JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı adımları, maliyetleri ve ekipman E. colioluşturmak için gerekli ayrıntıları-hücre özleri dayalı ve 4 gün içinde veya daha az vitro protein sentez reaksiyonları uygulamak. Bu platformun geniş uygulamalar için esnek yapısı kullanabilmeniz için biz uyarlanmış ve en iyi duruma getirilmiş reaksiyon koşulları tartışıyorlar.

Özet

Son 50 yılda, boş hücre Protein sentezi (CFPS) tüp bebek hücrelerde transkripsiyon ve çevirim kapasitesi koşum için güçlü bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Hücre canlılığı korumanıza gerek obviating tarafından ve hücresel bariyer ortadan kaldırarak CFPS hızlı prototipleme için geleneksel olarak zorlu proteinlerin biomanufacturing ortaya çıkan uygulamalarda yanı sıra uygulamaları temel olmuştur metabolik Mühendisliği ve fonksiyonel genomik. Bir E. coliuygulamak için bizim yöntemleri-tabanlı CFPS platformu bırakmak bu uygulamaların birçoğu erişmek yeni kullanıcı. Burada, özü zenginleştirilmiş medya, şaşkın şişeler ve akort sonication tabanlı hücre lizis tekrarlanabilir yöntemi kullanılarak hazırlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Uygun reaktif stokları önceden hazırlanmış göz önüne alındığında bu özü sonra protein ifade 900 µg/mL veya daha fazla süper klasör yeşil flüoresan protein (sfGFP) veri analizi, deneysel kurulum sadece 5 h üretebilen için kullanılabilir. Reaktifler elde etme tahmini başlangıç maliyeti 4500 $ $0.021 µg üretilen protein başına veya 0.019 $ µL tepki başına tahmini ücret karşılığında tepkiler binlerce sürdürmek olduğunu. Ayrıca, protein ifade yöntemleri piyasada bulunan sistemlerde reaktif öncesi karışımları, bir kısmını maliyeti duruma getirilmesi nedeniyle görülen tepki kurulum kolaylığı ayna. Geniş uygulamaları için CFPS platform esnek doğası kaldıraç sağlamak için biz bu şekilde ayarlanmış ve kullanılabilir kaynakları ve protein ifadesi sonuçlar bağlı olarak en iyi duruma getirilmiş platformu yönlerini çeşitli belirledik istenen.

Giriş

Boş hücre Protein sentezi (CFPS) protein üretim, fonksiyonel genomik, metabolik Mühendisliği ve son 50 yıl1,2içinde daha fazlası için yeni fırsatlar bir dizi kilidi bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Standart vivo içinde protein ifade platformları için karşılaştırıldığında, CFPS üç önemli avantajlar sağlar: 1) platformu boş hücre doğa olası toksik veya dış hücre3,4 olurdu proteinleri sağlar ,5,6; 2) inactivation genomik DNA'ın ve bir şablon kodlama ilgi gene(s) DNA giriş tüm protein(s) üretimi için tepki ilgi içinde sistemik enerji kanal; ve 3) platformu açık yapısı değiştirin ve gerçek zamanlı7,8kompozisyon ve reaksiyon koşulları izlemek kullanıcı sağlar. Biyolojik sistemleri genişletilmiş kimyaları ve Redoks koşullarına roman proteinleri ve metabolik süreçleri2,9, ayarlama için büyütme tepki bu doğrudan erişimi destekler 10. doğrudan erişim de daha hızlı tasarım-yapı-test11döngüleri için bir tek-pot sisteminde CFPS reaksiyon etkinlik deneyleri ile birleştirmek kullanıcı sağlar. Küçük hacimli damlacıkları CFPS reaksiyonu gerçekleştirmek veya kağıt tabanlı cihazlarda daha fazla destekler yüksek üretilen iş bulma çabaları ve hızlı prototipleme12,13,14,15 kapasite ,16. Bu avantajları ve Tak ve Kullan doğa sisteminin bir sonucu olarak, CFPS gibi solubly hızlı vivo içindeiçinzor olan proteinleri biyoteknoloji uygulamaları çeşitli benzersiz olarak sağladı17, 18,19,20, hastalık21,22,23, isteğe bağlı biomanufacturing18,24 tespiti ,25,26,27ve göstermek tüm-in hangi esneklik ve yeni boş hücre platformu eğitim28,29,.

CFPS sistemleri hem prokaryotik ve ökaryotik hücre satırlarından ham lysates çeşitli oluşturulur. Bu seçim, sistemdeki farklı seçenekler her biri avantaj ve dezavantajları bağlı olarak faiz uygulanması vardır sağlar. CFPS sistemleri de hazırlık süresi, maliyet ve verimlilik büyük ölçüde değişir. En sık özleri buğday tohumu, tavşan Retikülosit, böcek hücreleri ve Escherichia coli hücreleri, ikinci en uygun maliyetli protein30 en hacimsel verimi üreten ise bugüne varlık ile üretilen hücre kullanılan . Diğer CFPS sistemleri onların doğuştan gelen translasyonel modifikasyon makine için avantajlı olabileceği gibi E. colikullanan uygulamalar ortaya-tabanlı makine site-specifically fosforile oluşturarak boşluğu edebiliyoruz ve glikozile proteinler talep31,32,33,34,35.

CFPS reaksiyonlar ya da toplu iş iş işlemde, sürekli değişimi-boş hücre (CECF) veya sürekli akış boş hücre (CFCF) biçimleri çalıştırabilirsiniz. Kapalı bir sistem olan reaksiyon ömür boyu azalan miktarda Reaktanları ve inhibitör yan reaksiyon birikimi nedeniyle sınırlıdır Toplu biçimidir. CECF ve CFCF yöntemleri tepki ömrünü artırmak ve böylece toplu tepki göre artan hacimsel protein verimleri neden. Bu yeni Reaktanları tepki2ders boyunca sağlanan süre tepki gemiden kaldırılacak protein sentezi yan sağlayarak gerçekleştirilir. CFCF söz konusu olduğunda, faiz protein tepki odasında CECF iken, protein yarı geçirgen membran36,37oluşan reaksiyon odasında faiz kalıntılarının da kaldırılabilir. Bu yöntemler özellikle zor express proteinler faiz38,39,40,41,42yoksul hacimsel verimi üstesinden değerlidir, 43. CECF ve CFCF yaklaşımlar uygulanmasında zorluklar 1) varken Onlar transkripsiyon ve translasyon için sorumlu biyo makinelerin daha verimli kullanılmasını sonucu, toplam maliyeti ve 2 artırır reaktifler özellikle büyük miktarda gerektirir vardır) Onlar daha karmaşık reaksiyon kurulumları ve özel ekipman için toplu iş biçimi44karşılaştırıldığında gerektirir. Yeni olan kullanıcılar için erişilebilirlik sağlamak için iletişim kuralları burada toplu biçimini mililitre ölçek tepki birime artırmak için özel öneriler ile 15 µL tepki hacimleri, odak nitelendirdi.

Burada sunulan yöntemleri sigara-uzmanlar (lisans öğrencisi gibi) temel laboratuvar becerileri ile hücre büyümesini uygulamak, hazırlık ayıklamak ve biçimi tepki Kur bir E. coliiçin toplu etkinleştirmek-tabanlı CFPS sistemi. Bu yaklaşım için piyasada kitleri tepki kiti tabanlı kurulum kolaylığı ödün vermeden uygun maliyetli karşılaştırılır. Ayrıca, bu yaklaşım uygulamaları laboratuvarında ve alan sağlar. CFPS her durumda üstün olmayabilir olarak CFPS uygulamaya karar verirken, yeni kullanıcılar başlangıç yatırım için geleneksel protein ifade sistemlerinin etkinliğini iyice değerlendirmelidir. CFPS yöntem tanımlamak burada doğrudan uygulayan uygulamaları, fonksiyonel genomik, test, alanının yanı sıra vivo içinde ifade için zorlu proteinleri yüksek üretilen iş de dahil olmak üzere çeşitli sağlamak biyosensörler ve sentetik Biyoloji eğitim setleri gibi uygulamalar. Metabolik Mühendisliği gibi ek uygulamalar protein ifade koşulları, hastalık algılama ve ölçek-up kullanarak CECF veya CFCF yöntemlerini hala mümkün ancak deneyim CFPS platformu ile daha fazla tepki değiştirilmesi için gerektirebilir ayarlama koşullar. Bizim yöntemleri hücre lizis sonication, en iyi duruma getirilmiş premiksler45kullanan bir basitleştirilmiş CFPS reaksiyon Kur tarafından takip aracılığıyla nispeten hızlı ve tekrarlanabilir yöntemleri ile zenginleştirilmiş medya ve şaşkın şişe, büyüme birleştirir. Hücresel büyüme yöntemleri biraz içinde bu alan standart haline iken, hücre lizis için yöntemleri büyük ölçüde değişmektedir. Sonication ek olarak, ortak lizis yöntemleri kullanımı bir Fransız basınında, bir homogenizer, boncuk Tokmaklar, veya lizozim ve diğer biyokimyasal ve fiziksel bozulma yöntemleri46,47,48, içerir. 49. bizim yöntemleri kullanarak, yaklaşık 2 mL ham hücre ekstresinin elde edilir hücre 1 L. Hücre özü bu miktarı dört yüz destekleyebilir 15 µL CFPS reaksiyonlar, her üreten ~ 900 µg/mL muhabir sfGFP protein şablon plazmid pJL1-sfGFP. Bu yöntem maliyeti $0.021/µg, üretilen sfGFP ($.019/µL, tepki), işgücü ve ekipman (tamamlayıcı şekil 1) maliyeti hariç. Sıfırdan başlayarak, bu yöntem 4 gün içinde tek bir kişi tarafından uygulanabilir ve CFPS reaksiyonlar (şekil 1) saat içinde tamamlanabilir yineleyin. Ayrıca, protokol birimdeki kullanıcı ihtiyaçlarına uygun reaktif hazırlık daha büyük toplu işlemler için ölçeklenebilir. Önemlisi, sadece temel laboratuvar becerileri gerektirir gibi burada sunulan Protokolü eğitim laboratuvarı sigara-uzmanlar gibi lisans öğrencileri tarafından uygulanabilir. Aşağıda açıklanan işlemler ve beraberindeki video E. coli CFPS platformu için geniş kullanım erişilebilirliğini geliştirmek için özel olarak geliştirilmiştir.

Protokol

1. medya hazırlanması ve hücre büyümesi

  1. Gün 1
    1. Bir gliserol çizgi E. coli BL21*(DE3) hücrelerden bir LB agar tabağa stok ve en az 18 h 37 ° C'de için kuluçkaya
    2. Bir sıvı döngüsü için 121 ° C'de 30 dk 50 mL LB medya ve otoklav çözüm hazırlamak Oda sıcaklığında saklayın.
  2. 2. gün
    1. 750 mL 2 x YTP medya ve 250 mL 0,4 M D-glukoz çözeltisi içinde ek bilgiler açıklandığı şekilde hazırlayın.
    2. 2 x YTP kitle iletişim araçları içine bir autoclaved 2.5 L şaşkın şişesi ve D-glikoz çözüm bir autoclaved 500 mL cam şişe içine dökün. Otoklav sıvı döngüsü 121 ° C'de 30 dk için her iki çözümleri
    3. Hücre büyümesini büyüme oranları aşı üzerine en üst düzeye çıkarmak ertesi gün gerçekleştiriliyorsa steril her iki çözüm de 37 ° C'de depolanan emin olun. Çözümler kadar aşı birleştirmeyin.
      Not: 2 x YTP kitle iletişim araçları için kirlenme son derece eğilimli olsa çözümleri için 1-2 gerekirse, d 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
    4. BL21(DE3) bir gecede kültür LB Medya 50 mL steril döngü ve steril tekniği kirlenmesini önlemek için kullanarak BL21(DE3) bir koloni ile aşı başlatın.
    5. 50 mL BL21*(DE3) LB kültürünün 37 ° C 250 kuluçka sallayarak devir/dakika yerleştirin ve gecede 15-18 h için büyür.
    6. Hazırlamak ve gün için 3 ve 4, dahil olmak üzere gerekli tüm malzemeleri sterilize: iki 1 L santrifüj şişe, 4 x soğuk 50 mL konik tüpler (tartmak ve üç kayıt kitlelerin) ve birçok 1.5 mL microfuge tüpleri.
  3. 3. gün
    1. BL21*(DE3) 50 mL gecede kültür LB içinde sallayarak kuluçka makinesi kaldırmak ve bir 1:10 kullanarak bir Spektrofotometre üzerinde OD600 ölçmek seyreltme LB medya ile. Gecede kültür medya 0.1 başlangıç OD600 için 1 L eklemek gerekli hacmi hesaplamak (örneğin, 4.0 gecede kültür 1 L / 2 = 1:10 seyreltme 0,4 okumak bir OD600 aşılamak ise 25 mL su katılmamış OD600 x YTP G).
    2. Isıtılan 2 x YTP kitle iletişim araçları ve D-glikoz çözümleri ile birlikte 50 mL LB kültürünün 37 ° C kuluçka kaldırın. Steril tekniği kullanarak, dikkatle D-glikoz solüsyonu (şaşkın şişeye kenarlarında kaçınarak) 2 x YTP kitle iletişim araçları dökün.
      Not: D-glikoz ilavesi 2 1 L tarifini tamamlar x YTPG.
    3. Steril tekniği Bakımı, 1 0.1 OD6001 L kültür başlamak için L 2 x YTPG çözüm 50 mL kültürü uygun miktarda aşılamak. Hemen kuluçka 200 devir / dakikada sallayarak 37 ° C inoculated 1 L kültür yerleştirin.
    4. Büyüme ilk saat sonra okuma ilk OD600 almak (gecikme faz tipik alır 1 h). Kültür sulandırmak değil. OD600 0,6 ulaşana kadar yaklaşık olarak her 20-30 dk OD600 ölçümler alarak devam ediyor.
    5. OD600 ulaşan üzerine = 0,6, 1 mL 1 m IPTG ekleyin (1 L kültür son konsantrasyonu = 1 mM) 2 x YTPG kültür.
      Not: 0,6 Ideal indüksiyon OD600 olduğunu; Ancak, bir dizi 0,6-0,8 kabul edilebilir. İndüksiyon IPTG tarafından endojen T7 RNA polimeraz (T7RNAP) için yapımıdır.
    6. 3.0 ulaşıncaya kadar indüksiyon sonra yaklaşık olarak her 20-30 dk OD600 ölçmek.
      Not: Bu süre içinde 4 ° c santrifüj sakin. Soğuk S30 arabellek tamamlayıcı bilgiler detaylı olarak hazırlayın. S30 arabellek önceden hazırlanmış, DTT kullanımı güne kadar eklenmez emin.
    7. OD600 3.0 (şekil 2A) ulaştığında, kültür bir buz-su banyosu içinde soğuk bir 1 L santrifüj şişe içine dökün. Bir su dolu 1 L santrifüj şişe eşit ağırlıklı bir denge santrifüj içinde kullanılmak üzere hazırlayın.
      Not: Araç gereç Absorbans değerleri farklı. BL21(DE3) hasat OD600 hassas bir değişken olmasa da, kullanıcı değerlendirmek ve bu değişken sorun giderme bir tedbir olarak optimize önerilir. Daha büyük Spektrofotometreler daha küçük küvet tabanlı Spektrofotometreler göre nispeten düşük OD600 okuma neden olabilir.
    8. 1 L şişe 5000 x g ve hücreleri cips 10 ° C de 10 dakika santrifüj kapasitesi.
    9. Süpernatant ve bu kurumun biyolojik atık yordamlara göre belirleme yapılacağı atmayın yavaş yavaş dökün. Pelet Buza koyun.
    10. Steril bir spatula kullanarak, hücre Pelet santrifüj şişeden raspa ve soğuk 50 mL konik tüp transferi.
    11. Soğuk S30 arabellek 30 mL konik tüp ekleyin ve hücre pelet tarafından tamamen yok parçaları ile resuspended kadar buz öbekler (20-30 s) ve dinlenme süreleri (1 dk) ile vortexing resuspend.
    12. Pelet tam resuspended sonra 5000 x g ve 10 ° C (4 ° C-önceden soğutmalı) adlı başka bir 50 mL konik tüp su ile bir denge ve 10 dk santrifüj olarak kullanabilirsiniz.
      Not: Bu 3 yıkar hücreleri hasat gerekli 1st tamamlar.
    13. Dökmek süpernatant ve bu kurumun biyolojik atık yordamlara göre belirleme yapılacağı atmayın. Pelet 20-25 mL soğuk S30 arabellek ve 5000 x g ve 10 ° C (4 ° C-önceden soğutmalı) 10 dk santrifüj ile resuspend.
      Not: Bu 3 yıkar 2nd tamamlar.
    14. Yine, dökmek süpernatant ve bu kurumun biyolojik atık yordamlara göre belirleme yapılacağı atmayın. Tam olarak 30 mL S30 tampon ve girdap tekrar Pelet resuspend ekleyin.
    15. 3 önceden tartılır, soğuk 50 mL konik boru ve serolojik pipet dolgu steril bir pipet ile aliquot 10 mL resuspended Pelet/S30 arabellek karışımı her 3 Konik tüpler içine kullanarak.
      Not: 3 tüpler içine hücreleri bölme gerekli değildir, ancak bu adım daha küçük hücre peletler sonuçlar (~ 1 g) sonraki adımlarında artan rahatınız için.
    16. Tüm tüpler santrifüj kapasitesi, uygun kullanarak gerektiğinde 5000 g ve 10 ° C (4 ° C-önceden soğutmalı) x 10 min için dengeler.
      Not: Bu son yıkama adım tamamlar.
    17. Dökmek süpernatant ve bu kurumun biyolojik atık yordamlara göre belirleme yapılacağı atmayın. Aşırı S30 arabellek dikkatle konik tüp ve temiz bir mendil ile kap içine silerek kaldırma; Pelet dokunmaktan kaçının.
    18. Tüpler bir analitik dengede coorect ve her tüpün üzerinde son Pelet ağırlığı kaydetmek.
      Not: Protokol bu noktada duraklatılmış. Granül sıvı azot içinde donmuş ve özü hazırlık için ihtiyaç kadar bir yıl kadar-80 ° c için depolanan flaş olabilir.

2. ham hücre özü hazırlık - 4 gün

  1. Özü hazırlık için hücreler her adımı sırasında buz soğuk tutmak. 1 mL 1 g Pelet hücre kütlesi başına soğuk S30 arabellek ekleyin. O dithiothreitol (DTT) S30 arabelleğine 2 mM son bir konsantrasyon için desteklenen sağlamak.
    Not: Bu süre içinde 4 ° c microcentrifuge sakin.
  2. Hücre Pelet öbekler (20-30 s) ve dinlenme süreleri (1 dk) ile vortexing tamamen resuspended kadar buz tarafından resuspend. Resuspension zor ise, granül defrost için 30 dakika buz üzerinde bırakın.
  3. Resuspended hücre 1.4 mL 1.5 mL microfuge tüp içine aktarın.
  4. 1.4 mL resuspended hücre içine bir buz su banyosu bir ölçek içeren bir 1,5 mL tüp yerleştirin. 45 için solüsyon içeren temizleyicide s 59 tarafından takip genlik ile 3 Toplam devir için kapalı s ayarla % 50. Kapatın ve tüpler kapalı dönemlerde karışımı yavaşça tersine çevirin. Toplamda, 800-900 J enerji resuspended hücre (şekil 3A ve 3B) 1.4 mL içeren her 1.5 mL microfuge tüp için teslim.
    Not: Bu adım için sonicator türü duyarlıdır ve modeli kullanılmış ve ekipman bu yordam için listelenen daha farklı ise optimize edilmelidir. İki tamamlayıcı yaklaşımlar ölçek-up bu adımı sırasında hazırlanan özü miktarını için kullanılabilir: 1) birden fazla 1.5 mL microfuge tüpler paralel olarak sonicated ve/veya 2) daha büyük birimleri konik tüplerde sonicated (hücre resuspension tüp başına en fazla 15 mL) , teslim enerji miktarı ölçekleme daha önce açıklandığı gibi 29,45.
  5. Sonication tamamlandıktan hemen sonra 1 m (ilave bir ek 2 mM DTT) DTT 4,5 µL 1.4 mL lysate ekleyin ve karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin. Tüp Buza koyun. Santrifüjü geçmeden önce resuspended hücrelerinin herhangi bir ek tüpler için 2.4 ve 2.5 adımları yineleyin.
  6. Microcentrifuge örnekleri, 18.000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika (şekil 3 c).
  7. Süpernatant yeni 1.5 mL microfuge tüpüne pipette. Pelet rahatsız etmeyin; bazı süpernatant saflık verimi en üst düzeye çıkarmak için çabalarında Pelet bozabilir daha korumak için geride bırakmak tercih edilir.
  8. Süpernatant 250 devir/dakika ve 37 ° C 60 dk için önceki adımdaki tüpler (Bu ikinci tur reaksiyondur) kuluçka sallayarak platformu taping tarafından kuluçkaya.
  9. 10.000 x g ve 10 dk 4 ° C'Microcentrifuge örnekleri.
  10. Ve yeni bir tüp transfer süpernatant Pelet bozmadan çıkarın. Birçok 100 µL aliquots Muhafazası için ekstresinin oluşturun.
    Not: Burada protokol duraklatılmış ve sıvı azot içinde donmuş ve CFPS reaksiyonlar için ihtiyaç kadar bir yıl kadar-80 ° c için depolanan özü flaş olabilir. En az 5 donma-çözülme çevrimleri verimlilik (şekil 4) ayıklamak için zararına geçirmiş.

3. hücre-Alerjik Protein sentezi toplu biçimi tepkiler

  1. Tezcan çözümleri A ve B, DNA şablon, BL21(DE3) Eğer (dondurulmuş) özü, T7RNAP ve moleküler sınıf su bir aliquot.
    Not: CFPS reaksiyon şablonu Ek bilgibulunabilir. Çözümler A ve B tarifleri Tamamlayıcı bilgiler sağlanır ve CFPS için PANOx-SP dayalı enerji sistemi desteklemek çok sayıda reaktifler için belirli konsantrasyonları karşılık gelir. Rolü her reaktif ve kabul edilebilir değişkenlik CFPS destekleyebilir Bu reaktif konsantrasyonlarda kararlı50olmuştur. T7RNAP arıtma Protokolü tamamlayıcı bilgiler51de bulunabilir. Ek T7RNAP Volumetrik verimleri artırabilir ama eğer T7RNAP sırasında hücre büyümesini indüklenen gerekli değildir. Plazmid DNA şablonu (pJL1-sfGFP) ile iki yıkama yıkama tampon bir son işlem DNA-PCR arıtma Kiti (şekil 2B) kullanarak Temizleme tarafından takip seti kullanarak bir maxiprep kit kullanarak hazırlanabilir. Doğrusal DNA şablonları CFPS tepkileri de kullanılabilir.
  2. CFPS reaksiyonlar için gerekli microfuge tüpler gerekli miktarda etiketleyin.
    Not: Tepkileri çeşitli kap boyutlarında yapılabilir, ancak küçük bir gemi hacimsel protein verimleri (şekil 2C) düşürebilir. Aynı boyutu gemi bir reaksiyon yukarı ölçekleme de hacimsel verimi, oksijen Satım, hacim oranı için yüzey alanındaki bir düşüş nedeniyle azalan bir fonksiyonu olarak azaltabilir. Reaksiyon cilt 100 μL yukarıda artan zaman, düz dipli iyi plakaları 31,37,52kullanılması önerilir.
  3. Çözüm A 2.2 µL eklemek için çözüm b, BL21*(DE3) 5 µL 2.1 µL ayıklamak, T7RNAP 0,24 μg (16 μg/mL nihai toplama), 0,24 ng DNA şablonu (16 ng/mL nihai toplama) ve son hacim için 15 µL getirmek için su.
    Not: Girdap çözümleri A ve B reaksiyon Kur sırasında sık sık sedimantasyon bileşenlerinin önlemek ve her tepki her çözüm homojen bir aliquot almasını sağlamak. Vortexing özü önlemek için bunun yerine karıştırmak için tüp ters çevir.
  4. Tüm reaktifler için tepki ekledikten sonra her tüpün yukarı ve aşağı pipetting karıştırmak ya da vortexing tarafından hafifçe son tepki karışımı bir tek 15 µL boncuk alt kısmındaki 1.5 mL microfuge tüp içine birleştirilmiştir sağlarken.
  5. Gecede 4 h için veya 30 ° C sallayarak olmadan her reaksiyon 37 ° C kuluçka makinesi içine yerleştirin.
    Not: Başarılı tepkiler niteliksel görsel olarak bağlı sfGFP ürün CFPS reaksiyon karışımı (şekil 3D) içinde yeşil renkli olarak değerlendirilebilir. İfade ilgi proteinin SDS-sayfa (tamamlayıcı Şekil 2) tarafından onaylanabilir.

4. miktar muhabir protein, [sfGFP]

  1. 0,05 m HEPES, pH 8, 48 µL her miktar (genellikle nüsha tepki tüp başına yapılan) için de gerekli içine yükleyin.
  2. Tepkiler kuluçka kaldırın. Her reaksiyon karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet, sonra tepki 2 µL 0,05 M HEPES, pH 8 48 µL aktarın. Tekrar iyi karıştırın damlalıklı yukarı ve aşağı.
  3. Bir kez tüm tepkiler yüklü ve karışık, 96 iyi plaka yer yerleştirin ve sfGFP bitiş noktası Floresans ölçmek.
    Not: 485 sfGFP floresan miktar için uyarma ve emisyon dalga boylarında olan nm ve 510 nm, anılan sıraya göre.
  4. Önceden oluşturulan bir standart eğri kullanarak, [sfGFP] elde edilen floresan okuma belirlemek.
    Not: ek bilgi (ek şekil 3) sfGFP konsantrasyon floresan yoğunluğu karşı standart bir eğri oluşturmak için yönergeler sağlanmıştır. Kullanıcıların araç duyarlılık değişebilir beri kendi araç için standart bir eğri oluşturmak için gereken.

Sonuçlar

Biz özü sonication tabanlı E. coli sundu dört gün span boyunca her gün üzerine yordam dökümü gösteren şekil 1 ile tamamlanabilir hazırlık protokolü. Her gün çeşitli duraklatma puan ile tamamlanabilir adımlara yumuşaklık, ama biz yürütmek en etkili olduğu için bu iş akışını bulduk. Ayrıca, hücre granül (Adım 1.3.18) ve tam olarak hazırlanan özü (Adım 2.10) en az bir yıl için kullanıcı her bir sonraki saat

Tartışmalar

Boş hücre protein sentezi çeşitli biomanufacturing biyokimyasal sistemleri hızlı prototipleme için değişen uygulamalar için güçlü ve etkinleştirme teknolojisi olarak ortaya çıkmıştır. Uygulamalar genişliğini izlemek, yönetmek ve gerçek zamanlı olarak hücresel makine çoğaltmak için kapasite tarafından desteklenmektedir. Bu platform teknolojisi genişleyen etkisi rağmen geniş adaptasyon kalmıştır yöntemleri uygulanması teknik nüanslar nedeniyle yavaş. Bu çaba ile biz bu teknoloji yeni...

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarlarının veya diğer çatışmaları var bildirin.

Teşekkürler

Yazar Dr Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher ve Tony Turretto teknik destek için Wesley Kao, Layne Williams ve Christopher Hight yararlı tartışmalar için kabul etmek istiyorum. Yazarlar ayrıca Bill ve Linda Frost Fonu, Merkezi biyoteknoloji'nın Chevron biyoteknoloji uygulanan araştırma bağış Grant, Cal Poly araştırma, Scholarly ve yaratıcı faaliyetleri hibe programı (RSCA 2017), uygulamalar için destek fon kabul ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF-1708919). MZL Kaliforniya Devlet Üniversitesi lisansüstü hibe eder. MCJ Ordu Araştırma Office W911NF-16-1-0372 kabul eder, Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-1413563 ve MCB-1716766, Hava Kuvvetleri araştırma laboratuvarı Merkezi mükemmellik Grant FA8650-15-2-5518, savunma tehdit azaltma ajansı hibe HDTRA1-15-10052/P00001, David ve Lucile Packard Vakfı, Camille Dreyfus öğretmen-akademik Program bölümü, enerjisi BER Grant DE-SC0018249, insan sınır bilim programı (RGP0015/2017), DOE Joint genom Enstitüsü ETOP Grant ve Chicago Biyomedikal Konsorsiyumu Chicago toplum güven destek için Searle fon desteği ile.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Luria BrothThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Yeast ExtractFisher Bioreagents1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Potassium Phosphate DibasicSigma-Aldrich60353-250G
Potassium Phosphate MonobasicSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Oxalic AcidSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Molecular Grade WaterSigma-Aldrich7732-18-5
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA7219-100G
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptophanSigma-AldrichT0254-25G
L-PhenylalanineSigma-AldrichP2126-100G
L-IsoleucineSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucineSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteineSigma-AldrichC7352-25G
L-MethionineSigma-AldrichM9625-25G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ArginineSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparagineSigma-AldrichA0884-25G
GlycineSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutamineSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LysineSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-ThreonineSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrosineSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mLFisher Scientific05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mLFisher Scientific05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
Ultrasonic ProcessorQSonicaQ125-230V/50Hz3.175 mm diameter probe
Avanti J-E CentrifugeBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coulter366754
1L Centrifuge TubeBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubatorEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter KitIBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs

Referanslar

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer's disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kimyasay 144bo h cre protein senteziCFPSvitro protein ifadey ksek retilen i protein senteziTX TLsentetik biyolojih cre Alerjik metabolik m hendislikCFME

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır