Çoğullama ultrason stimülasyon floresans mikroskobu ile odaklı

Özet

Düşük yoğunluklu Geniş puls ultrason stimülasyon (LIPUS) yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile endojen veya mühendislik hücrelerinin non-invaziv mekanik uyarılması için bir yöntemi var. Bu makalede nasıl bir epi-floresan mikroskop LIPUS uygulanacağı ve akustik empedans uyuşmazlığı istenmeyen mekanik eserler önlemek için ultrason yol boyunca en aza indirmek nasıl açıklanır.

Özet

Yumuşak dokulara nüfuz düşük yoğunluktaki ultrason darbeleri odaklanarak, LIPUS sinir ateş, hormon salgılanması ve genetik olarak yeniden programlanan hücreleri uzaktan ve güvenli bir şekilde işlemek için umut verici bir biyomedikal teknoloji temsil eder. Ancak, bu teknoloji tıbbi uygulamalar için çeviri şu anda tarafından hangi biyofiziksel mekanizmaları eksikliği doku anlamda hedef ve LIPUS için yanıt engel oluyor. Bu mekanizmalar tanımlamak için uygun bir yaklaşım sinyal yolları temel belirlemek için LIPUS ile birlikte optik biyosensörler kullanmak olacaktır. Ancak, LIPUS floresan mikroskop için uygulama yansıtmak, emer ve akustik dalgalar yetisiyle fiziksel arabirimleri varlığı nedeniyle istenmeyen mekanik eserler tanıştırayım. Bu makale LIPUS için piyasada bulunan dik epi-floresan mikroskoplar akustik yol boyunca fiziksel arabirimleri etkisini en aza indirerek dahil etmek için adım adım bir yordam sunar. Basit bir yordam bir tek öğeli Ultrason çevirici çalışmasına ve dönüştürücü odak bölge objektif odak noktası getirmek için tasvir edilmiştir. LIPUS kullanımı ile LIPUS kaynaklı kalsiyum geçişler kalsiyum Imaging'i kullanma ölçülen kültürlü insan glioblastoma hücrelerdeki örneği gösterilmektedir.

Giriş

Birçok hastalığın bazı formu invaziv tıbbi müdahale gerektirir. Bu yordamları çoğu kez pahalı, riskli, kurtarma dönemleri gerektirir ve böylece bir yük sağlık sistemleri için ekleyin. Non-invaziv tedavi yöntemleri konvansiyonel cerrahi işlemler daha güvenli ve daha ucuz alternatifler sunmak potansiyeline sahip. Ancak, farmakoterapi veya Transkraniyal Manyetik stimülasyon gibi güncel non-invaziv yaklaşımları kez ticaret-off doku penetrasyon, kronolojik zamanmekansal çözünürlük ve istenmeyen hedef kapalı etkileri arasında tarafından sınırlıdır. Bu bağlamda, biyolojik fonksiyonları işlemek için potansiyeli olan umut verici bir non-invaziv teknoloji odaklı bir ultrason teşkil derin dokularda yüksek kronolojik zamanmekansal doğruluk ve sınırlı hedef kapalı etkileri içinde.

