Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Özet

Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.

Özet

Bizim bağışıklık sistemi bir numarası ve bağışıklık hücreleri düzenleyici T hücreleri (Treg) hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli oluşur. Treg hücreler iki alt kümeleri, timik türetilmiş Treg (tTreg) hücreleri ve periferik indüklenen Treg (pTreg) hücre bölünmüş olabilir. Vücudumuzun farklı organlarda varsa ve Helios ve Neuropilin 1 gibi özel işaretler tarafından seçkin. Bu tTreg hücreler pTreg hücreleri işlevsel olarak daha baskılayıcı bildirilmiştir. Bu nedenle, türdeş olmayan hücre popülasyonlarının soruşturma ne zaman tTreg ve pTreg hücre oranı belirlemek önemlidir. Burada, biz timik bezleri, pankreatik drenaj lenf düğümleri ve dalağı normoglycemic obez olmayan diyabetik farelerin tTreg hücreleri Akış Sitometresi kullanarak pTreg hücrelerden ayırt etmek için toplanan. El ile tek hücre kullanılamaz hale gelen bu organların hazırladık. Fluorochrome Birleşik yüzey CD4, CD8, CD25 ve Neuropilin 1 antikorlar hücreleri leke için kullanılmıştır. Onlar gece buzdolabında tutuldu. Ertesi gün, hücreleri Birleşik fluorochrome hücre içi Foxp3 ve Helios antikorlar ile lekeli. Bu işaretleri Treg hücreler iki alt kümeleri tanımlamak için kullanılmıştır. Bu iletişim kuralı tek fare timus, dalak ve lenf nodu drene pankreas hücrelerden hazırlamak ve sonraki akış sitometrik çözümlemesi için kullanma a sade ama pratik yol gösterir.

Giriş

Düzenleyici T (Treg) hücreleri bağışıklık sistemi homeostazı için kritik öneme sahiptir. Treg hücreler ifade yüzey antijenleri CD4 ve CD25 ve transkripsiyon faktörü forkhead kutusunu P3 (Foxp3)^1,2,3tarafından tanımlanır. Sakaguchi vd. ilk CD25 yapısal T bastırıcı hücrelerde fareler⁴insan Treg hücreler tanımlaması için öncü bir gözlem sağlanan, ifade edilir gösterdi. Treg hücreler mekanizmaları, Apoptozis, sitokin tüketimi ve inhibisyon sitotoksik ifade yoluyla ikna etmek için granzymes salgısı ile cytolysis dahil olmak üzere çeşitli yoluyla baskılayıcı bir yetenek uygulamakla tarafından bağışıklık hoşgörü merkezi bir rol oynamak T-lenfosit antijeni 4⁵. Ayrıca, dönüştürme büyüme faktörü beta (TGF-β), İnterlökin-10 (IL-10) ve IL-35⁵gibi inhibitör sitokinler salgılarlar. Treg hücreler doğal olarak timus bu durumda timik türetilmiş Treg (tTreg) hücreleri atanan elde edilebilir veya periferik indüklenen (pTreg) Treg hücreler durumda denir o onlar periferik organlarda bağlı olmak.

Helios, Ikaros transkripsiyon faktörü ailesinin üyesi olan tTreg hücreler arasında ayrım için bir işaret olduğu bildirildi ve pTreg⁶hücreler. Daha sonra diğer iki grup Neuropilin 1 (Nrp1), semaphorin III reseptör tTreg hücreleri belirli koşullar^7,8altında yüzey avans olarak hizmet verebilir rapor. Yine de, Singh ve ark. Helios bu bağlamda naif fareler⁹daha iyi bir işaret olduğunu göstermiştir.

Treg hücreler kümelerine homeostazı bağışıklık sisteminin bakım ve otoimmünite ve enfeksiyona karşı koruma önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, numaraları ve lenfoid ve sigara-lenfoid doku bu nüfus oranlarını belirlemek önemlidir. Bunu başarmak için bir tek hücre kullanılamaz hale gelen bu organların hazırlamak zorunda. Bir dizi Protokolü açıklanan veya önceki çalışmalarda kullanılır. Esas olarak, otomatik dissociators daha önce yayımlanmış raporları^10,11' kullanılmıştır. Otomatik dissociators kullanmak kullanışlıdır ve zaman tasarrufu, ancak bu pahalı bir işlemdir. Bu nedenle, normoglycemic obez olmayan diyabetik (NOD) fareler ve bu organların izole tek hücreleri tek hücre süspansiyonlar fare timik bezleri, pankreatik drenaj lenf düğümleri (PDLNs) ve dalağı hazırlamak için bir el ile yöntemi kullandık. Bu yöntem bizim önceki çalışmalarda kullanılan ve tek hücre süspansiyon hazırlamak için elle yapılan yöntem otomatik dissociator yöntemi^9,12olarak^,13,14verimli olduğunu bulduk. Ayrıca, biz Akış Sitometresi CD4 oranlarını belirlemek için kullanılan⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg hücreler ve Treg kümelerine hücreleri tTreg ve pTreg hücreleri. TTreg ve pTreg hücreleri Helios ve Nrp1 tTreg hücre için işaretleyici olarak kullanarak ayırt edildi. Böylece, bizim sonuçları tek hücreleri hazırlanması için elle yapılan yöntem verimli çalışır ve hazırlanan tek hücre süspansiyonlar daha fazla Akış Sitometresi kullanarak çalışmaları için kullanılabilir gösterir.

Protokol

Yerel hayvan Etik Komitesi, Uppsala Üniversitesi hayvan deneyleri onaylanmış.

1. hayvanlardan organ hasat

1. Fareler tarafından servikal çıkığı kurban.
2. Timik bezleri yerleştirin ve dalağı 20 mL mercek tüpleri veya 15 mL konik tüpler Hanks´ 5 mL ile dolu dengeli tuz solüsyonu (HBSS). 1.5 mL mikro tüpler RPMI 1640 1 mL ile dolu yer PDLNs. Bütün timus ve dalak ve bütün PDLNs kullanın.
   Not: Organları prosedürü boyunca buzda tutulmalıdır ve araştırmacı timik bağışıklık hücreleri hızlı bir şekilde yüksek sıcaklıklarda düşebilir beri timik doku özellikle işlerken tek hücre süspansiyonlar, hazırlarken hızlı olmaya çalışmalısınız.

2. tek hücre izolasyon timus ve dalak

1. İyice timus ve dalak bağışıklık hücreleri serbest bırakmak için cımbız bir çift ile sıkmak. Kalan timik ve dalak kapsülü atmak.
2. Hücre süspansiyon 15 mL konik tüp ve 4 ° C'de bir Pelet oluşturmak için 5 min için 433 x g , santrifüj aktarın. Süpernatant atmak.
3. Kırmızı kan hücreleri parçalayıcı için hücre süspansiyon 5 mL 0,2 M NH₄Cl resuspend ve 10 dk. ters çevirmek için tüpler baş aşağı yavaşça her 2 dk. eklemek 5 mL HBSS kuluçka sonundaki lizis durdurmak için oda sıcaklığında kuluçkaya.
4. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
5. Hücre Pelet HBSS yaklaşık 5 mL resuspend. Tüpler HBSS ile doldurun.
6. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
7. Hücre Pelet HBSS yaklaşık 5 mL resuspend. Tüpler HBSS ile doldurun.
8. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
9. Hücre Pelet timus için HBSS 5 mL ve dalak için 10 mL resuspend.
10. Transfer 1 mL timik hücre süspansiyon ve dalak hücre süspansiyon 5 ml, 500 µL alt tüpleri hücre süzgeç kapaklar ile yuvarlak. Hücre süspansiyon hücre süzgeç kapaklar için geçerlidir.
    Not: 35 µm naylon mesh cap dahil edilmiştir. Yaklaşık 5-10 milyon hücre her tüpün içinde toplanmıştır.

3. tek hücre izolasyon PDLN

1. Steril 250 µm metal kafes 15 mL konik tüp bir rafa yerleştirin. Mesh RPMI 1 mL ile yıkayın.
2. Lenf düğümleri için metal kafes aktarım ve bir çift cımbız kullanarak ağ eziyet. RPMI 1 mL tüp içine hücreleri temizlemek için metal mesh uygulayın. 3 kez daha yineleyin ve mesh kaldırın.
3. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
4. Hücre Pelet RPMI yaklaşık 5 mL resuspend. Tüpler RPMI ile doldurun.
5. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
6. Hücre Pelet RPMI yaklaşık 5 mL resuspend. Tüpler RPMI ile doldurun.
7. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
8. Hücre Pelet 2 mL RPMI resuspend. Transfer hücre süspansiyon 2 mL 5 ml yuvarlak alt tüpleri hücre süzgeç kapakları. Hücre süspansiyon hücre süzgeç kapaklar için geçerlidir.

4. Akış Sitometresi

1. Hücre süspansiyonlar timus, PDLN ve dalak vasıl 433 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
2. Akış Sitometresi arabellek (FACS arabellek) Boyama 100 µL aşağıdaki yüzey antikor hücrelerle leke: 0,75 µg/100 µL FITC Birleşik CD4 antikor, 0.60 µg/100 µL APC-H7-Birleşik CD8 antikor, 0,30 µg/100 µL PE Birleşik CD25 antikor, 5 µL (1:20) APC Birleşik Nrp1 antikor. Tüpler 40 min için buz üzerinde kuluçkaya.
3. 200 µL FACS arabelleği her tüp için ekleyin. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. Bir kez daha yineleyin.
4. Fix ve hücreleri hücre Pelet 500 µL Permeabilization fiksasyon arabellek (PFB) içinde resuspending tarafından permeabilize.
   Not: PFB fiksasyon/Permeabilization konsantre fiksasyon/Permeabilization seyreltici, 3 parça ile 1 kısım karıştırılarak hazırlanır.
5. Tüpler gecede 4 ° C'de buzdolabında tutun.
   Not: 1 h kuluçka da çalışır.
6. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
7. Hücre Pelet 500 µL Permeabilization yıkama arabellek (PWB), içinde resuspend. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
   Not: PWB Permeabilization sulandrarak hazırlanan tampon (10 x) 1:10 için distile suda.
8. PWB 100 µL aşağıdaki hücre içi antikor hücrelerle leke: 0,30 µg/100 µL PE-Cy7-Birleşik Foxp3 antikor, 4 µL (1:25) PacificBlue Birleşik Helios antikor. Tüpler 1 h için buz üzerinde kuluçkaya.
9. PWB 500 µL her tüp için ekleyin. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
10. Hücre Pelet PWB 500 µL içinde resuspend. 433 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak.
11. Hücre Pelet FACS arabellek 300 µL içinde resuspend.
12. Akış Sitometresi hücrelerdeyse analiz.
13. Tek hücreleri yan dağılım alanı, yükseklik ve genişliği ve ileri dağılım alanı, yükseklik ve genişlik alarak kapı. Bir milyon olayları analiz için çalıştırın.
14. FCS verdiğinizde deneyler ve Akış Sitometresi analyzer yazılımı kullanarak bunları analiz.

Sonuçlar

Nrp1 ve tTreg ve pTreg hücreleri üzerinde Helios ifadesi araştırmak için tek hücreleri timik bezleri, PDLNs ve normoglycemic NOD farelerin dalağı hazırlanan ve onları için akış sitometrik Treg hücre işaretli CD4, CD25, Foxp3, Helios ve Nrp1 lekeli analiz. Sonuçları stratejileri (şekil 1) çoğunluğuna temsilcisi gösterildiği gibi analiz edildi. Helios⁺ hücreler arasında CD4 oranı bulduk⁺CD8^-CD25⁺

Tartışmalar

Bu çalışmada izole timik bezleri, PDLNs ve dalağı NOD farelerin tek hücreleri ve Helios ve CD4 Nrp1 ifadesi soruşturma⁺CD8^-CD25⁺Foxp3⁺ Treg hücreler Akış Sitometresi kullanarak. Bu da çalışmanın, NOD fareler, hangi tip 1 diyabet fare bir modeldir kullanıldı. Bir önceki çalışmada, biz vahşi türü fare suşları CD-1 ve C57BL/6 fareler Helios veya Nrp1 tTreg hücre pTreg hücrelerden ayırt için daha iyi bir işaret olduğunu araştırmak için kullandık. ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOD mice			In-house breading
HBSS	Statens veterinärmedicinska anstalt	991750
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R0883-500ML
NH4Cl	EMD Millipore	1011450500
eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00	Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10x)
eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer	ThermoFisher	00-4222-26
CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience	ThermoFisher	11-0042-85
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience	ThermoFisher	12-0251-83
BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a	BD Biosciences	560182
Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody	R&D Systems	FAB5994A
FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience	ThermoFisher	25-5773-82
Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody	BioLegend	137220
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	CORNING	352235	A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap
Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP	Sarstedt	62.554.002
Micro tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.001
Disposable scintillation vials	WHEATON
Flow cytometry	BD
Flow cytometry analysis software	Inivai Technologies	Flowlogic