NlsGPS1 Förster rezonans enerji kullanarak görüntülenmesi hücresel Giberellin düzeyleri (FRET) biyoalgılayıcı aktarma

Özet

Giberellin algı sensör 1 (GPS1) Giberellin etki kronolojik zamanmekansal yüksek çözünürlüğe hücresel düzeyde ölçmek için ilk Förster rezonans enerji transferi tabanlı biyoalgılayıcı olduğunu. Bu iletişim kuralı yöntemi görselleştirmek ve genetik olarak kodlanmış nlsGPS1 biyoalgılayıcı Arabidopsis hypocotyls ve kök ipuçlarını kullanarak hücresel Giberellin düzeyleri ölçmek için raporlar.

Özet

Phytohormone Giberellin (GA) bitkilerde tohum çimlenme, hücresel uzama ve gelişimsel geçişler önemli bir rol oynayan bir küçük, telefon sinyal moleküldür. İlk Förster rezonans enerji transferi (FRET) olan Giberellin algı sensör 1 (GPS1)-hücresel GA düzeyleri içinde vivo izleme sağlar biyoalgılayıcı dayalı. Nükleer lokalize-GPS1 (nlsGPS1) Floresan emisyon oranını ölçerek, endogenously ve exogenously verilen GA degradeler farklı doku türlerine kronolojik zamanmekansal haritalama hücresel bir ölçekte mümkün olabilir. Bu iletişim kuralı nlsGPS1 emisyon oranları üç örnek deneylerde görüntüye nasıl anlatacağım: kararlı durum, öncesi ve sonrası eksojen Giberellin A₄ (GA₄) tedavi ve bir tedavi zaman-ders bitti. Biz de nlsGPS1 emisyon oranları Fiji ve ticari üç boyutlu (3-b) test görselleştirme ve analiz yazılımı kullanarak analiz ve sınırlamalar ve Giberellin düzeylerini ölçmek için nlsGPS1 kullanarak büyük olasılıkla tuzaklar açıklamak için yöntemler sağlar.

Giriş

Bitki hormonları bitki büyüme ve gelişmesi temel bir rol oynar. Bu küçük, telefon sinyal molekülleri genellikle biyosentezi, katabolizma ve kısa ve uzun mesafeli taşıma^1,2,3,4gibi çeşitli düzeylerde düzenlenmektedir. Hormon sinyal yolları ve aşağı akım transkripsiyon yanıt anlayışı yılda bilenmiş. Ancak, çeşitli hücresel yanıt hormon sinyal yollar hormon dağıtımları yönetmenlik düzenleyici girişleri ile bağlamak için biz hormon düzeyleri hücresel bir ölçekte kronolojik zamanmekansal bir miktar gerektirir. Etki tespit edebilirsiniz FRET tabanlı biyosensörler hormon düzeyleri, hücresel bir ölçek ölçmek için bilim adamlarının yetenek ilerletebilirsiniz. Biyosensörler FRET tabanlı belirli bir ligand bağlar veya biyolojik bir uyarana tepki duyusal bir etki alanına bağlı bir perde çift (donör ve alıcısı floresan proteinleri) oluşur. Küçük molekül biyosensörler için mesafe ve/veya yönünü FRET çiftinin iki floresan proteinler arasında bir değişim sonuçlarının duyusal etki alanının konformasyonal değişim ligand bağlayıcı tetikler. PERDE biyoalgılayıcı ratiometric analizini donör heyecan verici ve alıcısı floresans emisyon oranını ölçerek donör^5,6gerçekleştirilir. Ligand bağlayıcı bir değişiklik bu emisyon oranı⁷olarak algılanabilir.

Bitki hormon GA gaz için tohum çimlenme, hücresel uzama ve çiçeklenme aşamaları bitkisel gelişimsel geçiş yükseltebilirsiniz hormonların bir sınıf biz son zamanlarda FRET tabanlı biyoalgılayıcı geliştirilmiştir. NlsGPS1 biyoalgılayıcı nükleer lokalize ve GA dynamics çeşitli bitki dokularında kronolojik zamanmekansal ilgili bilgiler sağlar. Arabidopsis hücrelerdeki GA çözünür reseptörleri, Giberellin-duyarlı cüce (GID), bağlar ve karmaşık GA²sinyal negatif düzenleyiciler hareket DELLA protein bozulması indükler. NlsGPS1 GA duyusal etki alanına bağlanır DELLA protein (AtGAI) 74-amino asit kesilmesi Arabidopsis GA reseptör (AtGID1C) oluşur ve oluşan bir perde çift gelişmiş Cerulean donör floresan protein olarak dimerization türevleri ve Aphrodite (kodon çeşitlendirilmiş Venüs) alıcısı floresan protein⁸olarak. NlsGPS1 biyoalgılayıcı olan bir yüksek-benzeşme sensör biyoaktif GA₄ için (K_d = 24 nM GA₄için) ve çeşitli doku-harita ve GA degradeler ölçmek için türlerinde kullanılabilir. İçinde vivo Arabidopsis GA düzeyleri yanlış yorumlanmasına önlemek için Ayrıca nlsGPS1 yanıt vermeyen bir türevi geliştirdik (nlsGPS1-NR) negatif bir denetim olarak kullanmak için. NlsGPS1-NR protein GA bağlama bozabilecek mutasyonlar GA-bağlama cebinde ve GID reseptör proteinler^7,9ile etkileşim bozabilir DELLA protein mutasyonların taşır. Emisyon oranı desen veya nlsGPS1 ve nlsGPS1-NR satırlarında gözlenen değişiklikleri doğrudan GA-bağlama olayları ile ilgili eserler olarak kabul edilebilir. NlsGPS1 bağlama GA₄ hızla tersinir değildir ve bu nedenle, hücresel nlsGPS1 emisyon oranları GA en son yoğun belirli bir çekirdek yerine gerçek zamanlı temsil olarak yorumlanması gerektiğini unutmamak önemlidir kararlı durum düzeyleri. Sonuç olarak, bir analizini düşen GA düzeyleri ile nlsGPS1 mümkün değildir.

