Non-invaziv Dorsiflexor kas fonksiyonu farelerde değerlendirilmesi

Özet

Ölçüm kemirgen iskelet kası contractile işlevinin hastalık ilerleme ve terapötik müdahale etkinliğini izlemek için kullanılan yararlı bir araçtır. Burada zaman içinde aynı fare tekrarlanan dorsiflexor kasları non-invaziv, vivo içinde değerlendirilmesi açıklayın.

Özet

İskelet kası contractile işlevinin ne klinik her ikisi için önemli bir ölçüm ve araştırma amaçlı. Çok sayıda koşulları kas iskelet olumsuz yönde etkileyebilir. Bu bir kas kütlesi (atrofi) kaybı ve/veya kas kalite kaybına yol açabilir (birim kas gücü azaltılmış kitle), ikisi de kronik hastalığı, kas özel hastalık, immobilizasyon ve yaşlanma (mücadele) yaygındır. İskelet kas fonksiyonu hayvanlarda farklı testler aralığına göre değerlendirilebilir. Tüm testler fizyolojik test ortamı için ilgili sınırlamaları, ve belirli bir test yelpazesi kez deneyler niteliğine bağlıdır. Burada, güç frekansı-eğri (FFC) aynı hayvan üzerinde zaman içinde gerçekleştirilebilir farelerde yararlı ve kolay bir değerlendirmesini içeren bir içinde vivo, non-invaziv tekniğini tanımlamak. Bu hastalık ilerleme ve/veya potansiyel bir tedavi etkinliği izleme izin verir.

Giriş

Kas iskelet toplam vücut ağırlığının yaklaşık % 40'ını oluşturan önemli bir metabolik dokudur. Enerji metabolizması ve homeostasis¹kontrol önemli bir rol oynar. İskelet kas kütlesi protein sentezi ve yıkımı¹oranları arasında ince bir denge tarafından korunur. Çok sayıda hastalık koşulları bu işlemlerde iskelet kas, kas kütlesi (atrofi) net kaybına yol açan etkiler. Bunlar içerir, ama açlık, kanser, AIDS, yaşlanma için sınırlı değildir ve uzuv immobilizasyon^2,3. Yaşlanan nüfus gücü kaybı kas kaybı ile ilişkili olan kitle ve all-case ölüm⁴bir tahmin olduğunu. Bu bağlamda, mücadele ve/veya iskelet kas israf ve fonksiyon kaybı önlemek için tedavi stratejileri etkinliğini belirlerken bir önemli ölçüde kas fonksiyonu değerlendirmesini sağlar.

Araştırmacılar kas atrofi^5,6 moleküler yolları ve kas contractile işlevi^{2,3 Bu mekanizmaların etkileri anlamak için birçok farklı yaklaşımlar ve hayvan modelleri kullandım ,7}. Moleküler düzeyi değişiklikleri kas işlevselliği etkileyebilir nasıl bu nedenle kas fonksiyonu farklılıkları için moleküler düzeyde değişiklikler birleştiriliyor anlayış zorunludur.

Özellikle de küçük kemirgen, iskelet kas fonksiyonu genellikle güç üretim Engelliler algılamak ve/veya hastalık ilerleme izlemek için üç iyi tarif yordamlar^8,9 kullanılarak gerçekleştirilir. (1) Ex vivo; nerede kas hayvandan kaldırılır ve kullanarak alan stimülasyon¹⁰kas fonksiyonu değerlendirmek için bir zil sesi'nın banyo çözümde inkübe. (2) In situ; Burada kas proksimal eki hayvan içinde kalır ve distal tendon kas fonksiyonu doğrudan sinir stimülasyonu¹¹tarafından yapılması izin veren bir güç çevirici bağlı. (3) In vivo; elektrotlar subkutan elde etmek için yerleştirildiği sinir uyarılmış kas kuvvet üretim^9,12. Bu üç yordamlar farklı amaçlar için kullanılırken, onlar her avantajları ve dezavantajları sahip. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı göre uygun bir yöntem seçmek önemlidir. Ex vivo deneyler ile sınırlama ana kas onun normal ortamından kaldırılması ve alan stimülasyon kullanımı olduğunu. Yerinde yöntemi bir normal kan akımı korur ve stimülasyon sinir aracılığıyla kullanır ama normal anatomi değişmiş ve deneme terminal doğasında; Böylece, bu takip kas fonksiyonu ölçümleri imkansız hale getirir. Burada en çok anlatılan içinde vivo yöntemi normal Anatomi Fizyoloji o rahatsız edilmeden, nöromüsküler paket değişmeden kalır ve deney terminal, aynı hayvan içinde takip önlemler zaman⁸izin değil taklit eder.

Burada, biz zaman içinde aynı hayvan kas fonksiyonu birden fazla ölçümleri sağlayan bir içinde vivo açıklayınız. Bu yordamı ön krural yuvası kaslarının değerlendirmesini içerir — tibialis anterior(TA), ekstansiyon digitorum longus (EDL) ve ekstansiyon hallicus longus (EHL) kaslar, dorsiflexion için sorumlu da dahil olmak üzere — non-invaziv bir yordam fibular (olarak da bilinen peroneal) sinir stimülasyonu tarafından. TA ayak bileği dorsiflexion¹³, yalnızca en az katkı edi ve EHL bu denetim hareketi ayak ile kuvvet çoğunu sağlar. Bu sigara terminal Protokolü sinir ve kan temini korunması sağlar. Bu hastalık evrim ve tedavi etkinliği soruşturma bir hayvan modelinde mevcut en fizyolojik ortamda zamanla sağlar.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Deakin Üniversitesi hayvan Etik Komitesi (proje #G19/2014) tarafından kabul edildi.

1. ekipman kurulumu

1. Tüm makineleri düzgün bağlandığından emin olun.
2. Bilgisayar, yüksek güç iki fazlı uyarıcı ve çift modlu kolu sistemi üzerinde açınız.
3. Fare diz kelepçe platform, aynı zamanda transductor üzerinde fare tabanla ayarlayın.
4. 37 ° c Isıtma platforma açmak
5. Dinamik kas kontrol yazılımı masaüstünde açın.
   Not: Bu işlev sınamasını gerçekleştirmek için gerekli olan yazılımı var.

2. yazılım ve Model Kur

1. Program açıldığında (Şekil 1), dönüştürücü kalibre ve kurulumu seçin | Benim aletleri | Kalibre.
2. "Kur" düğmesine InstantStim seçin ve "Çalışma süresi" parametrelerini değiştirmek için 120 s (Şekil 1A).
   Not: En iyi gerilim de tek twitches gerçekleştirme, el ile ayarlama veya InstantStim gerektiği gibi birçok kez olarak başlatma elde edilebilir.
3. "Otomatik kaydetme otomatik adını girmek için Bankası" etiketli türü-güçlü penceresinde dosya konumu (örneğin, mouse1-tarihi-timepoint1) kaydedin. "Otomatik kaydetme Bankası" pencerenin solundaki onay kutusunu tıklatın ve Otomatik kaydetme etkinleştirmekiçin değiştirin.
4. DMC denetimin üst kısmında ekran hangi yeni bir pencere açılır açılır Sequencer, gidin. Açık serisi seçin ve olmaya hazır iletişim kuralını seçin (Şekil 1B) kullanılır. Yük sıra tıklatın | Penceresini Kapat.
   Not: Bu adım bir kuvvet frekans-eğri (FFC) test oluşturmak için kullanılır (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz).
5. "Aralık" topuzu küme 10 mA bı fazlı uyarıcı üzerinde.
   Not: "Ayarlama" topuzu (hemen yanında alt) sıfır üzerinde olduğundan emin olun. Bu hassas ayar elektrotlar kurulum sağlar.

3. fare ayarlar─▒n─▒

Not: Tüm kuvvet ölçümleri 12 hafta-in yaş erkek yaban tipi fareler (C57BI/6) gerçekleştirilmiştir.

1. Oksijen akışı oranı 1 L/dk % 5 isoflurane (via nosecone inhalasyon) ile anestezi odasına yer her fare fare bilincini kaybeder kadar. Ayak refleks için yeterli anestezi ile kaybını Onayla.
2. Fareyi sağ bacak üzerinde tüm saç tıraş tarafından elektrikli Saç makasları ile kaldırın.
3. Hayvan ısıtmalı platformda sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve sağ bacak (iki tarafında kullanılabilir) % 70 alkol ve iyot ile temiz. Bu noktada, isoflurane %2 (ile oksijen akışı 1 L/dk) ayarlamak ve iletken jel elektrotlar yerleştirileceği cilde uygulayın.
   Not: Rektal sıcaklık probu işlem sırasında vücut sıcaklığını izlemek ve göze herhangi bir kuruluk ve/veya hasarı önlemek için göz merhem uygulamak için kullanın.
4. Ayak tabanla üzerine yerleştirin ve tıbbi bant kullanarak ekleyebilirsiniz. Stabilize ve işlem sırasında bacak hareketsiz için diz kelepçe.
   Not: Bazı çalışmalarda istikrar sağlamak için proksimal tibia (dorsiflexors kasları için posterior)¹² yerleştirilmiş bir çok ince çivi kullanarak anlatmıştık. Bu diz gereksiz sıkıştırma/zarar vermeden yeterli istikrar sağladığından bu iletişim kuralı bir kelepçe için opts. Kelepçe da hala kas contractility doğru değerlendirme izin verirken bir trans-kemik PIN oluşturabilirsiniz olası iltihabı önler. Ayrıca, fare diz kelepçe başarıyla kullanılan¹⁴olmuştur.
5. Bu noktada, düğmeleri platformda böylece 90 ° açı (Şekil 2) ayak bileği fare hindlimb konumlandırmak için kullanın.

4. elektrotlar konumuna getirilmesi

1. Sonra fare platformda yer, elektrotlar (sağ bacağından subkutan) deri altına yerleştirin.
   Not: Bu çok önemli bir adımdır ve bazı yeniden konumlandırma 4.4 adımda kurulum sırasında istenen konuma almak için gerekli.
2. Elektrotlar sağ bacak yan tarafına yerleştirmek; fibula ve diğer elektrot Başkanı yakın bir daha klemple bacak (Şekil 2) yan tarafına yerleştirmek.
   Not: Özel yapım elektrot sistemi bu adım optimize etmek için tasarlanmıştır. Ancak, bu sınama programında küçük bir sistem üreticisi tarafından sağlanan elektrot iğneler ile yapılabilir.
3. Aşağıdaki adımları elde sonra yüksek güç iki fazlı uyarıcı üzerinde maksimum dorsiflexion tork sonuçları peroneal sinir uyarılması elde etmek için gerektiği gibi "Ayarlama" etiketli düğmeyi ayarlayın.
   Not: Yetişkin yaban tipi fareler için bu aralıktır daha az 2 mA; Ancak, bu boyutu, yaş ve cinsiyet hayvan bağımlı olabilir. Maksimum güç ulaşılana kadar güç üretim (eğriler doruklarına) yavaş yavaş artırılmalıdır.
4. Stimülasyon sırasında dönüştürücü elektrotlar tarafından peroneal sinir dorsiflexor kasları uyarıcı emin olmak önemli olan negatif değerler (Şekil 3), vermeye saat yönünde çevir. Bu adımı elde sonra işlem sırasında herhangi bir hareketi engelleyen bir kelepçe kullanarak elektrotlar stabilize etmek.
   Not: Tepeler yavaş yavaş boyutları artacak ve maksimum amper, aynı contractility üç veya daha fazla ardışık elektrodlar neden düzeyi olarak belirlenir. Gerekenden daha yüksek amper dönüm karşı koymak; maksimum amper komşu ve potansiyel olarak antagonist kaslar sözleşme için pozitif değerler doruklarına oluşturabilirsiniz Co kasılması, neden teşvik edecek.
5. Anlık STIM stop yazılım üzerinde.
6. Ana ekranda, "Sıra (2.4 adımda anlatıldığı gibi) önceki kurulum sırası başlatmak için Başlat" düğmesini açın.

5. işlem bitiş

1. Bir kez gücü ölçümleri tamamlanmak, elektrotlar kaldırmak, diz kelepçe bırakın ve ayak bandı çıkarın.
2. İsoflurane açmak ve hayvan kurtarma yardım birkaç dakika boyunca oksijen teslim sağlamak. Bir kez fareyi hareket etmeye başlar ve/veya bilincinin tekrar yerine geleceğinden ve kendi kendine yapabilirsin değil, fare onun kafes dönmek.
   Not: Steroid olmayan anti-inflamatuar ilaç (NSAİİ) subkutan enjekte edilebilir (1 mg/kg Meloksikam işlemden sonra herhangi bir rahatsızlık ve/veya ağrı önlemek için).

6. veri analizi

1. Veri analiz yazılımı açın.
2. Yüksek işlem hacmi (sol üst ekranda) gidin. Yukarıdaki analiz etmek için select Gücü frekans ayarları sırasının nitelendirdi.
3. Elle'yi seçin ve "Son imleç" değeri 3'e değiştirin. Ayrıca Kaldırmak temeliseçin.
4. Daha önce gerçekleştirilen yordam erişmek ve ardından Çözümle' yi tıklatın için Pick dosyaları üzerinde tıklatın. Bu noktada sonucu ekranda erişilen veya daha fazla analiz ve/veya hesaplamalar için bir elektronik tabloya dışa.
   Not: Verileri mN ölçüldü; Ancak, tork kolu kol (mutlak gücü) uzunluğuyla kuvvet değeri çarpılarak hesaplanabilir. Normalleştirme gerekli (belirli kuvvet) tork vücut ağırlığı için normalleştirilmiş veya terminal deneyler yaş eşlemeli kas kütlesi toplamak için gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Kuvvet-frekans eğrisi içinde kas kuvvet suboptimal ve en iyi yanıt-e doğru¹⁵ayırt etmek için daha düşük ve daha yüksek frekanslar tarafından uyarılmış yararlı bir testtir. Daha düşük frekanslarda kuvvet birimleri, daha az ve daha küçük motor aktive tek bir seğirme teşvik ettiği ve yüksek frekanslarda istikrarlı bir zirveye ulaştığı, izole twitches (tetanoz) erimiş nerede, tüm motor üniteleri^{16 etkinleştirme yoluyla en fazla kuvvet ulaşan} . Plato tamamlanan erimiş eğrisi⁹ile^{ulaşıldığında sundu, tetanic eğri başlar nerede kullanılmasının muhtemelen görüntülenir ~ 60 Hz'de testi (Şekil 4A) ve maksimum güç ~ 150 Hz (Şekil 4B), belirlenir, 16}.

Bu sonuçlar herhangi bir varyasyonu kasları düzgün elektrotlar tarafından uyarılır değil olduğunu gösterir. Elektrot yerleştirme önemli bir adımdır elektriksel stimülasyon peroneal sinir innervate ve böylece tam olarak dorsiflexion, kasları harekete geçirmek için doğru konumlandırılmalıdır Bu yordam hazırlık olarak, hangi o (TA, edi ve EHL) izlemelidir. Elektrot konumlandırma sonuç negatif tepeler (resim 3) nesil bu işlem sırasında kayma elektrotlar veya daha yüksek amper çevresindeki kaslar, neden ortak daralma uyarmaya yol açabilir, ancak doğru komşu kasları ve sırayla pozitif değerler doruklarına oluşturur antagonist kaslar.

Şekil 5A nerede yordamı 5 timepoints sona kadar haftada bir kez tekrarlandı zamanın ötesinden bir fareden temsilcisi kuvvet frekans eğrisi verileri gösterir. Bu gözlemler tutarlı güç üretim değerleri boyunca timepoints ve/veya ölçülen gözlemleri göstermiştir. Bu yordamı ayrıca 5B rakam temsilcisi FFC eğri altındaki alan üzerinde 5 farklı gözlemler haftada bir kez test 6 farelerde uyarılmış gösterildiği gibi fare ölçümleri arasında tutarlı olacak şekilde göstermiştir.

Resim 1 : Yazılım sistemi. (A)kontrol yazılım illüstrasyon "Anlık STIM" parametreleri ayarlamaya yönelik adımlar. Kurulum arka plan fotoğrafı tıklayın | Anlık STIM. Pencere (açık fotoğraf) attı küçük, parametreleri ayarlayın. (B) "Sequencer" Kur görünümü Illustration. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Fare ayarlar─▒n─▒. İmzalat hayvan konumunu genel bakış. Sağ diz kelepçe böylece diz 90 ° ve ayak ve ayak bileği 90 °'lik açılarla (noktalı beyaz çizgi) böylece yerleştirilir. Dorsiflexors kas kasılması hemen altında bulunan peroneal sinir stimülasyonu ile elde edilir (distal) fibula Başkanı. Biz özel tasarlanmış elektrotlar (gömme); kullanma Ancak, birim ile sağlanan veya ayrı olarak satın alınan iğne elektrotları da yeterlidir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Elektrot yerleştirme çıktı. Elektrotlar deri altında konumlandırıldığından ve gerilim başlatılan sonra zirveleri negatif değerler ile gözlenir. Bu noktada, negatif değerler (yeşil hat) ulaşan stimülasyon dorsiflexor kasları tek (TA, EDL ve EHL) elde edilir emin yapımında çok önemli bir adımdır. Gerçek zamanlı ölçüm iki kırmızı çizgiler arasında gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Temsilcisi eğrileri. (A)örnek kuvvet eğrisi 60 Hz değerinde (fare #06). (B) örnek tetanic eğrisi 150 Hz değerinde (fare #03). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : Temsilcisi kuvvetleri frekans eğrisi (FFC) ve eğri veri alanında. (A) FFC (x ekseni) üzerinde 5 farklı timepoints (hafta 1, 2, 3, 4 ve 5) bir örnek Mouse (#05). (B) alanı üzerinden 5 farklı timepoints FFC eğrisini (AU, y ekseni) altında (#01, 02 03 04 05 ve 06, sırasıyla; fare x ekseni). Sonuçları ortalama ± standart hata ölçüm beş timepoints (testler) 6 farelerde (SEM) olarak ifade edilir ve tek yönlü ANOVA tarafından analiz edildi test (p < 0,05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Tartışmalar

Genetik, metabolik ilerici değerlendirilmesi ve kas koşulları¹⁷maksimal kas contractile fonksiyonu doğru ve yinelenebilir bir şekilde ölçülmesi önemlidir. Benzer şekilde, yeni tedaviler ve tedavi kas koşulları zayıflatıcı için değerlendirilmesi için içinde vivo kas contractile fonksiyonu sağlar. Biz burada fare daha düşük hindlimb içinde vivo bir yordam aracılığıyla dorsiflexor kaslarının gücü üretimi ölçümü göstermek.

Ticari çizgisel verimli ve non-invaziv bu yordamın gerçekleştirilmesi yararlı için. Bu test sırasında hangi kan temini ve innervasyon korunacak yerel bir fizyolojik ortamını koruyarak kas contractile fonksiyonu değerlendirilmesi ile ilgili önemli avantajlar sağlar. Öte yandan, kendi dezavantajları normalleştirme birim çapraz kesit alanı yalnızca deneme sonra hasat izole bir kas tespit edilebilir (belirli kuvvet), kas gücünün ilgilidir. Ancak, non-invaziv test fleksör kas contractile işlevinin birden fazla ölçüm aynı hayvan zamanla, özellikle hedef göreli değişiklik () değerlendirmek için ise deneysel hayvan gerekli, sınırlı sayıda sonuçlanan sağlar değişiklikler zamanla mutlak güç).

Bu işlem sırasında timepoints üzerinde tutarlı veri elde etmek için dikkate alınması gereken önemli adımlar vardır. İlk olarak, bir hayvan mümkün olduğunda konumlandırma standartlaştırmak için denemeniz gerekir. İkinci olarak, kurma sırasında böylece optimum stimülasyon peroneal sinir uyarılması yoluyla ulaşılabilir elektrot konumlandırma ile tutarlı olması önemlidir. (Bu durumda sağ) bacaktaki fibula Başkanı ve diğer yan tarafında elektrotlar konumunu bacak (Şekil 2) yan yüzünde daha fazla olması gerekir. Buna göre özel yapım elektrotlar gibi her ikisi de her zaman aynı konumda yerleştirilen tasarlanmıştır. Ancak, yeterli uyarılması da ticari için aygıtlar ile sağlanan elektrot iğneler kullanılarak elde edilebilir. Üçüncü olarak, tabanla için bağlı dönüştürücü saat yönünde çevirerek gerilim kurulum sırasında negatif doruklarına ulaşmak çok önemlidir. Doğru fare bacak elektrotlar ile maksimum gerilim kurulum konumlandırma aynı fare zaman içinde gerçekleştirilen bir teknik olarak göstermiştir.

Aynı hayvan üzerinde kas fonksiyonu farklı timepoints, izlemek ve değerlendirmek için farklı kas hastalıkları gibi onların ilerleme karakterize etmek için önemli bir değerlendirme yeteneğidir. Ayrıca, kas dorsiflexion farelerde bu ölçümü en düşük metabolik stres¹²ile doğal bir fizyolojik ortamda potansiyel tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için bir araç olabilir. Bu nedenle kas hastalığı, ilerleme ve potansiyel tedavi değerlendirirken bir teknik sunar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse	Aurora Scientific Inc.	305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus	Complete muscle function system
Conductive gel	Livingstone	ECGEL250	conductive gel used in the mice
Eye ointment	Alcon	Poly Visc	pharmaceutic product (ophthalmic use)
nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID)	Ilium	Metacam	veterinary medicine (injectable 5mg/ml)
Isoflurane	Zoetis	Isoflo	veterinary inhalation Anaesthetic