Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Özet

Uyuşturucu hedef nişan ölçümleri etkili ilaç geliştirme ve kimyasal sonda doğrulama için merkezi. Burada, uyuşturucu-hedef nişan yüksek içerik görüntüleme hücresel termal kayması tahlil (CETSA) bir Mikroplaka uyumlu uyum içinde kullanarak ölçmek için bir protokol ayrıntılı.

Özet

Küçük moleküller arasındaki etkileşimin amaçlanan protein hedefleri ile quantitating ilaç geliştirme, hedef doğrulama ve kimyasal sonda doğrulama için önemlidir. Bu fenomen protein hedef veya küçük molekül yapılmaksızın tedbir Teknik olarak zor olsa da özellikle değerli yöntemlerdir. Hücresel termal kayması tahlil (CETSA) hedef nişan canlı hücreler içinde izlemek için bir tekniktir. Burada, tek hücre düzeyinde hücre altı yerelleştirme koruyarak yüksek işlem hacmi ölçülerini sağlar orijinal CETSA iletişim kuralı bir uyarlaması açıklayın. Bizce bu protokolü CETSA uygulaması bileşik-hedef etkileşiminde, özellikle hücre türdeş olmayan nüfus derinlemesine karakterizasyonu için önemli gelişmeler sunar.

Giriş

Yeni ilaç veya kimyasal probları gözlenen farmakolojik etkisi veya fonksiyonel okuma hedef doluluk veya nişan canlı hücreleri^1,2,3' te ölçülerini çift esastır geliştirirken. Bu veriler küçük molekül aslında istenen hedefine ulaştığından emin olmak için ve protein hedef seçimi^4,5arkasında biyolojik hipotez doğrulamak için gereklidir. Ayrıca, ilaç geliştirme sırasında artan karmaşıklık model sistemleri seçin ve bir ipucu klinik öncesi bileşik teyit için kullanılır. Bu preklinik sistemleri arasında çeviri biyoloji onaylamak için uyuşturucu-hedef nişan izleme ve biyoloji bu gelişim süreci boyunca eşlik eden kritik yöntemlerdir.

Uyuşturucu-hedef nişan geleneksel unfunctionalized küçük moleküller ve protein, uzaysal çözünürlük^6,7ile tek hücre düzeyinde özellikle canlı hücrelerdeki izlemek için zor olmuştur. Bir son yöntem arasındaki etkileşim gözlemlemek için uyuşturucu değiştirilmemiş ve canlı hücrelerdeki protein olduğunu ligand kaynaklı istikrar yanıt bir ısı meydan okuma olarak yerli protein quantified^{8olduğu hücresel termal kayması tahlil (CETSA), 9,10}. Bu süre bir ısı meydan okuma maruz kalan çözünür protein miktarının tarafından gerçekleştirilir. CETSA ilk açıklanması Batı leke tespiti için kullanıldı. Tarama kampanyalarını etkinleştirmek ve daha büyük bileşik koleksiyonları önceliklendirmek vurmak için çabaları CETSA deneyler iş çıkarma yeteneğini artırmak için birkaç homojen, mikroplaka tabanlı deneyleri^10,11gelişmesine yol var. Ancak, bir bu yöntemler ile Şu anda en iyi hücre süspansiyonlar bileşik tedavi uygundur ve hücre lizis, mekansal bilgi kaybına yol önde gelen algılama gerektirir kısıtlamadır. CETSA-ebilmek var olmak deneysel olarak termal toplama sıcaklık (T_agg) ligand kaynaklı vardiyada küçük molekül tek bir konsantrasyon veya ligand konsantrasyonu protein tek bir ısıda dengelemek gerekli uygulanan. İkinci izotermal doz yanıt parmak bağımlılık belirli deneysel koşullar üzerinde bu ölçümlerin belirtmek için (ITDRF) olarak adlandırılır.

Bu iletişim kuralı CETSA immünfloresan (Eğer) antikor algılama yüksek içerikli mikroskobu¹²ile yapışık hücreleri kullanarak hedef nişan ölçmek için hedeftir. Bu yordamı hücre altı yerelleştirme korunması ile hedef angajman tek hücreli miktar için izin vermek için orijinal CETSA platform uzanır. Özellikle, önceki raporların çoğu, bu yordamda yüzey dekolmanı veya çamaşır böylece biz¹³ölçmek amacıyla kurulan bağlama dengeyi koruyarak ısı meydan okuma önce geçmeden canlı yapisan hücrelerde bileşik tedavi yapılır. Şu anda, yöntem bir hedef protein p38α için doğrulanır (MAPK14) içinde birkaç satır hücre ve bu yordamı paylaşarak teknik geniş erime Proteom uygulanabilir olduğunu umuyoruz. Biz bu protokolü tarama ilaç geliştirme boru hattı boyunca adapte edilebilir, aracılığıyla hedef nişan vivo içindeizleme için önceliklendirme vurmak tahmin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. tohum hücrelerinin

Not: İş akışı genel bakış için bkz: Şekil 1. Tablo malzemelerimalzemeler ve Kimyasalları ait ayrıntılı bir liste mevcuttur.

1. Hücreleri tohum önce siyah 384-şey görüntüleme tahlil tabak tabak altında daha sonra Isıtma adımı sırasında yakalanan hava kabarcıkları önlemek için çerçeve içinde bir standart matkap ile delik. Plastik parçacıklar kuyuları bu adımı sırasında girerek önüne geçmek ve steril koşullar korumak için bir yapışkan alüminyum folyo ile plakalarının veya doku kültürü mahallede delme önce plaka kapak. Genellikle, her yan plaka (kısa kenar) bir 3, 5 mm çapında 3 delik yeterli.
2. Laminar akış tezgah % 70 etanol ile temizleyerek hazırlayın. Standart aseptik doku kültürü teknikleri, medya cep şişesi veya çanak kaldırmak. 5-10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren hücreleri yıkayın ve 2 mL tripsin şişesi için ekleyin. A-431 hücreleri ayırmak kadar 37 ° C'de şişeye kuluçkaya. Ya da bir haemocytometer veya hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. 50. 000 hücre/mL kültür ortamında bir hücre süspansiyon hazırlamak.
3. Bir toplu reaktif dağıtıcı veya deneme ölçeğini bağlı olarak bir çok kanallı damlalıklı kullanarak bir tahlil plaka her kuyuya hücre süspansiyon (iyi başına 2.000 hücre son hücre yoğunluğu veren), 40 µL dağıtmak. Kısa bir süre için hücreler eşit kalenin dibinde dağıtmak için yan plaka taşımak.
4. Plaka-kenar etkileri en aza indirmek için laminar akış kapağın arkasında oda sıcaklığında 20 dakika tahlil kalenin dibinde razı hücrelere izin. O zaman, nemli bir ortam sağlamak için nemli kağıt havlu ile plastik bir kapta plaka yer. Kullanımdan önce % 70 etanol ile Plastik Konteyner silin.
5. 2-3 gün 37 ° C ve % 5 CO₂ geleneksel bir oksijen kuluçka için tahlil plaka kutusuyla kuluçkaya. Confluency hücrelerin 50-%75 kadar bir ışık mikroskobu ile görsel denetim tarafından değerlendirildi izlemeniz.

2. bileşik tedavi

1. Deneme günü, her şey bir plaka çamaşır makinesi kullanarak orta Aspire edin. Plaka plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirin ve aspirasyon programı seçin. Bir tabak yıkama yoksa, sıvı atık tepsi ya da lavabo üzerinde bir hızlı el twist ile plaka ters çevirme tarafından kaldırılabilir. Sıvı tamamen kaldırılması için iyi bir performans esastır. Herhangi bir aşırı sıvı sonra kağıt havlu ile dabbing tarafından kaldırılır.
2. Hücre kültür otomatik dağıtımı kullanarak orta veya çok kanallı pipet deneme ölçeğini bağlı olarak yürüttüğü konsantrasyonu seyreltilmiş bileşiklerin 30 µL ekleyin. Her tahlil plaka üzerinde birkaç wells (DMSO) negatif ve pozitif (bilinen ligand) denetim eklemek için emin olun. Çünkü bu bir termal üst karakter tahlil, bileşik toplama protein sabitleme gözlemlemek için ayrışma sabiti aşıyor gereklidir. Böylece, kaba bir kılavuz bileşik toplama için 50 - 100 kez IC₅₀, ama daha ayrıntılı açıklamaları için bileşik konsantrasyonları tartışma bölümünde bulunur.
   Not: DMSO tolerabilite hücre hatları deneme önce test edilmelidir.
3. Nefes alabilen bir plaka ile bileşik tedavi tahlil plaka mühür ve 37 ° C ve % 5 CO₂ oksijen kuluçka 30 dakika boyunca kuluçkaya mühür.

3. ısı Challenge

1. İlk olarak, su banyosu istenilen sıcaklığa ayarlayın. Tahlil plaka kuyu içinde ulaştığı son sıcaklık su banyosu içinde son sıcaklık farklı olabileceğini unutmayın. Uzaklık önceden bir sahte plaka ve ısıl termometre ile araştırmak. Genellikle banyo istenilen sıcaklıkta stabilize etmek için 30 dakika sürer.
2. İstenen sıcaklık Isıtma adımı sırasında tahlil plaka wells ulaştığını doğrulayın mühürsüz bir kukla plaka orta aynı birim olarak tahlil plaka içeren hazır olun.
3. Tahlil plakaları kuluçka makinesi kaldırın. Solunabilir mühür almak ve yeniden su kuyu su banyosu içinde sonraki Isıtma sırasında sızıntısı olmayacak emin olmak için sıkı yapışkan alüminyum folyo ile bileşik tedavi hücreleri içeren tahlil plaka mühür. Plaka çerçevesi içinde delik erişilebilir olduğundan emin olun.
4. Tahlil plaka ve sahte plaka su banyosunda altından plakalar dışında kalan herhangi bir hava kuvvetleri için su yüzeyine doğru açılı plaka dibine yerleştirin.
5. Isıl termometre kullanarak yeni bir kukla plaka kuyu içindeki sıcaklık izlemek.
6. Sıcak su banyosu 3 dakika için tahlil plaka. Hemen tahlil ve sahte plaka başka bir su banyosu için 5 dakika soğumasını Oda temperli su ile aktarın. Tahlil plaka artık daha fazla işlem için hazırdır.

4. fiksasyon

1. 10 µL % 16 (w/v) paraformaldehyde (PFA) doğrudan bir toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak tahlil plakasına dağıtmak. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya.
   Not: Bazı fiksajlar kanserojen olarak sınıflandırılır ve kurumsal güvenlik kurallarına uyulmalıdır.
2. İngiltere'de yılın çözüm Aspire edin ve hücreleri bir tabak yıkama 300 µL PBS ile yıkayın. Plaka plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirin ve aspirasyon programı seçin.
   Not: Bu yordam içinde sıvı aynı anda reçete kaldırıldı ve plaka contalara bir taşma protokolünü kullanarak optimize edilmiştir. Bir tabak yıkama veya benzer yordam kullanılabilir değilse, çamaşır adım alternatif olarak el ile yapılabilir.
3. Yordam yıkama el ile: Sıvı atık tepsi ya da lavabo üzerinde bir hızlı el twist ile plaka ters çevirme tarafından kuyulardan kaldırın. Sıvı tamamen kaldırılması için iyi bir performans esastır. PBS 80 µL bir çok kanallı pipet ile eklemek ve yukarıda açıklandığı gibi yeniden plaka ters çevir, iki kez çamaşır yordamı yineleyin. Son yıkama sonra plaka karşı herhangi bir aşırı sıvı kaldırmak için temiz kağıt havlu leke.

5. permeabilization

1. 20 µL % 0.1 (v/v) NP-40 için çok kanallı damlalıklı Wells'le ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. (Yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak hücreleri yıkayın.
2. Alternatif olarak, uygun olduğunda, Örneğinbir antijen alma protokole uygulanır:
   1. 20 µL % 1 SDS wells ile çok kanallı damlalıklı ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakikalığına kuluçkaya ve göre (yukarıdaki adım 4.2) açıklanan yordamın aynısını yıkayın.
   2. 10 mM glisin 80 μL pH 7.2 ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya. Glisin çözüm plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirerek ve aspirasyon Protokolü seçerek bir plaka çamaşır makinesi kullanarak Aspire edin. Bir tabak yıkama yoksa 2.1 ve 4.2 Notlar'a bakın.

6. engelleme

1. %1 (w/v) Sığır serum albumin (BSA) 15 µL PBS içinde toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak wells ekleyin. Plaka 1 saat oda sıcaklığında veya gecede bir alüminyum folyo plaka mühür ile 4 ° C'de kuluçkaya.

7. birincil antikor

1. Plaka çamaşır makinesinin üstüne yerleştirerek ve aspirasyon Protokolü seçerek bir plaka çamaşır makinesi kullanarak engelleme çözüm Aspire edin. Bir tabak yıkama yoksa 2.1 ve 4.2 Notlar'a bakın.
2. Birincil antikor buna göre seyreltilmiş 10 µL eklemek %1 (w/v) BSA PBS bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için. Plaka 1 saat oda sıcaklığında veya gecede bir alüminyum folyo plaka mühür ile 4 ° C'de kuluçkaya.

8. ikincil antikor

1. Birincil antikor çözüm Aspire edin ve aynı yordam göre wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi yıkayın.
2. Alexa 488 ikincil antikor buna göre seyreltilmiş 10 µL eklemek %1 (w/v) BSA PBS içinde. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya. Işıktan korumak için bir yapışkan alüminyum folyo mühür ile plaka mühür.
   Not: Bu sırasında ışık plaka ve sonraki adımları korumak.

9. nükleer boyama ve cep maskesi

1. 0,05 mg/ml bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için PBS içinde seyreltilmiş nükleer boya 10 µL ekleyin. Oda sıcaklığında ek 10 dakika boyunca kuluçkaya.
2. İkincil antikor ve Höchst çözüm Aspire edin ve wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak yıkayın.
3. 10 µL 200 ng/ml PBS içinde bir çok kanallı damlalıklı kullanarak wells için seyreltilmiş cep maskesi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuluçkaya.
4. Cep maskesi çözüm Aspire edin ve wells (yukarıdaki adım 4.2) açıklandığı gibi aynı yordamı kullanarak yıkayın.
5. PBS 60 µL tabak yıkama, toplu reaktif dağıtıcı veya çok kanallı damlalıklı kullanarak bütün kuyuları için vazgeçmek ve bir yapışkan alüminyum folyo ile plakalarının.

10. görüntü toplama ve Analizi

1. Yüksek bir içerik Imager 3 floresan kanallarını kullanarak görüntüleri yakalama: DAPI (387/447), GFP (472/520) ve TexasRed (562/624). 4 adet 10 X amacı istimal şey başına elde etmek. Otomatik Lazer otofokus kullanabilir ve satın alma sırasında binning 2 uygulayabilirsiniz. Görüntüler 16 bit, gri ölçek TIFF dosyaları meta veriler ile birlikte olarak saklar.
2. Mevcut yazılım kullanarak görüntüleri analiz. Hücre kenarlıklarını DAPI (çekirdek) ve TexasRed (sitoplazma) ile hücre Puanlama bir algoritma kullanarak tanımlayın.
3. Ortalama yoğunluk elde edilen dalga boyu daha fazla veri analiz için ayıklayın.
4. Tahlil sağlamlık sağlamak için Z-faktör hesaplayın.
5. % Sabitleme aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar: 100 * (1-(iyi yoğunluğu-ortalama iyi yoğunluğu negatif kontrol) / (ortalama yoğunluğu olumlu denetim-ortalama yoğunluğu negatif kontrol)). Burada negatif kontrol DMSO ve olumlu denetim başvurusu maddedir. Maksimum istikrar bileşikler arasında farklılık gösterir ve hatta olumlu denetim ITDRF eğriler için daha büyük beri her bileşik için maksimum ve minimum sabitleme yoğunluklarda bazen kontrol wells yoğunluk değerleri yerine kullanılır .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1 ' de özetlenen protokolünü CETSA deneyleri tarafından yüksek içerik görüntüleme kalan çözünür protein tespiti ile yapışık hücreleri üzerinde çalıştırmak için temel iş akışını açıklar. Bu iş akışı bileşikleri veya reaktifler¹⁴plaka yerleşimini değiştirerek tüm gelişimin tahlil için kolayca adapte edilebilir. Birkaç beklenen kullanım örnekleri aşağıda için beklenen sonuçlar ayrın...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sonuçları bölümünde anlatıldığı gibi birkaç anahtar adım prosedürü vardır. İlk olarak, bir yüksek kaliteli benzeşme reaktif belirlemek önemlidir. Antikorlar istenen her hedef için küçük bir kütüphane eleme tavsiye ediyoruz. Birincil bir antikor seçildikten sonra da uygunsa, protein hedef farklı bağlama siteler için sistem doğrulamak önemlidir. Karşı tarama için tahlil sinyal ile Şekil 2C içinde ısı meydan ihmal olarak gösterildiği gibi müdahale bileşi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System