Burada biz bir nlsGPS1 biyoalgılayıcı model bitki Arabidopsisconfocal görüntüleme tabanlı yaklaşımlar yüksek çözünürlüklü kullanarak, hücrelerdeki kullanmak için detaylı bir protokol sağlar. Protokol görüntüleme bitki kökleri ve hypocotyls kararlı duruma hem üzerinde zaman-Dershaneler hakkında bilgi sağlar. NlsGPS1 sensörü çeşitli doku tipleri, hem de harita ve GA dağıtımları ölçmek için bitki türleri arasında potansiyel olarak yararlanılabilir.

Protokol

1. hazırlıkları

1. ½ Murashige ve Skoog agar pH 5,7 yok sukroz (1 L) ile hazırlamak.
   1. Murashige ve Skoog (MS) Bazal orta Ultrasaf Su 950 ml 2,2 g geçiyoruz. PH 5 M KOH ile 5,7 için ayarlayın.
   2. 1 L son bir birime Ultrasaf Su ile çözüm kadar olun. İki 500 ml'lik şişe, her içeren %1 bitki agar bölün. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de.
2. ¼ MS sıvı pH 5,7 yok sukroz (1 L) ile hazırlayın.
   1. MS 1.1 g Ultrasaf Su 950 ml geçiyoruz. PH 5 M KOH ile 5,7 için ayarlayın. 1 L son bir birime Ultrasaf Su ile çözüm kadar olun. İki 500 ml'lik şişe bölün. Otoklav 20 dk için 121 ° C'de.
3. GA₄hazırlayın.
   1. % 100 mM GA₄ hisse senedi son bir konsantrasyon yapmak için etanol 70 GA₄ geçiyoruz.
   2. Çalışma çözüm hazırlamak için GA₄ stok 0.1 – 1 oranında seyreltin ¼ MS sıvı pH 5,7 µM.

2. bitki büyüme

1. Arabidopsis tohum sterilize.
   1. Kimyasal bir başlık kullanarak çalışır. 2 mL microcentrifuge tüpler halinde aliquot tohumları (yaklaşık 200 tohum). Bir marker ile klor dirençli mürekkep kullanma ve tüpleri açık kapakları ile sterilizasyon gemi (kapalı gibi büyük bir kutu) içinde yer.
   2. 50 mL Ultrasaf Su ve 50 mL sodyum hipoklorit çözeltisi sterilizasyon gemi içinde içeren 250 mL kabı yerleştirin.
   3. Konsantre hidroklorik asit (HCl) 3 mL kabı için ekleyin. Hemen taşıyıcıyı mühür ve sterilizasyon için 6-16 h klor gazı tarafından izin.
   4. Gemi getirdiğin sonra tohum rafa microcentrifuge tüpler kapakları kapatın. Steril tohumları kuru kaplama zamana kadar saklanabilir.
2. Yaklaşık 20 sterilize Arabidopsis tohumları ½ MS agar kare plakalar üzerinde ekmek. Gözenekli cerrahi bant ile plakalarının ve onları alüminyum folyo ile sarın. Onları stratifikasyon için 1-3 gün için 4 ° C'de kuluçkaya.
3. Kök görüntüleme için plakaları büyüme odasına bir dikey pozisyonda aşağıdaki büyüme koşulları ile 3 gündür transfer: uzun günlük koşulları (LD, karanlık ışık/8 h 16 h); 120 µmol⋅m^-2s^-1 ışık şiddeti; sıcaklığı 22 ° C (ışık-siklet sırasında) veya 18 ° C (karanlık döngüsü) sırasında %65 bağıl nem (RH).
4. Karanlık-yetiştirilen hypocotyl için: tabakları büyüme odası ışık nabzı çimlenme eşitlemek için 1-4 h için transfer. Levha alüminyum folyo ile sarın ve 3 gün boyunca bir dikey pozisyonda büyüme odasına koyun.

3. numune hazırlama

1. Kararlı durum ölçümleri (Şekil 1A)
   1. Temiz mikroskop slayt üzerinde 50 µL ¼ MS sıvı (bundan olarak adlandırdığı sahte çözüm olarak) ekleyin. Yavaşça slayda plaka nlsGPS1 ifade fidan aktarın.
   2. Temiz bir coverslip almak ve bir damla vakum yağ coverslip köşelerinde spot. Yavaşça coverslip fidan yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak için ekstra sahte çözüm dikkatle ekleyin.
2. GA₄ tedavi: kimyasal değişimi deneyi (Şekil 1B).
   1. GA₄ tedavi öncesi (damlalıklı bahşiş ekli) vakum yağıyla dolu bir dikdörtgen çizmek için bir 20 mL şırınga kullanın (Uzunluk: 3,5 cm, Yükseklik: 2,5 cm) bir temiz cam slayt (Şekil 1B) vakum yağıyla Tekdüzen bir tabaka ile. Vakum yağ ince bir çizgi için izin vermek için damlalıklı uç çapı 1 mm bir açılış için kesilmelidir.
   2. Sahte çözüm 50 µL cam slayt ekleyin. Temiz forseps ile nlsGPS1 fidan al ve yavaşça onları sahte çözüm üzerinde yerleştirin. Herhangi bir zarar görmesini önlemek için fidan fide forseps ile açgözlü olmadan cotyledons renktedir destekleyerek aktarın.
   3. Temiz bir coverslip almak ve bir damla vakum yağ coverslip köşelerinde spot. Forseps kullanarak, coverslip vakum yağ dikdörtgen ortasına yerleştirin. Şimdi coverslip vakum yağ dikdörtgenin uzun kenarlarını karşılık gelen iki yanda kilitlendi.
   4. Dikkatlice rezervuar doldurun ve herhangi bir hava kabarcıkları rezervuar içinde seedling(s) içinde bozmadan kaldırmak için ekstra sahte çözüm ekleyin.
   5. Confocal bir mikroskop kullanarak GA₄ tedavi öncesi görüntüler elde etmek. Bu protokolün 4 bölümde açıklandığı gibi yönergeleri izleyin.
   6. GA₄ tedavisi için mikroskop slayt confocal sahne alanı'ndan kaldırın. 20 min için bir zamanlayıcı ayarlamak.
   7. Zamanlayıcıyı başlattıktan sonra arabellek çözüm 1 µM GA₄içeren ¼ MS sıvı ile değişimi. Coverslip sol taraftan GA₄ çözüm (yaklaşık 50 µL) ekleyin ve önceki (sahte) çözüm sağ taraftan kaldırın. Devam çözüm yaklaşık 10 dk (Şekil 1B) alır tamamen, sahte çözüm yerini değiş tokuş tutmak.
   8. Cam slayt geri mikroskop sahne alanı üzerine yerleştirin. Başka bir 10 dk sonra GA görüntü alınıyor önce bekleyin.
3. Doku ilgi için bir zaman tabii kurmak
   Not: Faiz dokusunun, örneğin, hypocotyls veya kökleri olabilir. Biz düzenli olarak nlsGPS1 biyoalgılayıcı bir ticari perfüzyon sistemi kullanarak görüntüleme için zaman içerisinde gerçekleştirmek (Şekil 1 c, Tablo malzemelerigörmek) ya da bir RootChip^7,10,11.
   1. Perfüzyon kanal yapışkan slaydın merkezine 200 µL sahte çözüm ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Yavaşça nlsGPS1 fidan almak ve yapışkan slaytta yer sahte çözüm üzerinde koyun.
   2. Forseps kullanarak, hafifçe cam coverslip yerleştirin ve, yapışkan slaydın periferal yapışkan malzeme ile güçlü bir bağ oluşturur böylece forseps arka kullanarak, yavaşça coverslip dış kenarlardan bastırın.
   3. İki dirsek radarı Konnektörler (ile bir iç çapı [ID] 0.8 mm) ve silikon tüp (ile bir kimliği için 0.8 mm) bağlanırken yapışkan slayt 20 mL şırınga ve çıkış çözüm toplama bir çıkış kapsayıcı. Şırınga silikon tüp bağlamak için radarı kilit konektörü (kimlikli bir 0.8 mm) kullanın.
   4. Böylece odasında yaptı hiçbir hava kabarcıkları ile odaya geçmek yeterli bir çözüm el ile izin vermek sahte solüsyon içeren şırınga hafifçe bastırın. Koyun ve şırınga programlanabilir şırınga pompa üzerinde tutun.
   5. Pompa parametreleri belirli kullanılan şırınga (i.e., çapı ve hacmi) ile birlikte debisi pompa ile sağlanan kılavuzuna göre ayarlayın.
      Not: Bu iletişim kuralı, 1-3 mL/h debi kullanıldı ve bu deneysel talepleri doğrultusunda değiştirilebilir. Zamanlı kurs pompa başlatarak başlatın.
   6. GA₄ tedavi sırasında bir saat ders (Şekil 1 c) pompa duraklatarak perfüzyon durdurun ve şırınga GA₄ile desteklenmiş bir yeni bir içeren ¼ MS sıvı ile değiştirin. Confocal görüntüleme ile sonraki bölümde gösterildiği gibi devam edin.

4. mikroskobu

Not: Confocal lazer mikroskobu gerçekleştiriyoruz.

1. PERDE görüntüleme gerçekleştirmek için lazerler ile donatılmış confocal mikroskop kullanarak görüntüleri elde etmek.
   Not: NlsGPS1 için değişik-in mavi flüoresan protein (CFP) ve Sarı floresan protein (YFP) görüntüsü. Bu protokol için ticari mikroskoplar ( Malzemeler tablo1 ve 2 mikroskop listelenen, görmek) 10 x veya 20 x kuru 0.70 harmonik bileşik APO planı hedefleri ile kullanılır.
2. Mikroskop 1, kullanım 448 nm ve 514 nm dalga boyu lazerler CFP ve YFP, sırasıyla heyecanlandırmak için için. Sıralı inceden inceye gözden geçirmek almak. 460-500 nm CFP (donör emisyon) için ve 525-560 nm YFP (FRET emisyon) için CFP uyarma sonra algılamaya dedektörleri (örneğin, HyD SMD) ayarlayın. İkinci bir dizi kullanarak, 525-560 nm YFP (YFP emisyon) için algılamak için bir dedektör YFP uyarma sonra ayarlayın.
   Not: Bu YFP floresan bir ifade denetimi olarak yanı sıra çekirdeği, segmentlere bir ticari 3-b test görselleştirme ve analiz yazılımı kullanarak yüzeyler oluşturmak için kullanılır.
3. Mikroskop 2, kullanım 440 nm ve 514 nm dalga boyu lazer satırlar CFP ve YFP, sırasıyla heyecanlandırmak için için. İki parça elde etmek. 1 parça için 464-500 nm CFP (donör emisyon) için ve 526-562 nm algılamaya dedektörleri (e.g., ChS) CFP uyarma sonra YFP (FRET emisyon) için ayarlayın. İçin Tam2, 526-562 nm YFP (YFP emisyon) için algılamak için bir dedektör YFP uyarma sonra ayarlayın.
   Not: Bu YFP floresan bir ifade denetimi olarak yanı sıra çekirdeği, segmentlere yüzeyler 3 boyutlu görselleştirme ve analiz yazılımı oluşturmak için kullanılır.
4. 512 x 512 piksel biçimi ve 12 bit çözünürlük kullanarak görüntüleri elde etmek.
5. Kazanç için iyi sinyal piksel doyurarak süre değil sağlar ampirik olarak kararlı bir değere ayarlanması gerekir. Kazanç CFP ve perde emisyon üzerinde deneme arasında değiştirilmemelidir. İğne deliği ve sondaj 1 havadar birimine (AU) ayarlayın. IBIDI yapışkan-slayt confocal mikroskop aşamada yerleştirin ve daha önce gösterilen görüntüleme ile devam edin.
6. Mikroskop 1 yazılım, bir aktif canlı tarama yaparken, görüntü ekranın sol üstte bulunan pozlama ve doygunluk ilgi bölgesinin belirlemek için kızdırma/üstü kızdırma kullanmaktadır. Mikroskop 2 yazılım, pozlama ve doygunluk ilgi bölgesinin belirlemek için görüntü ekranın alt tarafında bulunan Aralığı göstergesi kullanmaktadır. Herhangi bir sayısal görüntü analizi için hiçbir piksel doygunluk olmalıdır.
7. 1 mikron büyüklüğünde bir adım z. Baca'ya ayarlayın. Adım boyu için artan bir z-çözünürlük azalır veya için alım veya yansıması pozisyonlar/örnek sayısını artırmak için artan bir hızı artar. Otomatik zamanlı kurs için saati ayarla aralıklarla görüntüleri elde etmek için z-yığınları (satın alma modu sekmesinden xyzt modu) ile birlikte saatini ayarlayın.

5. Fiji kullanarak görüntü analizi

Not: ImageJ (Fiji) kullanarak görüntüleme verileri işlemek ve Arabidopsis fidan nlsGPS1 emisyon oranı iki boyutlu (2B) görüntüleri üretmek mümkündür. Resim örnekleri için bkz: Şekil 2A, 2 C, 2E, 2 Gve 3A. ImageJ içinde her komut arama işlevini kullanarak bu protokol bulmak mümkündür. Boşluk çubuğuna ve L bilgisayar klavye tuşuna basın. Yeni bir pencere açılacaktır; gerekli komut arama alanına yazın.

1. Dosya (.lif veya .lsm dosyaları) Fiji (görüntü J) sürükleyin ve hiper-yığını olarak görüntüleri açın.
2. Ana menüde resim > yığın > Z proje ve select toplamı dilimleri sadece en parlak piksel maksimum projeksiyonolduğu gibi yerine tüm pikseller yakalamak için.
3. Ana menüde işlem > çıkarma arka plan ve küme çalışırken topu RADIUS 50 piksel ile. Diğer seçenekleri seçimini kaldırın ve tüm üç görüntüleri işlemek. Bu adım "top haddeleme" algoritması kullanılarak arka plan kaldırır.
   Not: 50 piksel ampirik olarak kararlı çekirdekler ön plan dahil etmek için.
4. Ana menüde resim > renk > Split kanalları. Üç yeni pencere açılacaktır: C1-SUM (CFP kanal); C2-SUM (FRET kanalı) ve C3-SUM (YFP kanal).
5. C3-SUM pencereyi seçin ve ana menüde işlem > filtre > Gaussian Blur ve bir Gaussian görüntü paraziti azaltmak için Blur 1 uygulamak.
6. Ana menüde resim > Ayarla > Parlaklık/kontrast ve select otomatik.
7. Ana menüde işlem > Kontrastı Artırve set doymuş 0,35 =.
8. Ana menüde resim > türü > 8-bit ve yığınlar 8-bit görüntüye dönüştürmek.
9. Ana menüde resim > ayar > Otomatik yerel eşik. Otomatik yerel eşikiçinde aşağıdaki parametreleri seçin: Phansalkar yöntemi, RADIUS 15 =, parametre 1 = 0, parametre 2 = 0ve beyaz yığını. Bu adımda, YFP yığınları ikili bir maske yapmak için kullanılır.
10. C2-SUM pencereyi seçin ve ana menüde işlem > filtre > Gaussian Blur ve bir Gaussian Blur 1 uygulamak.
11. C1-SUM pencereyi seçin ve ana menüde işlem > filtre > Gaussian Blur ve bir Gaussian Blur 1 uygulamak.
12. Ana menüden iki kanallardan emisyon oranı yığını oluşturmak için işlem seçin > Görüntü hesap makinesi. Görünür, yeni pencerede seçin C2-toplamı olarak resim 1, bölme işleci seçin ve C1 toplam 2 resim olarak seçin.
13. Create yeni bir pencere ve 32-bit biçimi seçtiğinizden emin olun. Yeni pencere-ecek gözükmek adlandırılmış Sonuç olarak C2-toplamı.
14. Ana menüde resim > arama tablosu > LUT 16_colors.
15. Ana menüde işlem > Görüntü hesap makinesi. Görünür, yeni penceresinde select Sonuç olarak C2-toplamı olarak resim 1, çarpma işleç seçin ve C3-toplam 2 resim olarak seçin. Bu adımda, YFP ikili maskesi yalnızca piksel YFP denetim kanalı mevcut göstermek için YFP/CFP deste ile çarpılır.
16. Ana menüde işlem > matematik > Böl ve küme değeri 255. Açılan yeni pencerede, yığındaki tüm görüntüleri analiz etmek için Evet ' i seçin. Yeni bir resim adlandırılmış Sonuç, sonuç olarak C2-toplamıgörüntülenir.
17. Ana menüde resim > Ayarla > Parlaklık/kontrast ve select Otomatik.
18. Ana menüde işlem > Kontrastı Artır' nı seçip doymuş türü 0,35 =.
19. Ana menüde resim > Ayarla > Parlaklık/kontrastve set minimum ve maksimum değerleri GA dağıtım yakalamak için. İsteğe bağlı adım: Ana menüden analiz > Araçlar > Kalibrasyon Bar ve gösteri LUT-kalibrasyon barve Sonuç olarak sonuç, C2-toplamı .tiff dosyası olarak kaydedin.
20. Oranları, emisyon değerlerini elde etmek için analiz ana menüden seçin > ölçüm ayarla ve select gri değeri demek ve Standart sapma.
21. Dikdörtgen şekli araç çubuğundan seçin ve bir bölge ilgi (ROI) çizin. Ana menüden analiz > ölçü birimi. Yeni bir pencere seçilen yatırım getirisi ortalama değerden bildirir.
22. Kopyalayın ve elde edilen değerler (örneğin, Excel veya OriginPro) elektronik tablo yazılımı yapıştırın ve deney öncesi ve sonrası GA₄ tedavi için bir histogram veya deneme bir çizgi grafik için bir saat ders yapmak.

6. 3-D görüntüleme ve analiz yazılımı kullanarak görüntü analizi

Not: Seçilen yazılım kullanmanın avantajı (bakınız Tablo reçetesi) nesneleri (örneğin, çekirdeği) segment ve 3-b görüntüler confocal z-yığından oluşturmak etmektir. Görüntüleri örnekleri için bkz: Şekil 2B, 2D, 2F, 2 Hve 3B.

1. Yazılımını açın ve dosya (.lif veya .lsm dosyaları) alın.
2. Segment çekirdeği denetimine YFP emisyon kanal yüzeyler Sihirbazı'nıkullanarak bağlı. Bölümlenmiş nesneleri "yüzeyler" denir. Bu bölümleme adım tüm voxels Analizi tek nesne olarak voxels çekirdeği dışında kökenli ayrıcılıklarına olan bir çekirdeğinde izin verir.
3. Yüzeyler Sihirbazı' nda, 3 µm arka plan çıkarma (yerel kontrast) varsayılan eşik ayarlayın. CFP emisyon (donör uyarma donör emisyon [DxDm]) ve perde emisyon (donör uyarma alıcısı emisyon [DxAm]) kanalları YFP emisyon (alıcısı uyarma alıcısı emisyon [AxAm]) Kanal kullanılarak oluşturulan yüzeyler üzerinde dayalı maske.
4. Uzantısı XT demek yoğunluk oranı donör uyarma donör emisyon (DxAm/DxDm) iki kanaldaki bireysel yüzeyleri ortalama yoğunluk değerleri arasında bölünür donör uyarma alıcısı emisyon oranını hesaplamak için kullanın.
   Not: Bu uzantı online indirmek için kullanılabilir.
5. NlsGPS1 emisyon oranı ile bireysel yüzeyler renk için renk tekerleği simge olarak temsil istatistikleri ile kodlama rengi, seçin. Yoğunluk oranı demek istatistik türü olarak seçin.
6. İstatistik simgenin altında bulunan tablo, tek tek değerleri oranları verilecek.
7. Kopyalayın ve değerleri bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz ve GA₄ tedavi deney öncesi ve sonrası için bir histogram veya saat ders deneyler için doğrusal bir grafik yapmak.

7. istatistiksel analiz

Not: 3D anlamaya nlsGPS1 emisyon oranları beeswarm ve kutusunu çizim için görmek.

1. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve emisyon oranı Y sütunlar çekirdeği yüzeylerin yapıştırın.
2. Faiz sütunlarını seçebilir ve İstatistikleri seçin > İstatistik açıklaması > örnekleri normalde dağıtılıp dağıtılmadığını bilmek normallik sınayın . Normallik testini çalıştırın ve yeni bir pencere açılır ve rapor-den sonuçlanmak.
3. Örnekleri normalde dağıtılmışsa kullanın t-test istatistiksel test olarak. İstatistik seçin > hipotez testleri > iki örnek t-testi satırları üzerinde ve Çalıştır t-test.
4. Örnekleri normalde dağıtılmış değildir, İstatistikleri seçin > istatistik hipotez testleri > örnekleri arasındaki fark önemli ölçüde farklı olup olmadığını bilmek iki örnekli varyans için test .
5. Varyans önemli ölçüde farklı değilse, Mann-Whitney U testi istatistiksel test olarak kullanın. İstatistik seçin > Parametrik olmayan Test > Mann-Whitney test ve çalışma testi.
6. Farkı önemli ölçüde farklı ise, Kruskal Wallis ANOVA testi istatistiksel test olarak kullanın. İstatistik seçin > Parametrik olmayan Test > Kruskal Wallis ANOVA test ve çalışma testi.

Sonuçlar

NlsGPS1 kullanarak, kök ipuçları ve karanlık yetiştirilen hypocotyls (Şekil 2) dahil olmak üzere floresans görüntüleme için mükellef dokularda hücresel GA₄ düzeyleri ölçmek mümkündür. Arabidopsis kökte nlsGPS1 emisyon oranı degrade meristematik ve bölümü bölgelerinde GA düzeyi düşük ve yüksek GA düzeylerinin geç uzama bölgedeki (Şekil 2A ve 2B) göstergesidir. Buna ek olarak, bir emisyon oranı degrade endojen GA degrade bir yapay doku (Şekil 2C ve 2D) olmadığını düşündüren nlsGPS1-NR kökleri gözlendi değil. NlsGPS1 emisyon oranı degrade ayrıca karanlık yetiştirilen hypocotyls içinde cotyledons ve apikal kanca düşük düzeyleri ve hypocotyl (Şekil 2E ve 2F) hızla elongating bazal bölgesinin yüksek düzeyleri ile kuruldu. Buna ek olarak, bir emisyon oranı degrade nlsGPS1-NR hypocotyls (Şekil 2 g ve 2 H) gözlenmiştir değil. Hem Arabidopsis kökleri ve karanlık yetiştirilen hypocotyl hücreleri, endojen GA birikimi hücresel uzama oranı ile korelasyon.

Ayrıca, exogenously sağlanan GA₄ tercihen (Şekil 3), Arabidopsis kök bölümü bölgesine göre uzama bölgedeki bu nlsGPS1 endojen ve eksojen GA eğitim için kullandığını gösteren birikir desenlendirme.

Saat ders deneyler, fidan yapışkan slayt odasında yerleştirilir ve ¼ MS sıvı ile derin nlsGPS1 sırasında GA₄ 30 dk için bir tedavi 0,1 µM ile izledi. Video Bölümü bölgesine (Video 1) göre kök uzama bölgedeki eksojen GA₄ daha hızlı bir birikimi gösterir.

Şekil 1: örnek confocal görüntüleme için hazırlık. Bu paneller şematik numune hazırlama eksojen GA₄ tedavi öncesi ve sonrası (A) bir kararlı durum deneyi, (B) ve (C) bir tedavi saat ders deneme kullanarak gösterir. yapışkan-slaytlar (C). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: GA degradedeki Arabidopsis kökleri ve karanlık yetiştirilen hypocotyls. İki boyutlu görüntüler(a)nlsGPS1 ve (C) nlsGPS1-NR kökleri ImageJ yazılımını kullanarak analiz edildi ve (B) nlsGPS1 ve (D) nlsGPS1-NR üç boyutlu görüntülerini kullanarak ticari bir üç boyutlu analiz edildi görüntü analiz yazılımı. Her iki analizleri endojen bir GA₄ Arabidopsis kökleri degrade gösterdi. (E) nlsGPS1 ve (G) nlsGPS1-NR karanlık yetiştirilen hypocotyl iki boyutlu görüntülerini ImageJ yazılımını kullanarak analiz ve (F) nlsGPS1 ve (H) nlsGPS1-NR üç boyutlu görüntülerini kullanarak analiz ticari üç boyutlu görüntü analiz yazılımı. Her iki analizleri endojen bir GA₄ hypocotyls karanlık yetiştirilen degrade gösterdi. NlsGPS1 emisyon oranları yanlış coloration LUT çubuğu görüntüler. YFP görüntüler ifade denetimleri rapor edilir. Hypocotyl görüntüleri iki sahne pozisyonlar kullanılarak elde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: kökleri eksojen GA degradede. İki boyutlu ilk iki panel show(a)ve (B) üç boyutlu görüntüleri önce nlsGPS1 kök ve 20 dk sonra eksojen GA₄ (1 µM) tedavisinde. YFP görüntüler ifade denetimleri rapor edilir. Son iki panel show (C) ortalama ve standart sapma ve nlsGPS1 emisyon oranları uzama bölge (bölge ile beyaz bir çerçeve tanımlanan) çekirdekleri için (D) beeswarm ve kutu arsa. Uzama bölgesinde nlsGPS1 emisyon oranı GA₄ tedaviden sonra önemli ölçüde daha yüksek (Mann-Whitney U testi, *** P-değeri < 0.0001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Video 1: perfüzyon deney yapışkan slayt kullanarak nlsGPS1 kökünün. Bu video ¼ MS sıvı ile derin ve 30 dk için 0,1 µM GA₄ ile tedavi nlsGPS1 üç boyutlu görüntüleri gösterir. Zamanlı kurs görüntüleme her 10 min aşağıdaki aralıklarla 3 h için satın alınmıştır: sahte çözüm 30 dk (çerçeve t = 1, t = 2, t = 3), GA₄ tedavi 30 dk (çerçeve t = 4, t = 5, t = 6), sahte 2 h yani Lution (çerçeve t = 7 t = 18) çözüm. Önce satın alma, örnek 2 h. bu videoyu izlemek için buraya tıklayın lütfen için sahte çözüm ile derin. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Tartışmalar

PERDE tabanlı GA biyoalgılayıcı nlsGPS1 rapor ve GA hormon gradyanlar çok hücreli bitkiler ölçmek için nicel bir yöntem sağlar. Biyosensörler FRET tabanlı dynamics ile geliştirilmiş bir kronolojik zamanmekansal kararlılık kütle spektrometresi ve transkripsiyon gazetecilere veya sinyal-protein yıkımı-tabanlı yöntemleri^{12tarafından dolaylı ölçüm üzerinde doğrudan algılama ölçmek, 13}. Yüksek çözünürlüklü hücresel görüntüleme çeşitli doku tipleri ile ilgili yönetmelik ve GA birikimleri çok hücreli bir bağlamda fonksiyonun biyoloji ve kıvılcım yeni hipotezler GA içine anlamlı yorumlara yol açabilir. Örneğin, nlsGPS1 biyoalgılayıcı belirli GA biyosentetik, katabolik ve taşıma mutantlar yanı sıra spatiotemporally indüklenen tedirginlikler sırasında değişiklikleri izleme özellikle nasıl GA gradyanlar içinde kurulan test etmek için çok bilgilendirici olabilir GA degradeler için yanıt adresi kök ve kök hücre. Sensör diğer modeli ve kırpma türler içinde tohum çimlenme, hücresel uzama ve çiçekli GA-aracılı kontrolü kontrol mekanizmaları korunması test etmek için kullanılabilir.

Kritik nlsGPS1 biyoalgılayıcı perde tabanlı görüntülemede adımlardır, 1) piksel nicel FRET çözümleme sırasında doymuş değil, "Dedektör kazanç" gibi 2) görüntüleme parametreleri tutulan donör emisyon (DxDm) için sabit ve alıcısı emisyon (DxAm) satın almalar, 3) kontrol nlsGPS1-NR şeritleri eserler ve 4 ekarte için kullanılması gereken) örnekleri drift ve Değiştir odak sorunları en aza indirmek için hazır. Ayrıca, çevresel koşullar içinde örnekleri yetiştirilmektedir GA düzeyleri ışık süresi ve ışık şiddeti^{14,15,16 gibi çevresel koşullara duyarlı olduğundan denetlemek önemlidir ,17}. Bir anahtar analiz bu tür sinyal / gürültü oranı yüksek gürültü ratiometric görüntülemede doğasında artış nedeniyle görüntüleme için gerekli olduğunu kısıtlamasıdır. Böylece, nlsGPS1 görüntüleme doku ve organların ratiometric floresan mikroskopi için mavi ve Sarı floresan proteinleri kullanarak mükellef olmayan için yararlı olmayacaktır — örneğin, derin doku nerede floresan proteinler kötü algılanır. Bir iç kontrol biyoalgılayıcı ifadesi, istikrar, parlaklık veya belli bir hücre, doku tespit değişikliklerden kaynaklanan eserler ekarte için yararlıdır çünkü Öte yandan, ratiometric güzel intensiometric çıktıları üzerinde tercih edilen çoğu kez , veya durumu. Örneğin, üzülmek biyoalgılayıcı görüntüleme ve görüntü analizleri de doku^{5,6,18,19,20,}çeşitli ligandlar çeşitli eğitim için kullanılmıştır. Görüntüleme deneyleri ve rapor burada görüntü analizleri gibi türleri'nde, örneğin, daha derin kök doku-roman anlayışlar verim hafif levha mikroskobu, yeni görüntüleme yöntemleri uyacak şekilde değiştirilebilir.

Birinci nesil nlsGPS1 biyoalgılayıcı Ayrıca eksojen GA tedavileri takip GA hücre içi artışlar rapor GA degradeler yüksek çözünürlüklü bir harita sağlar bir yüksek-benzeşme sensör olduğunu. NlsGPS1 geçerli sınırlamaları sensör hızla tersinir değildir ve böylece, kararlı durum GA düzeyde değil ama büyük olasılıkla, en fazla son GA konsantrasyonu çözümdeki faiz üzerinde raporlar, biridir. Sensör için kesin devir hızı da bilinen ve bu, düşük reversibility ile birlikte oluyor endojen GA depletions olarak algılanmasını önleyen bir kaç saat içinde bazı doku türleri için bir dakika içinde. O nlsGPS1 GA₄ için yüksek bir yakınlık vardır unutmamak önemlidir (K_d = 24 nM) diğer GA biçimlerine göre (GA₃ K_d= 240 nM, GA₁K_d 110 = nM) ne zaman diğer biyoaktif gaz ^{görüntüleme 7}. GA biyosensörler gelecek nesiller reversibility yüksek afinite koruyarak artırmak veya çeşitli öncü, biyoaktif, veya catabolite gaz için farklı özelliklerine sergi için tasarlanmış. 

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds	NASC	N2107735
Gibberellin A4 (GA4)	Sigma	G7276	dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach)	Fisher S/5040	HSRA 064
Hydrogen cloride HCl	Sigma	31434
Micropore tape	3M	1530-1
ibidi sticky-slide	Ibidi	81128	Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide	Ibidi	80168	Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides	Ibidi	10812
Elbow Luer Connectors	Ibidi	10802
silicone tubing	Ibidi	108401
Luer Lock Connector	Ibidi	10826
programmable syringe pump	World Precision Instruments	AL-1000
Vacuum grease	Sigma	18405
Murashige and Skoog Basal Salts	Duchefa	M0221
Agar plant, 1 kg	Melford	P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick	Fisher Scientific	12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm	Fisher Scientific	12363138
Luer-slip Syringe 20 mL	Fisher Scientific	10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape	Fisher Scientific	12787597
Potassium Hydroxide, 500 g	Sigma Aldrich	221473-500G-D
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel	Scientific Laboratory Supplies	INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel	Fisher Scientific	12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6	Ibidi	10829
Leica SP8			Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780			Confocal laser microscope 2
Imaris	Bitplane		3D visualization and Analysis software
Fiji			image analysis software
OriginPro	Origin Lab		Statistical Analysis Software