Odaklı ultrason stimülasyon oluşur hassas yerlerde akustik enerji sunma Derinlerde yaşayan organizmalar. Akustik darbe parametreleri bağlı olarak, bu enerji çeşitli tıbbi kullanımlar olabilir. Örneğin, gıda ve İlaç İdaresi onaylanmış yoğun odaklı ultrason (HIFU) kullanımı için prostat tümörleri, tremor neden olan beyin bölgeleri, uterin fibroids ve kemik metastazı^{1 ağrı neden sinir uçlarının termal ablasyon} . HIFU aracılı difüzörü kavitasyon de geçici kan - beyin bariyerini sistemik tarafından idare edilen tedavi²hedeflenen teslim etmek için açmak için kullanılır. Kayma en yüksek Nabız-ortalama yoğunluğu (ben_sppa) ve kayma en yüksek ortalama zamansal yoğunluk (ben_spta) uygulamalar genellikle birkaç kW cm^-2 ve nabız basıncı MPa birkaç onlarca üretmek HIFU için kullanılan. Bu yoğunluk değerleri çoğu uzakta FDA onaylı ben_sppa ve_spta sınırları tanılama ultrason, 190 W cm^-2 ve 720 mW cm^-2, sırasıyla³. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda içinde veya yakınında tanılama ultrason yoğunluğu sınırları (LIPUS) dizi etkili ve güvenli bir şekilde uzaktan nöral işlemek için^{4ateş vardır o tahribatsız pulsed ultrason stimülasyon göstermiştir, 5,6,7,8}, hormon salgılanması^9,10 ve Biyomühendislik hücreleri¹¹. Henüz, hangi hücreleri hissediyorum ve ultrason için yanıt hücresel ve moleküler mekanizmaları belirsiz, klinik LIPUS tercümesi iyileştirmelerden kalır. Dolayısıyla, son birkaç yıl içinde Yapay membran, kültürlü hücreleri ve hayvanlar ultrason ile uyarılan biyofiziksel ortaya çıkarmak için bir ivme kazanmış ve fizyolojik süreçleri LIPUS^12,13tarafından^{modülasyonlu, 14,15}.

Fiziksel bir medya yayılıyor bir titreşim ses oluşur. Ultrason ile bir frekans insan sesli aralığı (Yani, yukarıda 20 kHz) yukarıda bir sesi. Bir laboratuvar ortamda ultrason dalgaları genellikle belirli bir yüksek frekans bant içinde salınan bir elektrik alanı cevaben titreşir bir materyal içeren piezoelektrik güç çeviriciler tarafından üretilmektedir. Güç çeviriciler iki türü bulunmaktadır: tek öğe dönüştürücüler ve dönüştürücü diziler. Tek öğe piezoelektrik güç çeviriciler odaklama bir objektif olarak geçecek olan ve, bu nedenle akustik enerji odak bölgesi adı verilen tanımlanmış bir bölgeye yoğunlaşmaktadır bir eğri yüzey sahip. Tek öğe güç çeviriciler çok daha ucuz ve daha kolay dönüştürücü diziler çalıştırmak. Bu madde tek öğe dönüştürücü üzerinde durulacak.

Bir odaklanan tek öğe çevirici odak bölgenin boyutunu akustik mercek geometrik özellikleri ve akustik frekansını bağlıdır. Bir milimetre boyutunda odak bölge bir tek öğe çevirici ile elde etmek için ultrason frekansları MHz aralığında genellikle gereklidir. Ne yazık ki, bu tür frekansta akustik dalgalar çok hızlı bir şekilde ne zaman hava gibi ince bir ortamda yayılır zayıflatılmış. Böylece, MHz ultrason dalgaları üretilecek ve su gibi daha yoğun bir malzeme örnek yayılır gerek. Bu LIPUS modalite mikroskop için entegre ilk meydan okuma kabul ettiğiniz anlamına gelir.

Fiziksel arabirimler arasında (ki bir ürün malzeme yoğunluğu ve akustik hız) farklı akustik impedances akustik yol boyunca malzemelerle en aza indirmek için ikinci bir mücadeledir. Bu arabirimler yansıtabilir, olurlar, dağılım ve akustik dalgalar, etkili bir örnek için teslim akustik enerji miktarı ölçmek üzere emerler. Onlar istenmeyen mekanik eserler acabilirsiniz. Örneğin, ileri yayılıyor olanlar ile müdahale backpropagating dalgalar yansımaları üretilen dik akustik uyuşmazlığı empedans arabirimleri oluşturun. Girişime yol boyunca dalgalar her diğer alanlarda düğümleri ve anti-düğümleri, denilen bölgeler alternatif, özetle denilen sabit bölgelerinde, sözde duran dalgalar (Şekil 1) oluşturmayı iptal etmek. Onlar içinde vivoolmayabilir gibi bu deneysel arabirimler içinde vitro ortadan kaldırmak veya kontrol edebilmek deneyci için önemlidir.

Optik gazetecilere floresans ölçüm şeffaf biyolojik örnekler gerçek zamanlı olarak ve hiçbir fiziksel rahatsızlık ile sorguya çekmek için iyi bilinen bir yöntemdir. Bu yaklaşım böylece herhangi bir fiziksel probları sonicated alanında mevcut mekanik eserler tanıtacak olarak LIPUS çalışmaları için idealdir. Bu iletişim kuralı uygulama ve LIPUS çalışması için bir ticari epi-floresan mikroskop açıklanmaktadır.

Protokol

1. artan akustik şeffaf Polyester Film hücrelerdeyse

1. 12 mm delik boyutunu dikey bir basın matkap kullanarak standart 35 mm Kültür çanak alt matkap. Matkap yavaş hareket ve göz koruma giymek. Dış tarafta (Şekil 2) pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için bir bıçak kullanarak çanak alt bağlı plastik parçaları kaldırın.
2. Deniz-grade epoksi veya tutkal yemeğin dış alt yüzeyinde ince bir tabaka uygulayın.
3. Polyester (2.5 µm kalınlık) çanak dış alt yüzeyine karşı bir film yerleştirin ve sıkıca Epoksi/Yapıştırıcı film ve kalın plastik yüzey arasında eşit olarak yayılır emin olmak için tuşuna basın. Yavaşça film ile a düz yüzey (Şekil 2) oluşturmak için parmak santrifüj bir şekilde çekin.
4. Epoksi/tutkal kuruduktan sonra kısaca durulama kuru polyester-alt çanağı ile % 95 etanol ve çanak ve içine yerleştirerek sterilize kapağı güçlü bir 254 nm UV uyarma kaynağı altında yüzey. Süresi ve yoğunluğu yaklaşık 330 mJ cm^-2 en tip-in mikro-organizmaların tam imha için bir UV doz teslim etmek için ayarlayın. Bu enerji yaklaşık 5 dk 1000 µW cm^-2 UV aydınlatma kullanarak bir süreye karşılık gelir.
5. Aliquot ticari olarak mevcut hücre dışı matriks protein karışımları (EMPM) küçük tüpler (50-100 µL) ve store veya daha az steril koşullarda-20 ° C'de onları.
6. Steril bir ortamda (Örneğin, bir Biyogüvenlik kabini içine), EMPM donmuş bir hisse senedi ile istenen bir kültür orta ve 1: 100 oranında seyreltin. Buz EMPM polimerizasyon oda sıcaklığında önlemek için çalışın. Hızla 100 µL üzerine polyester film orta karışımı uygulamak. Kısırlık korumak için kapağını geri yemek yer.
7. EMPM kaplamalı polyester alt yemekleri 37 ° C'de kuluçka hücre kültür CO₂ 6-12 h için kuluçkaya.
8. Kuluçka sonra aşırı orta Aspire edin ve doğrudan istenen yoğunluğu hücreleri ile yüzey temel olarak belirler. Kısırlık korumak için steril koşullar altında çalışır.

2. LIPUS uygulama

1. Amacı, büyük çalışma hacmi ve aydınlatma donanımı olmayan dik bir mikroskop altında bir su deposu iletim yoluna koyun.
2. Piyasada bulunan mikroskoplar bileşenleri'ni kullanarak, amacı aşağıda bir örnek sahibi ve bir dönüştürücü sahibi örnek sahibi altına yerleştirin. Sonraki örnek hizalama için arama ve ultrason, bu iki sahipleri çeviri etaplar bağlayın.
   1. Hareketli parçaları ve aktüatörler Çeviri aşamaları tank dışında veya su su zarar görmemesi için satırın üstüne yerleştirin. Sadece anodize alüminyum ve paslanmaz çelik gibi aşındırıcı malzemeler dalmış mikroskoplar bileşenlerinin kullanın.
3. Tank daldırma dönüştürücü kullanarak daha önce deiyonize ve degassed su ile doldurun. Su hattı örnek sahibi (Şekil 3) yatay düzlemde ile aynı hizaya gelmelidir.
   Not: Deiyonize su elektrik kaplin yüksek elektrik alanları huzurunda önler. Gaz giderme Ayrıca saçılma ve akustik dalgalar değişikliklere önleyecektir. Su hattı dönüştürücü konum altında düşüyor bir pompa veya Vana kullanarak her deneme sonra su tahliye. Ayrıca, değiştirmek veya sık sık su filtre ve temizleme su deposu mikroorganizmaların gelişimini önlemek için gerektiği gibi.

3. eğik akustik uyarma

1. Piyasada bulunan mikroskoplar bileşenleri'ni kullanarak, dönüştürücü bir eğik pozisyonda optik yol ile ilgili gelecek şekilde yönlendirin. Bu herhangi dalgalar-ecek var olmak matuf (Şekil 3 ve Şekil 4) örnek uzak yansıyan sağlayacaktır.

4. sürüş dönüştürücü

Not: Ultrason güç çeviriciler salınan elektrik enerjisini mekanik genişleme/daralma bir piezoelektrik malzeme dönüştürmek. Bu dönüşüm enerji kaybı ısı enerjisi şeklinde üretir. Güç çeviriciler en yüksek giriş voltajı sınırı sahip iken, bu nedenle, onlar da piezoelektrik öğesine termal zarar görmemesi için bir elektrik güç sınırı sahip:

zaman elektrik simülasyon, P elektrik gücü (Watt) içinde göreli kısmını ile görev döngüsü V_rms alternatif gerilim kaynağı ve Z elektrik giriş ortalama kare kökü gerilimi (Volt içinde) Empedans (ohm içinde).

V,_s dönüştürücü için uygulanan en yüksek tepe giriş voltajı.

1. İstenen frekansı, nabız, devir sayısı içeren bir sinüs dalga formu oluşturmak ve darbe tekrarlama frekansı bir ticari fonksiyon jeneratör kullanarak. Ancak, etkili bir şekilde standart ultrason güç çeviriciler kez sürücü için gerekli nispeten yüksek Vpp işlev üreteci (Yani, artış V_sgenliği) çıkışını yükseltmek için güç amplifikatörü eklenmesi gerektirir.
   Not: belirli bir çevirici 35 dir. Örneğin, bir çevirici'nın üretici güç sınırını belirtir W. Sinüsoidal tepe-için-pik gerilimi (V_içinde) 500 giriş mV adlı bir görev döngüsü % 50 ve 50 dB ile güçlendirilmiş/100 W amplifikatör bu dönüştürücü güç sınırı içinde?
   1. Bu soruyu cevaplamak için amplifikasyon sonra gerilim hesaplayın. Radyo frekanslı (RF) güç amplifikatörü için büyütme faktörü (dB) tarafından tanımlanır:
      
      Böylece, güçlendirilmiş gerilim genlik çıkış V_s vardır (V_s V_dışarı=) in:
      Denklemler 1 ve 2 kullanarak ve 50 Ω Elektrik empedans kullanarak, bu gerilim tarafından oluşturulan karşılık gelen güçtür:
      
      Bu stimülasyon bu nedenle dönüştürücü güç sınırı içinde.
   2. Yukarıdaki örnekte kullanarak, dönüştürücü'nın üreticisi tarafından sağlanan güç ve gerilim sınırları karşılık gelen dalga formu parametreleri (Vpp, frekans, darbe süresi ve darbe tekrarlama frekansı) hesaplama. Dönüştürücü ve bağlı diğer enstrümanlar zarar görmesini önlemek için bu sınırları saygı emin olun.
2. Ultrason dönüştürücü ile uyumlu bir frekans aralığındaki çalışır bir işlev üreteci seçin. İşlev üreteci dönüştürücü nominal en yüksek frekansa frekansını ayarlamak.
3. İstenen süre ve tekrarlama frekansı işlev üreteci çekim modu kullanarak bir sinüsoidal gerilim darbe oluşturun. Tepe tepe gerilim istenen bir değere ayarlayın. Bu darbe süresi iki ardışık darbeleri arasında geçen saat daha kısa olduğundan emin olun.
4. İşlev üreteci çıktısını bir osiloskop girişine bağlanarak istenen sinyalin dalga karşılık gelen onay.
5. İşlev üreteci çıktısını bir RF Amplifikatör (Şekil 4) girifline ba¤lan›r. Stimülasyon parametreleri dönüştürücü'nın üretici sınırları içinde olduğundan emin olun.

5. ışın hizalama

1. Bir frekans aralığı ve akustik yoğunluk frekans ile uyumlu ve ultrason dönüştürücü yoğunluğu ile çalışır bir hidrofon seçin.
2. Dikkatle hidrofon sonda ucu konumundaki örnek (Şekil 4) konumuna karşılık gelen objektif görüş alanı içinde odak haline getirmek.
3. Sonda ve dönüştürücü deiyonize ve degassed suya daldırılır emin olun. Bu onun kaplama alter ve ölçüm etkiler gibi su fiziksel herhangi bir nesne ile hidrofon ucu çarpmamayınasıl.
4. Dönüştürücü bir brüt öncesi hizalamasını görsel olarak akustik ekseni hidrofon sonda doğru konumlandırma tarafından gerçekleştirin. Dönüştürücü'nın yüzeyi ve hidrofon ucu arasındaki mesafe yaklaşık dönüştürücü'nın odak uzaklığı karşılık emin olur.
5. Bir osiloskop'ın sinyal girişi için çıkış hidrofon bağlayın. Eşitleme tetikleyici işlevi jeneratör başka bir osiloskop girişine bağlayın. Osiloskop üzerinde aynı anda her iki sinyali görselleştirin.
6. Dönüştürücü ile birkaç ultrason döngüsü sırasında düşük iş hacmi ve sonda zarar görmesini önlemek için düşük genlik sürücü. Hidrofon'ın üreticisi güvenli kullanım koşulları ile hidrofon ipucu zarar görmesini önlemek için kontrol edin.
7. S/bölümü topuzu hidrofon için dönüştürücü'nın yüzeyinden ultrason seyahat zamana göre ayarlayın. Osiloskop üzerinde hidrofon sinyal Eşitleme tetikleyici sonra arayın.
8. Yavaş yavaş bir motorlu veya el ile XYZ sahne kullanarak dönüştürücü harekete. Dönüştürücü maksimal hidrofon sinyal (Şekil 4) ile ilişkili olan pozisyon içine bırakın.
   Not: sinyal yok mümkün olduğunu tespit edilirse akustik bakliyat yoğunluğu çok düşük olan veya ışın yanlış hizalanan veya bir nesne tarafından dağınık. Düzenli olarak hidrofon ve dönüştürücü görsel olarak önceden hizalanmış ve hiçbir kabarcıklar veya fiziksel nesne yolu polyester film dışında mevcut olduğunu kontrol edin. Sinyal hala algılanırsa, hidrofon sinyal genliği artırmak için küçük bir miktar tarafından giriş voltajı yükseltin.

6. ultrason nabız basıncı ve yoğunluk tayini

1. Hizalanmış ışın ile çeşitli voltaj dönüştürücü sürüş için osiloskop, çıkış hidrofon en yüksek zirve genliğini ölçmek. Hidrofon'ın üretici tarafından önerilen basınç sınırını aşmayacak şekilde emin olun.
2. Bu ölçümler basıncı ve/veya kalibrasyon yöntemiyle hidrofon'ın üreticisi tarafından sağlanan akustik yoğunluk değerleri dönüştürmek.
   Not: Akustik yoğunluk formülü kullanarak baskı ve tersi belirlenebilir:
   
   ben (W m^-2), akustik basınç ile P (Pa), akustik basınç ρ malzeme (1.000 kg m^-3 su için) ve c orta propaganda içinde ses hızı yayma yoğunluğu (su, c = 1500 m s^-1).
3. Bu ölçüler kullanarak kalibrasyon eğriler oluşturmak.
   Not: Basınç vs gerilim ve yoğunluk vs. gerilim eğrileri sırasıyla bir doğrusal ve parabolik şekli var.
4. İstenen bir sürüş gerilim basıncı ve/veya yoğunluk değeri karşılık gelen kalibrasyon eğrisi kullanarak belirleyin.

7. kalsiyum-duyarlı/LIPUS canlı hücre floresans görüntüleme

1. İstenen görüntü arabellek bir hücre permeant kalsiyum duyarlı boya 5 mikron içeren hücre kültür orta yerine (Örneğin, Fluo-4 değilim). Kültür çanak CO₂ kuluçka 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
2. Dikkatli bir şekilde hücreleri aynı tampon boya ücretsiz ile yıkayın.
3. Çanak örnek tutucuya yerleştirin. Mavi ışık aydınlatma kullanarak hücreleri heyecanlandırmak (490 nm) ve aşırı ağartma veya piksel doygunluk kaçınmak için uyarma yoğunluğu ve fotoğraf makinesi pozlama ayarı.
4. Hızlandırılmış görüntüleme istediğiniz görüntü alma ayarlarını kullanarak gerçekleştirin. Bir daldırma amacı istenmeyen yansımalar (bkz. Şekil 4) azaltmak için daha iyi görüntü kalitesi ve uzun çalışma mesafesi ile kullanın.

Sonuçlar

Şekil 5 LIPUS deney ile kalsiyum görüntülemede Multiplexed komutu örneğidir. Glioblastoma hücreleri (A-172) standart Kültür (% 10 serum ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiş) orta EMPM kaplı polyester film üzerinde yetiştirilen ve kalsiyum duyarlı floresan muhabir Fluo-4 ile inkübe AM. Hücreleri bir 10 X daldırma lens ile ve bir beyaz LED ışık kaynağı ile aydınlatılan görüntüsü ve floresan ışık standart GFP filtre kümesi kullanı...

Tartışmalar

Büyük avantajı odaklı ultrason non-invaziv mekanik ve/veya termal enerji yüksek spatio-temporal hassasiyetle biyolojik örnekler sunmak için onun yetenek olduğunu. Mekanik olarak teşvik amacıyla diğer teknikleri genellikle istihdam invaziv fiziksel problar (Örneğin, hücre alay) hücreleri veya yabancı nesneler (Örneğin, Optik cımbız) yüksek enerjili lazer ışınları etkileşim gerektirir. Manyetik Isıtma biyolojik örnekler içinde belirli uzamsal konumları ısı olabilir ama yaba...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
upright microscope with large working volume	Thorlabs	CERNA
upright microscope with large working volume	Scientifica	SliceScope
optomechanical components	Thorlabs	n/a
needle hydrophone	ONDA Corporation	HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier
needle hydrophone	Precision Acoustics	n/a
fiber optic hydrophone	ONDA Corporation	HFO series
fiber optic hydrophone	Precision Acoustics	n/a
oscilloscope	Keysight Technology	DSOX2004A (4-channels 70MHz)
function generator	Keysight Technology	33500B (20MHz single-channel)
RF power amplifier	Electronic Navigation Industries (ENI)	325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA
RF power amplifier	Electronics & Innovation (E&I)
immersion ultrasound transducer	Olympus	focused immersion transdcuers
immersion ultrasound transducer	Benthowave Instrument	HiFu transducer BII-76 series
immersion ultrasound transducer	Precision Acoustics	Piezo-ceramic or HiFu transducers
immersion ultrasound transducer	Ultrasonic-S-lab	HiFu transducers made to order
high-density Matrigel	Corning	VWR 80094-330
Mylar film 2.5 microns	Chemplex	CAT.NO:107