 (18), 5195-5205 (2014).
  84. Bressy, C., Benihoud, K. Association of oncolytic adenoviruses with chemotherapies: an overview and future directions. Biochemical Pharmacology. 90 (2), 97-106 (2014).
  85. Wennier, S. T., Liu, J., McFadden, G. Bugs and drugs: oncolytic virotherapy in combination with chemotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 13 (9), 1817-1833 (2012).
  86. Fillat, C., Maliandi, M. V., Mato-Berciano, A., Alemany, R. Combining oncolytic virotherapy and cytotoxic therapies to fight cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6513-6521 (2014).
  87. Li, H., Peng, K. W., Russell, S. J. Oncolytic measles virus encoding thyroidal sodium iodide symporter for squamous cell cancer of the head and neck radiovirotherapy. Human Gene Therapy. 23 (3), 295-301 (2012).
  88. Opyrchal, M., et al. Effective radiovirotherapy for malignant gliomas by using oncolytic measles virus strains encoding the sodium iodide symporter (MV-NIS). Human Gene Therapy. 23 (4), 419-427 (2012).
  89. Mansfield, D., et al. Oncolytic Vaccinia virus and radiotherapy in head and neck cancer. Oral Oncology. 49 (2), 108-118 (2013).
  90. Miest, T. S., et al. Envelope-chimeric entry-targeted measles virus escapes neutralization and achieves oncolysis. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19 (10), 1813-1820 (2011).
  91. Santiago, D. N., et al. Fighting Cancer with Mathematics and Viruses. Viruses. 9 (9), (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 143Oncolytic virotherapykanserli hastalardaviral vekt rlerk zam k vir sparamyxovirusbispecific T h cre engager

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır