Üretim, arıtma ve kalite kontrol için virüs tabanlı vektörel çizimler Adeno ilişkili

Özet

Burada, biz üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji, titresi ve adeno ilişkili virüs vektörlerin kalite kontrol toplu işlemleri açıklanmaktadır. Bir vektör hazırlık ile yüksek-titresi elde etmek kullanýcýnýn (≥1 x 10¹³ vektör genleri/mL) ve yüksek saflıkta, vitro veya vivo içinde kullanıma hazır.

Özet

Adeno ilişkili virüs (AAVs) dayalı gen teslim araçlardır gen terapisi uygulamaları da dahil olmak üzere transgenes teslim edilmek üzere merkezi sinir sistemi (MSS), popüler bir seçim. AAV vektörleridir olmayan çoğaltılıyor, güçlü-e doğru bölme ve bölme hücreleri enfekte ve uzun vadeli transgene ifade sağlar. Önemlisi, bazı serotipleri, yeni açıklanan PHP gibi. B, kan-beyin-bariyer (BBB) hayvan modellerinde çapraz olabilir sistemik teslim takip. AAV vektörel çizimler verimli laboratuvarda üretilebilir. Ancak, sağlam ve tekrarlanabilir AAV vektörleri ile yeterli saflık düzeyleri ve titresi değerleri vivo içinde uygulamaları için yüksek almak için gerekli iletişim kurallarıdır. Bu iletişim kuralı bir iodixanol degrade arıtma stratejisi dayalı AAV vektör üretim için verimli ve tekrarlanabilir bir strateji açıklar. İodixanol arıtma yöntemi dizi-in yüksek-titresi AAV vektörel çizimler yüksek saflık, diğer arıtma yöntemleri karşılaştırıldığında elde etmek için uygundur. Ayrıca, şu anda açıklanan diğer yöntemlerden daha genellikle daha hızlı iletişim kuralıdır. Buna ek olarak, nicel bir polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR)-tabanlı strateji vektör toplu saflığı belirlemek bir hızlı ve doğru belirlenmesi vektör titresi yanı sıra bir gümüş boyama yöntemi için açıklanmıştır. Son olarak, sistemik yönetim AAV-php takip MSS, gen teslimat temsilcisi sonuçları. B, sunulmaktadır. Bu sonuçlar bu makalede açıklanan protokolleri kullanarak tüm Labs'de mümkün olmalıdır.

Giriş

Son 30 yılda, vahşi tipli AAVs CNS^{1,2,3,4içine gen transferi için son derece yararlı araçlar olduğu kanıtlanmıştır rekombinant AAV vektörler oluşturmak için tasarlanmış, 5,6} ve gen terapisi (FDA ve EMA onaylanmış tedaviler de dahil olmak üzere) hastalığı^4,7' ye yaklaşıyor. MSS kullanımda için Uygunluk Sigara bölen, sonrası Mitotik hücre bulaştırmak, genellikle CNS⁸' bulunan yeteneğini büyük ölçüde türetilmiştir. Ancak, AAV tabanlı vektörel çizimler de diğer viral vektörler⁷'^{göre daha hafif bir immün yanıt alabilme ise uzun vadeli bir ifade herhangi bir verilen terapötik transgene4,9 izin vermenin avantajına sahip, 8,10,11,12}.

Herhangi bir AAV vektör ana unsurları genom ve kapsid vardır. Vahşi tipli AAVs tek iplikçikli (ss) DNA virüsleri ile genom yaklaşık 5 kilobases (kb)¹³. Rekombinant AAV vektörel çizimler üretimi için temsilcisi ile kap gen (genom çoğaltma ve viral kapsid montajı için gerekli) vahşi tipi AAV genom silinir ve içinde transiçin oda bırakarak, sağlanan bir transgene^14,15içeren ifade kaset. Bu çoğaltma ve^3,10,14paketleme için temel olarak ters terminal tekrar dizileri (ITRs) özgün viral genom kopyası yalnızca tutulan bir AAV vektör öğelerdir. AAV vektörel çizimler transgene ifade geliştirmek için tasarlanmış; ITRs biri bir mutasyon etkili tamamlayıcı DNA strand^3,7,15nesil sağlayan bir saç tokası döngü oluşumuna yol açar. İkinci-strand sentez AAVs önemli ölçüde transgene ifadesi ^{düzeyi ve hızını artırarak, geleneksel yaşam döngüsünde tipik gereksinimini atlar bir öz-tamamlayıcı (sc) genom olarak adlandırdığı bu yapılandırma büyük avantajı olduğunu 1}. Bununla birlikte, bir scAAV genom kullanarak vektör kargo kapasitesi yaklaşık 2,4 KB azaltır. Bu transgene dizileri yanı sıra Rehberleri veya mikroRNA bağlayıcı siteleri, ifade belirli hücre türleri¹⁶sınırlamak için gibi herhangi bir düzenleme dizileri içerir.

AAV kapsid vektör-konak hücre etkileşim belirler ve bir ölçüde de transgene ifade belirli konumlara sınırlamak için yararlanılabilir AAV serotip için hücre türü veya doku tropism confers. Diğerleri rekombinant yaklaşımlar (yani, PHP. aracılığıyla laboratuarlarında üretildi, ancak birkaç AAV serotipleri doğada bulunur B). Buna ek olarak, bazı capsids bestow da sistemik yönetim sonra transgenes MSS boyunca teslimini sonuçlanan BBB, çapraz yeteneği gibi diğer yararlı özellikleri. Bu AAV9, yanı sıra son zamanlarda açıklanan PHP için gösterilmiştir. B kapsid¹⁷. Sonuç olarak, bu serotipleri nörodejeneratif hastalıkları^1,17,18için yeni gen terapisi yaklaşımlar için özellikle alakalı olacak şekilde kanıtlamaktadır.

Bu iletişim kuralının amacı AAV vektörler yüksek titresi ve saflık ile küçük ölçekli üretim için uygun maliyetli bir yöntem tarif etmektir. Her ne kadar burada sunulan sonuçlar PHP kullanın. B kapsid ve scAAV ifade kaset, protokol birkaç AAV vektör serotipleri ve genom yapılandırmaları, en fazla deneysel esneklik sağlayan üretimi için uygundur. Ancak, vektör verim ve son saflık seçilen serotip bağlı olarak değişebilir.

Protokolün kendisi klasik tri-transfection yöntem viral vektör üretim için bir türevi ve bir iodixanol degrade kullanım için vektör hangi sezyum klorür (CsCl) degradeler, klasik kullanımı ile karşılaştırıldığında olmuştur temizlik, birleştirmek AAV vektörel çizimler daha zaman verimli bir şekilde^19,20,21daha yüksek saflık üretmek için bildirilen.

Transfection, arıtma ve toplama adımları iyi laboratuar uygulaması (GLP) göre yapılması için viral vektör çalışma için dekor doku kültürü Laboratuvarında yöneliktir. Her görev viral vektör üretim ile ilgili ilgili yerel ve ulusal mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmesi ve kullanmak gerekiyor. Laminar akış başlık altında ve steril koşullarda çalışma yapılmalıdır. Vektör tesis içinde ek olarak normal doku kültürü laboratuar önlüğünü bir laboratuar önlüğü giymek tavsiye edilir. Ayrıca, Çift kişilik bir çift eldiven yanı sıra plastik bütünleşik, her zaman giyilmelidir.

Önce vektör üretim başlangıç sağlamak tüm gerekli ekipman ve plazmid bulunmaktadır. 1) pCapsid plazmid çoğaltma için yani Rep78, Rep68, Rep52 ve Rep40, gerekli dört yapısal olmayan protein kodlayan temsilcisi gen ve üç yapısal kapsid protein, yani VP1, VP2 ve VP3 kodlayan kap gen içerir. 2) pHelper plazmid kolaylaştırmak AAV üretim HEK293T hücrelerdeki genler E4, E2Ave VA adenovirus, üzerinden içerir. 3) pTransgene plazmid tarafından iki ITRs çevrili transgene ifade kaset içerir. Bu Plasmid'ler sentezlenmiş de novo dizileri kullanılabilir çevrimiçi²²kullanarak laboratuvar olabilir. De novoyapılan plazmid için özellikle roman transgenes, içeren sıralama, transgene ve ITRs doğru olduğundan emin olmak için gereklidir. Alternatif olarak, hazır plazmid doğrudan online plazmid depoları elde edilebilir. Gerektiğinde, plazmid çoğaltılabilir ve standart kitleri kullanarak üreticinin yönergeleri²³göre saf.

Vektör titresi ve saflık vektör iletim yeteneği olumsuz yönde etkilenebilir. Ek protokolleri üretilen vektör niteliğini değerlendirmek için sağlanır. Son vektörel çizimler CNS hücre işlevi vitro ve in vivo uygulamalarında çalışmaları yararlı olacaktır.

Protokol

Çözüm	Kompozisyon
Hücre kültürü ve transfection
DMEM1	DMEM 1 x
	% 1 FBS (v/v)
	%1 GlutaMAX (v/v)
DMEM10	DMEM 1 x
	% 10 FBS (v/v)
	%1 GlutaMAX (v/v)
150 mM NaCl	4.380 g NaCl
	500 mL Ultrasaf Su
AAV arıtma ve desalting
5 M NaCl	146.1 g NaCl
	500 mL Ultrasaf Su
1 M Tris HCl (pH 8,5)	12.11 g Tris Bankası	DİKKAT
	100 mL Ultrasaf Su
	1 M HCl pH 8,5 için azaltmak için bir Pasteur pipet kullanarak ekleme
Lizis arabellek	5 M NaCl 15 mL
	25 mL 1 M Tris HCL (pH 8,5)	DİKKAT
	500 mL Ultrasaf Su
Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 10	80 gr NaCl
	2 g KCl	DİKKAT
	14.4 g Na2HPO4
	2.4 g KH2PO4
	En çok 1 lt ddsu
1 M MgCl2	20.33 g MgCl2-6 H2O
	100 mL Ultrasaf Su
1 M KCl	7,45 g KCl	DİKKAT
	100 mL Ultrasaf Su
PBS magnezyum-potasyum (PBS-MK) hisse senedi çözüm x 5	10 x PBS 250 mL
	1 M MgCl2 2.5 mL
	6.25 mL 1 M KCl	DİKKAT
	Kadar su 500 mL Ultrapure H2O
% 15 Iodixanol	Optiprep yoğunluğu degrade orta 12,5 mL	DİKKAT
	5 M NaCl 10 mL
	5 10 mL PBS-MK x
	Ultrasaf Su 17.5 mL
% 25 Iodixanol	Optiprep yoğunluğu degrade orta 20.8 mL	DİKKAT
	5 10 mL PBS-MK x
	Ultrasaf Su 19.2 mL
	Fenol kırmızı 100 µL
% 40 Iodixanol	Optiprep yoğunluğu degrade Orta 33,3 mL	DİKKAT
	5 10 mL PBS-MK x
	Ultrasaf Su 6.7 mL
% 60 Iodixanol	Optiprep yoğunluğu degrade orta 50 mL	DİKKAT
	Fenol kırmızı 100 µL	DİKKAT
AAV saflık kontrolü
Tris asetat EDTA (çay) arabellek x 10	44,8 g Tris Bankası	DİKKAT
	11,4 mL buzul asetik asit (17.4M)
	3.7 g EDTA
	En çok 1 L Ultrasaf Su
Özel jel	0.8 g ultrasaf özel
	100 mL 1 x çay arabellek
Jel arabellek	181.7 g Tris Bankası	DİKKAT
	1.5 g SDS	DİKKAT
	8.45 ile 1 M HCl pH ayarlama	DİKKAT
	500 mL Ultrasaf Su
Katot arabellek 10 x	121.14 g Tris Bankası	DİKKAT
	179.2 g Tricine	DİKKAT
	% 1 SDS (w/w)	DİKKAT
	En çok 1 L Ultrasaf Su
Anot arabellek 10 x	242.3 g Tris Bankası	DİKKAT
	En çok 1 L Ultrasaf Su
	8,9 ile 1 M HCl pH ayarlama	DİKKAT
Örnek arabellek 5 x	20 mL için:
	605 mg Tris Bankası	DİKKAT
	4 g SDS	DİKKAT
	10 mg Serva mavi G
	12 g gliserol
	-20 ° C'de depolayın ve pH 6.8 ile 1 M HCl, aliquot için ayarlamak	DİKKAT
Yığın jel	2 tırnaklar için jeller:
	400 µL akrilamid	DİKKAT
	750 µL jel arabellek
	1.85 mL Ultrasaf Su
	4 ΜL TEMED	DİKKAT
	20 µL % 10 APS (v/v)	DİKKAT
	TEMED ve % 10 ekleyin hemen önce jel dökme APS. Her iki kimyasalları kimyasal bir başlık altında kullanın.
Jel çözme	2 tırnaklar için jeller:
	3.32 mL akrilamid	DİKKAT
	3.35 mL jel arabellek
	1.14 mL Ultrasaf Su
	2.12 mL % 50 gliserol
	6 ΜL TEMED	DİKKAT
	50 µL % 10 APS (w/v)	DİKKAT
	TEMED ve % 10 ekleyin hemen önce jel dökme APS. Her iki kimyasalları kimyasal bir başlık altında kullanın.
Su doymuş butanol	10 mL n-butanol	DİKKAT
	1 mL Ultrasaf Su
Uyarı: Tehlikeli kimyasalların kullanımı hakkında yönergeler için malzemeler tabloya bakın.

Tablo 1: Kompozisyon gerekli çözümleri.

1. HEK293T hücre Tri-transfection

Not: Edilmesi ile arabellekleri ve çözümleri iletişim kuralında kullanılan Tablo 1 ' e bakınız.
Not: Performans iletişim kuralının bu bölümün yaklaşık 4 gün sürer.

1. İnsan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücreleri bir su banyosunda 37 ° C'de ayarla şişe tezcan
   Not: Sadece pasajlı hücreleri daha az 20 x en iyi transfection verimliliği garanti altına almak için kullanın.
2. Tohum HEK293T hücreleri bir yoğunluk 2 x 10³ 6 x 10³ hücreleri/cm² ' e DMEM10 15 cm çapında, kültür yemekleri hücre.
3. 70-%80 izdiham 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO₂set standart bir kuluçka için hücreleri büyümek.
   Not: AAV vektörlerin bu iletişim kuralını kullanan bir toplu iş üretimi 18 hücre kültür yemekleri (15 cm çapında) gerektirir. Bir hücre izdiham %70 - %80 6 x 10³ 17 – 20 mL DMEM10 kültür orta tutulan 7 x 10³ hücreleri/cm²' ye karşılık gelir.
4. Polyethylenimine (PEI) hazırlamak / DNA karışımı bir konsantrasyon oranı 1/3.5 (w/w).
   1. DNA mix 18 hücre kültür yemekleri bir 50 mL konik tüp pΔF6, pCapsid, 180 µg ve pTransgene 150 mM NaCl 18 ml 180 µg 360 µg karıştırarak hazırlayın.
   2. DNA mix üç 50 mL konik tüpler (DNA'ın 6 mL konik tüp mix) üzerinden dağıtmak.
   3. Altı yeni 50 mL konik tüp içinde kültür yemekleri PEI 840 µg karıştırılarak hücre PEI karışım hazırlamak (1 µg/µL) 150 mM NaCl 6 ml.
   4. PEI/DNA mix 6 mL (1.4.3 adımda hazırlanan) PEI karışımı ekleyerek damla damla hazırlamak, konik tüpler birini (1.4.2 adımda hazırlanan) DNA karışımı içeren ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
      Not: Kuluçka 20 dk sonra PEI/DNA mix biraz bulanık hale gelecektir.
5. Altı hücre kültür bulaşık kuluçka makinesi dışarı alın ve tamamen her kültür yemeğin laminar akış başlıklı ortamından Aspire edin. Orta prewarmed Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) 5 mL bulaşıkta durulama tarafından izleri.
6. DPBS dağıtım tüm yüzey üzerinde çanak hafifçe eğerek olun.
7. Yavaşça DPBS Aspire edin ve DMEM1 12 mL her yemek için ekleyin.
   Not: Orta yavaş yavaş, çanak arasındaki sınırda yer bir pipet ekleyerek hücreleri ayırma kaçının.
8. PEI/DNA 3 x - 5 x yukarı ve aşağı pipetting karıştırın. Her altı hücre kültür yemekleri dikkatle tüm yüzey üzerinde dağıtmadan bir damla damla moda 2 mL PEI/DNA karışımı ekleyin. Karışımı her yemek için eklendikten sonra bulaşık kuluçka makinesine koyun. Adımları 1.4.3– tekrar 1,8 kalan kültür yemekler için.
9. Transfected hücreleri ile % 95 nem ve %5 37 ° C'de 5 h için kuluçkaya CO_2.
10. DMEM10 bir ek 12 mL her kültür yemek için önceden varolan orta kaldırmadan ekleyin (Toplam orta ses 25 mL =).
11. Transfected hücreleri ile % 95 nem oranı ve % 5 CO₂37 ° C'de 72 h sonrası transfection için kuluçkaya.

Ek Şekil 1: HEK 293T hücre morfolojisi (sağ) görüntüleme floresans tarafından görüntülenmiştir GFP ifadenin teyit ile faz kontrast mikroskobu (solda) tarafından görüntülenmiştir. (A)başarılı transfection HEK293T hücre GFP kodlama pTransgene ile floresan görüntüleme tarafından onaylandı. (B) HEK293T sadece transfection reaktifleri ile tedavi hücreleri yok GFP ifade gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

12. Hasat orta ve hücreleri 72 h sonrası transfection. Bir hücre kazıyıcı dikkatle kültür çanak hücrelerden ayırmak için kullanın. Orta ve buz üzerinde tutulur bir 50 mL konik tüp hücrelerde toplamak.
    Not: İki hücre kültür yemekleri içeriğini tek 50 mL konik tüp içine toplanabilir. Bu adımın sonunda, her biri dokuz tüpler yaklaşık 50 mL orta içerir.
13. 420 x g hızlanma ve yavaşlama maksimuma ayarlayın santrifüj ile 4 ° C'de 10 dakika, konik tüpler santrifüj kapasitesi.
14. Dikkatle her tüp süpernatant atmak. Pipetler malzeme kaybı önlemek için kullanmayın. Bunun yerine, yavaşça süpernatant atık konteyner içine dökün ve buz üzerinde geri hücre granül içeren tüpler yerleştirin.
15. Her hücre Pelet 50 mL konik tüp arabellekte doğrudan lizis 2 ml 5 – 10 x yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Değil girdap yapmak. Üç tüpler birlikte gelen lysates havuz.
    Not: Bu noktada, üç 50 mL konik tüpler, her bir içeren 6 mL resuspended hücre lizis arabelleği olacak.

2. AAV vektör arıtma

Not: Bu iletişim kuralı bölümün performans yaklaşık 1 gün sürer. Aşağıdaki adımları lizis arabellekte resuspended hücreleri içeren üç 50 mL konik tüpler aynı anda gerçekleştirmek (önceki nota bakın).

1. Donma ve resuspended hücreleri 3 çözülme x onları parçalayıcı ve AAV parçacıkları serbest bırakmak için. Kuru buz etanol ile karışık içeren bir kova tüpler yerleştirerek dondurucu adımıysa. Hemen 37 ° C'de ayarla bir su banyosu hücreleri yerleştirerek çözdürme gerçekleştirmek
2. Üçüncü çözülme adımdan sonra 1,167 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
   Not: Hücre artıkları oluşan bir fark Pelet oluşturulacak. Bunlar Pelet dekolmanı hangi son vektör saflığı taviz süpernatant, içine neden olabilir tüpler işlerken, ani hareketler önlemek.
3. 50 mL konik boru temizlemek için supernatants dikkatli bir şekilde aktarmak ve nükleaz 50 U/mL süpernatant son bir konsantrasyon için her tüpün ekleyin.
4. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 50 mL konik tüp her 10 min nükleaz iyice süpernatant ile karıştırılır emin olmak için el ile girdap.
5. Santrifüjü 13,490 x g 4 ° C'de 20 dk için de tarafından süpernatant açıklamak
6. Bir 10 mL şırınga 0,45 µm filtre takmak ve temiz 50 mL konik tüp üstüne yerleştirin. Dikkatli bir şekilde pistonu çıkarın ve süpernatant adım 2.5 ile şırıngaya doldur.
7. Pistonu lysate filtreden zorunlu tutmak için kullanılır. Yeni filtre ve şırınga 2.5. adımda elde süpernatant her tüp için kullanın.
   Not: Elde edilen kesir 'ham lysate' bilinir.
8. Her biri dört ayrı 50 mL konik tüpler, % 15, % 25, % 40 ve % 60 iodixanol kesirler Tablo 1' deki talimatlara göre hazırlayın.
9. İodixanol kesirler aşağıdaki sırasını kullanarak üç ultrasantrifüj tüpler iodixanol degradeler hazırlamak: 8 mL % 15 iodixanol, 5.5 mL % 25 iodixanol, % 40 iodixanol 5 mL ve 4.5 mL % 60 iodixanol.
   Uyarı: Iodixanol göz, cilt ve sindirim ve solunum yolları için tahrişe neden olabilir. İodixanol degradeler işlerken, eldiven ve laminar akış başlık altında çalışır.
   1. 8 mL % 15 iodixanol her ultrasantrifüj tüpüne pipet.
   2. 5.5 mL % 25 iodixanol çözeltisi temiz 50 mL konik tüp (Şekil 1A) pipet.
   3. (Ultrasantrifüj tüp boyun geleneksel dereceli pipetler için çok dar olduğu için) bir sigara mezun Pasteur pipet dikkatle 5.5 mL % 25 iodixanol çözeltisi % 15 iodixanol çözüm (Şekil 1B) altındaki katman için kullanın.
      Not: Bu başarıyla Pasteur pipet sadece yaklaşık 2 mL tutabilir bu yana üç adımda iodixanol ekleyerek elde edilebilir.
   4. % 40 ve % 60 iodixanol çözümleri 2.9.3. adımda açıklandığı gibi ekleyin. Farklı iodixanol arabirimleri katmanlama sırasında rahatsız etmeyin.
      Not: Farklı iodixanol kesirler uygun hazırlanması ( Tablo 1' deki talimatlara bakın) görsel doğrulama iodixanol kesirler eklendi fenol red sayesinde tarafından sağlanmış olur. Her kesir belirli bir yoğunluk olduğundan, düzgün yapılır eğer onlar katmanlama adımı sırasında karışacak değil ( Şekil 1 ckontrol edin).
10. Ham lysate % 15 iodixanol gradyan Pasteur pipet ile üst tabaka. Damla ham lysate ve iodixanol çözüm arasında arayüz rahatsız edici önlemek için devam edin.
11. Menisküs tüp ultrasantrifüj (Şekil 1 c) sırasında oluşturulan çok yüksek kuvvetler altında daraltmak değil emin olmak için tüp boyun tabanının ulaşıncaya kadar ultrasantrifüj tüp lizis arabellek ile doldurun.
12. Uygun kapakları kullanarak ultrasantrifüj tüpler kapatın. Tüm üç ultrasantrifüj tüpler aynı ağırlığa sahip emin olmak için dijital bir ölçek kullanın. Ağırlığı, gerekirse, daha fazla lizis arabellek 'ham lysate' üzerine ekleyerek ayarlayın.
    Not: Ağırlık farkı ultrasantrifüj borular arasında 0.1 g ultracentrifuge güvenli çalışmasını sağlamak için olması gerekir. Ultracentrifuges ekipman potansiyel olarak tehlikeli parçaları ve yalnızca düzgün eğitimli personel tarafından kullanılmalıdır.
13. 1 saat 40 dk 12 ° c, maksimum hız hızlanma ve yavaşlama kullanarak için bir sabit açılı titanyum rotor kullanarak 301,580 x de g, tüpler santrifüj kapasitesi.
14. Dikkatle paslanmaz çelik künt iğne % 40 ve % 60 iodixanol arabirimi ekleyin.
    1. İğne 5 mL şırınga (Şekil 1E) ekleyin.
    2. Yalnızca açık kısmını vektör parçacıkları içeren, Aspire edin.
       Not: Toplanan toplam hacmi yaklaşık 2,5-3 ml'dir. Bu kirlenme arzu olmayan proteinlerin varlığı nedeniyle son vektör toplu iş düzeyini artıracak beri malzeme % 25-40 arabiriminden koleksiyon kaçının.
    3. Toplanan kesir (desalting ve konsantrasyon) işlemek veya gecede 4 ° C'de depolayın

Şekil 1: Kurulum iodixanol degrade ve sonraki vektör toplama için. (A)farklı iodixanol degradeler ultrasantrifüj tüp içine pipetting önce her iodixanol çözüm yeterli bir hacmi pipette ayrı bir konik tüp içine. (B) o zaman kullanın Pasteur bir pipet sırayla her iodixanol çözüm ultrasantrifüj tüp aktarmak için: katmanları bir giderek daha yüksek iodixanol konsantrasyon önceki katmanlar altında tüp alt eklendi. (C) katman ham vektör bir kez degrade üstte lysate hazırlanmıştır. Bu vektör toplama sistemi 'needlestick' yaralanma riski keskin iğne kullanın. (D) A paslanmaz çelik 316-şırınga iğne iodixanol degrade kadar % %40/60 iodixanol arabirimi aracılığıyla eklenir. Parçacıklar % 40 iodixanol aşamasında bulunur ve toplanan (E) vektör. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. desalting ve konsantrasyon AAV vektör

Not: Performans iletişim kuralının bu bölümün yaklaşık 2 saat sürer.

1. Santrifüj filtre filtre membran de 4000 x g5 mL 1 x PBS-MK ve 5 min için santrifüj de ekleyerek prerinse.
2. 1 x 5 mL ekleyin PBS-MK için toplanan AAV vektör kesir, mix ve toplam hacim için filtre ekleyin. 1 x eklenmesi üzerine PBS-MK, bulanıklık gözlenen. Santrifüj 4.000 x g koni şeklinde filtre mevcut birim kadar 1 mL düşürülmüştür. Akışını dış toplama tüp içinde birikmiş aracılığıyla atın.
3. Gerekli (en az 3 x) birçok kez PBS-MK koni şeklinde filtre ve tekrar Santrifüjü için adım 1 x 13 mL ekleyin, oraya kadar ne zaman yok daha fazla bulanıklık görülmektedir taze 1 x PBS-MK eklenir.
4. Final adım yıka, birimin 300-350 µL azalır kadar PBS + % 0,01 (v/v) iyonik olmayan yüzey aktif ve santrifüj 13 mL'de 4000 x g ekleyin.
5. Kalan kesir mevcut steril etekli microcentrifuge tüp içine bütün birimin pipetting tarafından filtre toplamak.
   Not: Bu kesir desalted ve konsantre AAV vektör içerir. Bu iletişim kuralı aşağıdaki adımlarda, bu kesir 'birincil' kesir olarak adlandırılır. Başlık altında tüp işlemek ve 4 ° C'de depolamak emin olun
6. 1 200 µL filtresiyle durulama filtrenin üzerinde muhafaza kalan vektör parçacıkları toplamak için PBS-MK x. Steril microcentrifuge tüpte toplamak.
   Not: Bu alt vektör titreleri gerektiren bazı uygulamalar için uygun olabilir bir seyreltilmiş vektör hisse senedi var. Sonraki adımda, bu kesir 'ikincil' kesir olarak adlandırılır.
7. Kısa süreli depolama için vektör fraction(s) 4 ° c (az 2 hafta) depolar. Aliquot ve mağaza ‑20 ° uzun süreli depolama gerekli olduğunda C vektör.
8. Kalite kontrol 4 bölümde açıklandığı gibi gerçekleştirin.

4. titrasyon nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından vektör

Not: Performans iletişim kuralının bu bölümün yaklaşık 3 saat sürer.

1. Standart eğri
   1. 1 kısmında HEK-293T hücrelerinin transfection için kullanılan transgene ifade plazmid (pTransgene) linearize.
   2. 0.5 mL microcentrifuge tüp kısıtlama Özet karışımda hazırlamak (kısıtlama Özet mix kompozisyon için Tablo 2 ' ye bakın).
      Not: Kısıtlama Özet karışımı kullanılan enzim ve üretici ilgili yönergelere göre bileşimi ayarlayın.
   3. 37 ° C'de 1 h için kısıtlama Özet karışımı kuluçkaya
   4. Kontrol Doğrusallaştırılmış plazmid % 0.8 (w/v) özel jel 100 V plazmid 1 h. tam sindirim için çalışan tarafından kısıtlama sindirim verimliliğini tanımlanan boyutu tek bir parçası üretmek gerekir.
   5. Doğrusal plazmid DNA PCR arıtma seti kullanarak üreticinin yönergeleri²⁴, takip arındırmak ve emme 260 ölçerek Spektrofotometre ile DNA toplama ölçmek nm. Titrasyon sonra ‑20 ° C daha fazla kullanmak için doğrusal plazmid kalan aliquot saklayın.
   6. Microliter başına plazmid stokunun molekülleri (yani DNA kopya) aşağıdaki gibi hesaplar.
      1. İlk olarak, plazmid molekül ağırlığı hesaplayın. Bir DNA baz çifti (bp) Ortalama ağırlığı 650 Dalton (Da) ve o bir köstebek bir BP 650 g ağırlığında varsayılarak, herhangi bir çift iplikçikli DNA şablon molekül ağırlığı ürün uzunluğu (bp) ve baz çifti başına ağırlık alarak tahmin edilebilir.
         Plazmid moleküler ağırlık [g/mol] = plazmid boyutu [bp] x 650 [Da/bp]
      2. Daha sonra microliter başı plazmid mol sayısını hesaplayın.
         Plazmid microliter başına Moles plazmid konsantrasyon [g/µL] = / plazmid moleküler ağırlık [g/mol]
         Not: Moleküler Ağırlık plazmid 1 gram malzeme mevcut mol sayısı tersidir.
      3. O zaman, plazmid molekülleri microliter, Avogadro sayısı (6.022 x 10²³ molekülleri/köstebek) kullanarak başına sayısını hesaplayın.
         Plazmid microliter başına moleküllerinin microliter [mol/µL] x Avogadro sayısı [molekülleri/mol] başına plazmid mol =
      4. Son olarak, 1 x 10⁹ moleküllerin (vektör genleri (vg) microliter başına) istenen konsantrasyon ile 100 µL çözüm elde etmek için plazmid stok (molekülleri/µL) oranında seyreltin.
         Plazmid stok (100 µL) (istenen konsantrasyon [molekülleri/µL] x 100 µL) = / plazmid molekülleri [molekülleri/µL]
   7. Plazmid stokunun (1 x 10⁹ vg/µL) seri halinde dilutions triplicates içinde olun:
      1 x 10⁹ vg/µL plazmid stok + H₂O 90 µL 10 µL 1 x 10⁸ vg/µL çözüm =
      1 x 10⁸ vg/µL seyreltme + H₂O 90 µL 10 µL 1 x 10⁷ vg/µL çözüm =
      1 x 10⁷ vg/µL seyreltme + H₂O 90 µL 10 µL 1 x 10⁶ vg/µL çözüm =
      1 x 10⁶ vg/µL seyreltme + H₂O 90 µL 10 µL 1 x 10⁵ vg/µL çözüm =
      1 x 10¹ vg/µL çözüm elde etmek devam edin.
   8. Buz üzerinde standart plazmid stokunun seri dilutions qPCR plaka (Bölüm 4.3) yükleme kadar tutun.

Bileşen	Tutar
Restriksiyon enzimi arabellek x 10	5 ΜL
Restriksiyon enzimi	2,5 ΜL
Plazmid	5 µg
H2O	en fazla 50 µL

Tablo 2: Kısıtlama Özet mix kompozisyon.

Tablo 3: hisse senedi plazmid birim hesap makinesi. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.

2. DNA ekstraksiyon AAV vektöründen
   1. Mix 2 µL AAV, hisse senedi (birincil kesir adım 3.5) vektör DNaz 198 µL ile tampon (1 x) şerit tüplerde (PCR tüpleri) ve 2 µL DNaz ekleyin ben.
      Not: DNaz (hangi qPCR sonuçları deforme) bir vektör kapsid içinde bulunmayan herhangi bir genetik materyal düşer. Bu çözüm seyreltme 'dil1 x 10^-2' adlandırılır.
   2. 95 ° C'de 10 dk ardından 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
      Not: Protokol bu noktada durdurulabilir ve malzeme süresiz olarak 4 ° C'de ürün bozulma önlemek için saklanabilir.
   3. İndinavir K 2 µL dil1 x 10^-2 (adım 4.2.1) ekleyin ve 95 ° C'de 20 dk ardından 50 ° C'de 60 dk için kuluçkaya
      Not: Bu adımı AAV vektör kapsid sökmeye ve AAV vektör genom çözüm içine bırakın. Protein (kapsid) örnek içerik değil bilinen İndinavir K fazla ekleyin. Dikkat, tüm İndinavir K etkinliğini denatürasyon, qPCR önce tarafından nihai sonucu etkileyen (kısmi) polimeraz bozulması ile sorunları önlemek için kaldırıldığından emin olmak için gereklidir.
   4. 1:10 seri dilutions 1.5 mL microcentrifuge tüpler İndinavir tedavi K dil1 x 10^-2 çözüm (adım 4.2.3) aşağıdaki gibi hazırlayın:
      10 µL dil1 10^-2 x + H₂O 90 µL dil1 x 10^-3 seyreltme =
      10 µL dil1 10^-3 x + H₂O 90 µL x 10^-4dil1seyreltme =
      10 µL of dil1 10^-4 x + H₂O 90 µL dil1 x 10^-5 seyreltme =
   5. Seri dilutions DNA qPCR plaka (Bölüm 4.3) yükleme kadar buz üzerinde vektör elde tutmak.
3. Titrasyon tarafından SYBR yeşil algılama tabanlı qPCR
   1. 1.5 mL microcentrifuge tüp qPCR ana karışımda örnek ve standartları için hazır olun. SYBR yeşil Master Mix, ileri astar (10 µM hisse senedi), ters astar (10 µM hisse senedi) 1 µL ve H₂O tepki 3 µL 1 µL 10 µL kullanın. Tablo 4 protokolünde astar serileri için bkz.
   2. QPCR ana mix yukarı ve aşağı pipette ama değil girdap yapmak.
   3. 4.1 bölümünde hazırlanan standart eğri ya 5 µL veya AAV vektör bölümünde 4.2, her kuyuya çıkarılan DNA qPCR ana Mix 15 µL ekleyin. Sadece qPCR ana mix, bir negatif kontrol olarak içeren üç kuyular bulunmaktadır. Şekil 2 ' ye plaka düzeni için ilgilidir.
   4. Sızdırmazlık bir film ile plaka mühür ve kısaca qPCR plaka 1.500 x g 30, santrifüj kapasitesi 4 ° C'de s
   5. QPCR reaksiyon Tablo 5' te önerilen koşullar kullanarak bir plaka tabanlı gerçek zamanlı PCR güçlendirme ve algılama aracı çalıştırın.

Astar adı	Sıra
İleri astar	5'-CCCACTTGGCAGTACATCAA-3'
Ters astar	5'-GCCAAGTAGGAAAGTCCCAT-3'

Tablo 4: CBA organizatörü karşı tasarlanmış astar dizileri.

Resim 2: qPCR tabanlı vektör titrasyon için plaka düzen. Örnekleri renk kodludur: yeşil standart eğri; = mavi = H₂O denetimi; gri birincil kesir; = turuncu ikincil kesir =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adım	Zaman	Sıcaklık	Döngüleri	Amaç
Ön kuluçka	5 dk	95 ° C	x1	DNA denatürasyon ve polimeraz harekete geçirmek (sıcak başlatma reaksiyon).
Amplifikasyon	10 dk	95 ° C	x1	DNA amplifikasyon. Farklı tavlama sıcaklığı ile alternatif astar kullandıysanız ayarlarını optimize.
	10 s	95 ° C	X40
	40 s	60 ° C
	1 s	72 ° C
Soğutma	10 s	40 ° C	x1	Plaka soğutma. PCR sonu.

Tablo 5: SYBR yeşil tabanlı qPCR titrasyon için termal Bisiklete binme protokolü.

4. AAV vektör titresi belirlemek için veri analizi
   1. Elektronik tablo veri hücreleri (tablo 6A) 4.1 bölümünde standart bir eğri oluşturmak için hazırlanan standart örnek farklı dilutions için elde edilen Ct değerlerle doldurun.
      Not: Standart eğri denklemi gösterilecek (y = ln (x) + b) ile birlikte R² verimliliği (tablo 6B). Bir qPCR % 100'e yakın bir verimlilik ve R² 1.0 (≥ 0,96) yakın olması gerekir.
   2. Elektronik tablo (tablo 6C) karşılık gelen veri hücreleri doldurmak için bir ve b hesaplanan değerleri kullanın.
   3. Elektronik bölümünde 4.2 hazırlanan AAV örnek farklı dilutions için elde edilen Ct değerler ile tamamlayın.
   4. Ortalama AAV vektör titresi vektör genleri microliter 'birincil kesir' in başına içinde aşağıdaki formülü kullanarak hesaplar:
      
      Not: sc genleri bir çarpım çarpanı 200 kullanırken faktör 400 tek telli genleri için kullanılır²⁵. Aslında, DNA miktar her qPCR devresi sırasında çift olarak DNA'sı sc 2 x ile karşılaştırıldığında bir ss genom algıladı. Titrasyon vektör genleri microliter başına açısından konsantrasyon hesaplamak için amaçtır. Bir düzeltme malzeme (adım 4.2.1) başlayan 2 µL kullanırken qPCR çalıştırmak için gereklidir. dil seyreltme faktörler 4.2.4 adımından temsil eder. 'İkincil' AAV vektör kesir (adım 3.6) titresi aynı anda hesaplanır.

Tablo 6: qPCR veri analizi için şablon. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

5. saflık kontrolü SDS-sayfa ve gümüş boyama

Not: Performans iletişim kuralının bu bölümün yaklaşık 5 h alır.

1. % 70 (v/v) etanol jelleri döküm için kullanılan cam plakanın iyice temizlemek için kullanın.
2. Jel döküm sistemi monte. Cam plakanın dipleri, jel çevrim akrilamid karışımı kaçağı önlemek için yontma değil emin olun.
3. İstifleme ve iki ayrı 50 mL konik tüp çözme jel çözümlerinde hazırlamak. Jel polimerizasyon için sorumlu oldukları gibi tetramethylethylenediamine (TEMED) ve % 10 (w/v) amonyum Persülfat (APS), atlayın. Onları hemen jel döküm önce ekleyin.
   Not: Ayrılık profil proteinlerin akrilamid jel içinde son yüzdesini etkiler: genellikle, akrilamid % 10 (v/v) son konsantrasyon AAV vektör hazırlık saflığı test etmek yeterli olacaktır.
4. Tüp jel bileşenleri içeren dönen tarafından karışımı yavaşça. Yapmak değil girdap, ondan beri aşırı oksijenasyonu polimerizasyon zarar verebilir.
5. TEMED ve % 10 (w/v) APS çözme jel çözüme ekleyin. Karıştırın ve 1-2 cm üst kısmındaki küçük cam levha altında ulaşıncaya kadar jel tutucu dökün.
6. Su doymuş butanol akrilamid karışımı üst kısmında bir katman yer. Bu düz bir yüzey oluşumunu polimerizasyon sırasında garanti eder. Bu jel kurutmak ve fonksiyonu zarar gibi jel 30 dk daha uzun süre alkol altında bırakmayın.
   Dikkat: Butanol cilde temas durumunda zararlıdır. Ayrıca yangın riski doğurur. Özenle hallederim.
7. Jel polimerize ve sonra butanol dökmek bekleyin. İpucu: tüp aşırı jel karışımı katılaşmış olup olmadığını denetleyin. Polimerizasyon az 20 dak yüzey yıkama jeli ile H₂O oluşur ve sonra kağıt havlu, jel yüzeyi bozmamaya dikkat çekici kullanarak kuru.
8. TEMED ve % 10 (w/v) APS yığın jel için eklemek ve jel ayıran jel üstünde jel tutucusuna dökün.
9. Yer jel içinde sağlanan tarak. Kuyuları içinde hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için bir sürekli hareketi ile bu eylemi gerçekleştirin.
10. Polimerize jel için en az 20 dakika bekleyin. İpucu: aşırı jel karıştırırsanız konik tüp katılaşmış kontrol edin.
11. Hem birincil hem de ikincil AAV kesirler vektör iki karışımları (Tablo 7) hazırlamak (3.5 ve 3.6, sırasıyla adımlar).

	Yüksek miktarda	Düşük miktar
AAV vektör hisse senedi	5 ΜL	1 ΜL
Örnek arabellek x 5	3 ΜL	3 ΜL
H2O	7 ΜL	11 ΜL

Tablo 7: Bileşimi gümüş boyama için gerekli örnek karıştırır.

12. Tam olarak örnek mixes 95 ° C'de 5 min için Isıtma tarafından denatüre Elektrot yönüne dikkat Elektroforez tankı bir araya getirin.
13. 1 x katot arabellek elektrot derleme iç ve dış anot arabellek x 1 ile tank doldurmak.
    Not: Anot arabellek koş koş geri dönüştürülebilir. Taze katot arabellek her zaman kullanılması gerekir.
14. Jel tarak çıkarın ve 1 x katot arabelleği ile jel kuyu temizleyin.
15. Bir de protein merdivenin 1 µL yükleyin. Örnek mixes aynı jel (Şekil 3) üzerinde farklı Wells yükleyin. Örnekleri çözme jel girinceye kadar jel 50 V çalıştırın. Boya açık jel alt sınıra ulaşana kadar 100 V gerilim artırın.
16. Jel dikkatle cam plakanın ayıklamak ve boyama seti (göre üreticinin yönergeleri²⁶) mümkün için kontrol olarak AAV kapsid oluşturan viral proteinler (VP1, VP2 ve VP3 alt birimleri) görselleştirmek için gümüş kullanın protein kontaminasyonu (Şekil 3).

Şekil 3: SDS-sayfa ve gümüş boyama kullanarak vektör saflık değerlendirilmesi. Tricine-SDS jel kullanarak, çeşitli vektör hazırlıkların 5 µL ayrıldı. Proteinler daha sonra gümüş boyama tarafından tespit edildi. Vektörel çizimler olarak kabul edilir saf ne zaman VP1 (82 kDa), VP2 (67 kDa) ve VP3 (60 kDa) bir 1: 1'de görülebilir: 10 oranı (lane 1), aşırı arka plan (lane 2) veya belirsiz bantları (lane 3) olmadan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Sonuçlar

AAV9 olarak kabul, yakın zamana kadar en etkili AAV vektör serotip BBB geçiş ve çevresel yönetim takip MSS, hücrelerin transducing olmak. Kapsid tasarımında önemli bir ilerleme elde edildi zaman Deverman ve ark. Cre AAV hedefli evrim (Oluştur) rekombinasyon tabanlı¹⁷adlı bir kapsid seçimi Yöntem kullanım rapor etmiştir. Bu yöntemi kullanarak, PHP adında yeni bir kapsid teşhis ettiler. B olarak astrocytes ve birden fazla CNS bölgesi, nöronlarda sistemik enjeksiyon¹⁷takip çoğu transduce güçlü-e doğru rapor ettiler. Bu noktada, olması gerektiği belirtti rağmen PHP. B (ki ilk yalıtım deneylerde kullanılan zorlanma) C57/Bl6 farelerde olumlu sonuçlar sağlar, verimlilik bir zorlanma bağlı şekilde değişebilir ön raporları öneririz. Hiç şüphesiz, daha fazla deneyler bu sorunu³¹daha fazla ışık tutacak.

Ancak, bu sorunları rağmen PHP. B kanıtı-of-concept gen terapisi deneyler hastalık modelleri dahil olmak üzere fare, MSS noninvaziv gen manipülasyon için heyecan verici olanaklar sunmaktadır. Bu nedenle, PHP kullanarak transgene ifade verimliliğini değerlendirmek seçtik. Periferik yönetiminden beri 2009²takip CNS iletim için 'altın standart' vektör olmuştur B karşı AAV9. Transgene ifade için en uygun koşullarda her iki serotipleri doğrudan karşılaştırılması gerçekleştirmek için bir sc genom yapılandırma³²kullanılır. Her iki vektörel çizimler transgene yeşil flüoresan protein (GFP) için her yerde tavuk β-aktin (CBA) düzenleyici denetimi altında yapılır. Kadın C57/Bl6 fareler postnatal gün 42 (yaklaşık 20 g ağırlık), 1 x 10¹² vg fare ya da scAAV2/php başına bir doz aldı. B-CBA-GFP veya scAAV2/9-CBA-GFP. Vektör yönetim kuyruk ven enjeksiyon gerçekleştirilen üzerinden yapıldı. Deneyler KU Leuven Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

Üç hafta postinjection, fareler transcardial perfüzyon %4 (w/v) buz gibi paraformaldehyde (PFA) tarafından takip buz gibi PBS ile uygulandı. Beyinleri hasat edildi ve daha fazla % 0,01 (w/v) Na-azid/PBS için depolama için daha fazla çözümleme kadar aktarmadan önce gecede bir kuluçka aynı sabitleştirici olarak tarafından postfixation uygulandı. Daha sonra beyni bir titreşimli microtome kullanarak kesitli ve immünhistokimya 50 µm kalınlığında kesitler üzerinde gerçekleştirildi.

Transgene ifade düzeyini değerlendirmek için bölümler GFP (tavşan anti-GFP), karşı birincil antikorlar ile floresan bir boya (Anti-tavşan Alexa Fluor 488) Birleşik ikincil antikorları kullanarak algılama ile lekeli (Şekil 4A, B ). Floresan yoğunluğu ölçüm sonuçları (rasgele adet [au]) doğruladı GFP ifade bir sc ne zaman önemli bir artış genom ve PHP. B kapsid AAV9 göreli olarak kullanılmıştır. GFP artışlar cerebrum (2105 ± 161 vs 1441 ± 99 au; gözlendi p 0.0032 =), beyincik (2601 ± 196 vs 1737 ± 135 au; p 0.0032 =) ve beyin sapı (3082 ± 319 vs 2485 ± 88 au; p 0.0038 =) (Şekil 4 c).

Şekil 4: scAAV2/PHP sistemik teslim. B-CBA-GFP MSS yüksek GFP ifadesinde yol açar. scAAV2/PHP. B-CBA-GFP veya scAAV2/9-CBA-GFP (1 x 10¹² vg/fare) 6-hafta-yaşlı C57/Bl6 farelere kuyruk ven enjeksiyon yolu ile yönetiliyordu. GFP immünhistokimya koronal beyin bölümleri 3 hafta postinjection üzerinde kullanarak tespit edildi. (A)cerebrum ve (B) serebellum ve beyin sapı gösterilir. Ölçek çubukları 1 mm göreli floresans yoğunluklarını miktar her vektör (fare başına 10 bölümler; vektör grubu başına üç fare) ile elde GFP sinyal düzeylerini belirlemek için gerçekleştirilen. (C) =. Bir tek yönlü ANOVA testi gerçekleştirilen, iki kuyruklu öğrenci ttarafından takip-test; verileri ortalama ± standart sapma ifade edilir; p < 0,01; au. rasgele birimleri. AAV vektör üretim için kullanılan pCapsid, serotip 2 üzerinden gen temsilcisi ve serotip PHP gen kap içerir. B ya da AAV9, ona göre. Bu rakam Rincon değiştirildi vd.³². Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Rekombinant AAV vektörel çizimler üretimi burada kullandığı malzeme ve ekipman çoğu Moleküler Biyoloji Laboratuvarları ve hücre kültür imkanları için ortak nitelendirdi. Vitro ve in vivo uygulamaları bir dizi birden çok hücre ve doku türü hedeflenecek kullanılan saf, preklinik sınıf AAV vektörel çizimler elde etmek kullanıcı sağlar. Bu iletişim kuralı, (yani, CsCl tabanlı arıtma), diğerlerine göre en büyük avantajlarından biri gerekli kısa çalışma zamanı. Kullanıma hazır AAV elde edilebilecek en fazla HEK293T hücrelerinin ilk transfection 6 işgünü içinde vektörleridir.

Çeşitli faktörler son verim veya AAV vektör kalitesini olumsuz etkileyebilir. Zavallı transfection verimliliği düşük viral verim³³için ana nedenlerinden biri. Önemli bir tavsiye daha--dan 20 kere pasajlı değil ve bir hücre izdiham 90 %'den büyük transfection²¹anda var mı HEK293T hücreleri kullanılır. Ayrıca, seçilen transfection yöntemi sonuçları üzerinde büyük bir etkisi vardır. Bu iletişim kuralı PEI kullanımına dayanır. PEI eksojen DNA hücre çekirdeği kompleksleri polimer ve nükleik asit, hücre ve ticareti yoluyla endosomes³⁴tarafından alınır polyplexes olarak bilinen nesil aracılığıyla teslim alma olanağı katyonik bir polimerdir. PEI tabanlı transfection, kalsiyum fosfat³⁵ile DNA'ın yağış Co gibi diğer yaygın olarak kullanılan yöntemlerin aksine gerçekleştirmek için hızlı ve kolay. Ayrıca, PEI tabanlı transfection katyonik lipidler ve mıknatıs-aracılı transfection³⁶kullanımı gibi yeni tanıtılan diğer yöntemlere göre çok daha ucuz.

Arıtma strateji protokolünde önemli bir rol oynar. Diğer yöntemlerine göre iodixanol tabanlı purifications boş viral parçacıkların (% 20)²⁰daha yüksek bir yüzdesi içeren eğilimindedir. Bu, bir dereceye kadar gerçeği iodixanol tabanlı arıtma rutin AAV vektör hazırlıkları az 100 bir parçacık infektivite oranı ile sonuçları ile dengeleniyor. Bu parçacık infektivite önemli kaybı bildirilen³⁷olduğu geleneksel CsCl tabanlı yordamlara ile karşılaştırıldığında önemli bir gelişme gösterir. AAV vektörel çizimler arındırmak için başka bir ortak alternatif Kromatografi dayalı saflaştırma yöntemidir. Ancak, bu yöntem özel bir sütunda kullanılan her vektör kapsid için gerekli olan önemli dezavantajı vardır: AAV2 heparin sütunları kullanarak klasik izole olmakla birlikte, örneğin, bu yöntemi AAV4 ve AAV5, hangi heparin bağlama sahip olmayan çalışmıyor onların capsids³⁸sitelerinde. Kromatografi arıtma aynı zamanda pahalı olduğunu göz önünde bulundurursak, arıtma iodixanol tabanlı genellikle daha yüksek kaliteli toplu işlemleri AAV vektörlerin tarihinde bir küçük ölçekli^33,39, üretmek istediğiniz laboratuarlar için uygundur ⁴⁰. ancak, son verim ve vektör saflığı en üst düzeye çıkarmak için aşırı kaygı iodixanol degradeler yaparken gereklidir. Çeşitli iodixanol kesirler olan ucu tüp duvarına dokunmadan steril bir Pasteur pipet kullanarak ultrasantrifüj tüp aktarılması gerektiğini: iodixanol ihraç pipet yavaş yavaş ve sürekli olarak. Vektör parçacıklar % 40 iodixanol katmanında biriktikçe, bakım degrade arabirimleri²⁰rmay sağlamak için alınması gerekiyor. Son olarak, vektör içeren kesir bir göstergesi 20 G. değil daha büyük bir paslanmaz çelik künt iğneyle ekleme tarafından kurtarıldı Vektör kurtarma en üst düzeye çıkarmak için açık kesir tam olarak alınması. Bu adım sırasında zamanlama çok önemlidir. Hazırlık saflığı ödün önlemek için koleksiyon (bulaşıcı) diğer aşamalarında geçişin toplanan önce durdurmak için esastır.

Elde edilen vektör titresi farklılıkları da paketlenmiş parçacıklar üretmek için iç yetenek vektör için bağlanabilir. Farklı AAV serotipleri arasında bir karşılaştırma bazı AAV vektörel çizimler (örneğin, AAV2) diğerlerinden daha yüksek bir titresi, üretmek daha zor olduğunu gösterdi⁴¹. Vektör, yağış sırasında desalting adım daha düşük bir titresi olası bir neden olabilir ve kolayca overconcentration³³kaçınarak engelledi. Ayrıca, iodixanol gradyan tabanlı arıtma verimliliğini biraz serotipleri arasında değişir ve bu nedenle, farklı serotipi ile elde edilen titresi tutarsızlıkları⁴¹dikkat edilmesi mümkündür.

Son olarak, bu teknik bazı doğal değişkenlik qPCR DNA miktar için çok doğru bir yöntem olsa bile görülebilir işaret gerekir. Titrasyon doğruluk öncelikle kesin pipetting ve tüm çözümleri uygun vortexing bağlıdır. Okuma en doğru titresi garantilemek için qPCR bağımsız olarak tekrar edilebilir ve elde edilen değerlerin ortalaması. Bu protokol için sunulan astar seçimi bizim Laboratuvarda kullanılan pTransgene plazmid bulunan CBA organizatörü sırasını temel alır. CBA organizatörü birden çok hücre tipleri arasında yaygın sürücü ifade vektör alanında kullanılan güçlü bir sentetik organizatörü var. Sitomegalovirüs (CMV) erken artırıcı öğesi dahil olmak üzere birden çok öğe içermektedir; Düzenleyici, ilk exon ve ilk intron CBA gen; ve tavşan β globin gen splice alıcısı. Ancak, astar (organizatörü, transgene ve düzenleyici elemanlarının dahil) ifade kaset içinde bulunan hemen her öğe için tasarlanabilir. Titresi toplu işlemleri arasında karşılaştırılması da astar bölgeleri vektörel çizimler söz konusu ortak karşı kullanılan sağlamak mümkündür.

Sonuç olarak, bu protokolü AAV vektörleri ile capsids, genom yapılandırmaları, organizatörü türleri ve transgene yükler çeşitli üretmek için kullanılabilir. Bu kullanıcılar en iyi deneysel gereksinimlerinize uyacak şekilde kendi vektörel çizimler son özelliklerini kolayca uyum sağlar. Temsilcisi sonuçları sunulan örnekte PHP kullanımı. Verimli bir şekilde BBB haçlar, B kapsid yüksek verimli gen ekspresyonu MSS, aşağıdaki kuyruk ven enjeksiyon³²verdi. CNS penetrant vektörel çizimler sistemik yönetim olası yan etkileri^2,17,32açısından önemli avantajlar vardır. Periferik enjeksiyon invaziv tekniklerin uyarılar kaçınırken, olası bir alternatif AAV vektör teslimini beyin omurilik sıvısı içine oluşur intratekal teslimat olur. Bu teslim yolu transgene yaygın ifade MSS, periferik organ veya bağışıklık yanıtı⁴²seviyesinin düşük daha az hedef kapalı etkilerini gösteren etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bunlar kuyruk ven enjeksiyon daha yüksek teknik beceri gerektirir gibi çok daha zor, ancak, intratekal enjeksiyonları vardır.

Bu teknolojiyi geliştirmek için daha fazla kapsid geliştirme gen terapisi uygulamalarda AAV vektör kullanmak için fırsatlar tarafından tahrik olacak. Bu tür yaklaşımlar amyotrofik lateral skleroz, Charcot Marie Tooth hastalığı, Parkinson ve Alzheimer hastalığı¹⁸gibi şu anda tedavi edilemez CNS hastalıkları tedavi etmek için çekici olanaklar sunmaktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmid production
pTransgene plasmid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pCapsid	De novo design or obtained from a plasmid repository	N/A	See step 1 of main protocol for further details
pHelper	Agilent	240071
Plasmid Plus maxi kit	Qiagen	12963
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104
AAV Helper-Free System	Agilent	240071
Cell culture and transfection
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine	Life technologies	11960-044	Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 µm filter
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10500-064
GlutaMAX supplement	GIBCO	35050038
(200 mM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS430769
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium	GIBCO	14190094
HEK293T cells	American Tissue Culture Collection	CRL3216	Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots
Cell culture dishes	Greiner Cellstar	639160	15 cm diameter culture dishes
Cell scrapers	VWR	10062-904
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966-2	PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can be freeze/thawed multiple times.
Virkon solution	Fisher Scientific	NC9821357	Disinfect any material that has been in contact with assembled vector particles with Virkon solution
Mutexi long-sleeve aprons	Fisher Scientific	11735423	Wear an apron over the top of a regular lab coat
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes	Fisher Scientific	15401952
AAV Purification and desalting
Optiprep density gradient medium	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290	CAUTION. Use under a laminar flow hood
Pasteur pipette	Sigma-Aldrich	Z627992	Sterilize before use
OptiSeal Polypropylene tubes	Beckman	361625
Benzonase (250 U/µL)	Sigma-Aldrich	E1014	Supplied as a ready-to-use solution
Acrodisc syringe filter	Pall corporation	4614
Omnifix syringe (5 mL)	Braun	4617053V
Blunt syringe needle	Sigma Aldrich	Z261378	Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle
Aqua Ecotainer	B. Braun	0082479E	Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water'
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Millipore	UFC910024	These filters concentrate the final product by collecting the vector particles in consecutive centrifugation steps
Pluronic F68 (100x)	Thermo Fisher	24040032	Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0.01% (v/v)
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL)	Fisher Scientific	02-681-374	Use skirted tubes for easy handling
AAV Titration
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL)	Promega	R6421
DNAse I (1 U/µL)	Fisher Scientific	EN0521
Proteinase K	Sigma-Aldrich	3115852001	Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/mL. Solution can be stored at -20 °C
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps)	Fisher Scientific	AB2000
Eppendorf microtube 3810x	Sigma-Aldrich	Z606340-1000EA
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix	Roche	4707516001
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells	Roche	4729692001	White polypropylene plate (with unique identifying barcode)
Microseal 'A' PCR plate and PCR Plate Sealing Film	Bio-Rad	msa5001
AAV Purity control
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678	Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281	CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Tris Base ULTROL Grade	Merck	648311	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
UltraPure Agarose	Thermo Fisher	16500-500
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1)	Carl Roth	3029.3	Aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Serva Blue G	Sigma-Aldrich	6104-58-1
Precision Plus prestained marker	Bio-Rad	1610374edu
1-Butanol	Sigma-Aldrich	B7906	CAUTION: Use under a laminar flow hood. Wear gloves
Immunohistochemistry
Rabbit anti-GFP	Synaptic Systems	132002	1:300 dilution
Anti-rabbit Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21206	1:1,000 dilution
Equipment	Company	Catalog number	Comments
Vector production lab
Rotina 380 bench-top centrifuge *	Hettich	1701
Optima XPN 80 ultracentrifuge *	Beckmann Coulter	A95765
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor *	Beckmann Coulter	337901
Entris digital scale *	Sartorius	2202-1S
Warm water bath *			Set at 37 °C
Ice bucket *	VWR	10146-290	Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas
Pipetboy pro *	Integra	156,400
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	606180	Capacity of 5 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	607180	Capacity of 10 mL
Graduated pipettes: Cell star *	Greiner bio-one	760180	Capacity of 25 mL
CO2 incubator CB150 *	Binder	9040-0038	Set at 37 °C, 5% CO2 and 95% humidity
Nuaire safety cabinet NU 437-400E *	Labexchange	31324	Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use
Conventional lab
T100 thermal cycler *	Bio-Rad	1861096
LightCycler 480 Instrument II *	Roche	5015278001
ThermoMixer *	Eppendorf	C 5382000015
Nanodrop *	ThermoFisher Scientific	ND 2000
Mini-Protean Tetra Cell*	Bio-Rad	1658001FC	For use with handmade or precast gels
ProteoSilver silver stain kit	Sigma-Aldrich	PROTSIL1	High sensitivity protein detection with low background
Centrifuge 5804 R *	Eppendorf	B1_022628045	High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 mL)
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	606180	5 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	607180	25 mL
Graduated pipettes Cell star *	Greiner bio-one	760180	25 mL
Filter tips *	Greiner bio-one	750257	1250 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	738257	300 µL
Filter tips *	Greiner bio-one	771257	10 µL
Ice bucket with lid *	VWR	10146-290
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 *	VWR	181-0065
Pipetman P2	Gilson	F144801
Pipetman P20	Gilson	F123600
Pipetman P100	Gilson	F123615
Pipetman P200	Gilson	F123601
Pipetman P1000	Gilson	F123602
* Materials marked with an asterisk are expensive pieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes.