JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, hayatta kalma tek hücre olarak izlemek ve önemli ölçüde hücre ölümünü tahmin değişkenleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Lysates veya birden fazla zaman noktalarda sabit hücreler topluluğu gerektiren standart sitotoksisite deneyleri, duyarlılık ve nöronal kaderini etkileyen faktörleri değerlendirmek için kapasitesi sınırlıdır. Bu deneyleri hücre ayrık zaman noktalarda ayrı nüfus gözlenmesi gerekir. Sonuç olarak, tek tek hücreleri prospektif ciddi puncta oluşumu veya protein mislocalization, gibi hücre altı olaylar hastalığın patojenik sürücüleri homeostatik yanıt olup ayrımcılık yeteneği sınırlı zaman içinde izlenemiyor, ya da sadece tesadüfi olaylar. Tek hücreli boyuna mikroskobu araştırmacı hayatta kalma nüfus arasındaki farklılıkları belirlemek ve nedensel ilişkileri gelişmiş hassasiyeti ile çizmek izin bu sınırlamalar üstesinden gelir. Bu video rehber tek hücreli hayatta kalma bir floresan protein marker ifade sıçan birincil kortikal nöronların ölçme deneyleri için temsil edici bir iş akışı açıklayacağım. Görüntüleyiciyi yüksek verimli transfections elde etmek, toplamak ve tek tek hücreler potansiyel izlemeyi etkinleştirme görüntüleri işlemek nasıl öğrenin ve nöron popülasyonları Cox orantılı tehlikeler analizi kullanarak göreli yaşama karşılaştırın.

Giriş

Anormal hücre ölümü kanser, ateş ve kontur1de dahil olmak üzere birçok hastalığın sürüş bir faktördür. Hücre ölümü için güçlü ve hassas deneyleri genişleterek veya daraltarak hücresel hayatta kalmak için bu bozuklukların karakterizasyonu yanı sıra tedavi stratejilerinin geliştirilmesi gereklidir. Şu anda hücre ölümü, doğrudan veya vekil işaretleri2Ölçme teknikleri düzinelerce vardır. Örneğin, hücre ölümü görsel yardımıyla seçerek ölü veya canlı hücre3leke hayati boyalar veya plazma zarı4,5,6 belirli fosfolipitler görünümünü izleme tarafından tespit edilebilir . Hücre içi bileşenleri veya hücresel metabolitleri hücresel dağılması üzerine medya içine serbest ölçülerini, hücre ölüm7,8için proxy olarak da kullanılabilir. Alternatif olarak, hücre canlılığı metabolik aktivite9,10değerlendirmek tarafından yaklaşık. Bu yöntemleri hücre survival değerlendirirken bir hızlı yol sağlar rağmen onlar uyarılar değildir. Her teknik kültürü tek tek hücreler ve hayatta kalma kendi benzersiz oranları arasında ayırt etmek imkansız rendering tek bir nüfus olarak gözlemler. Ayrıca, bu tür nüfus tabanlı deneyleri hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme dahil olmak üzere hücre ölümü için önemli olabilir faktörler ölçmek mümkün değildir. Birçok durumda, bu deneyleri ayrık zaman puan için sınırlıdır ve hücreler sürekli gözlem altında zaman içinde izin vermez.

Buna ek olarak, boyuna floresans mikroskobu doğrudan ve sürekli olarak bir tek hücre olarak11ölüm riski izler son derece esnek bir metodoloji var. Kısacası, boyuna floresans mikroskobu düzenli aralıklarla uzun bir süre hücre ölümü ve geliştirmek veya hücre ölümü bastırmak faktörler kesin tespitler izin, için izlenmesi gereken tek tek hücreleri binlerce sağlar. Kaidesi Yöntem geçici transfection veya hücre iletim flüoresan protein kodlama vektörleri ile içerir. Benzersiz yediemin ardından kurulan ve bu simgesel yapı ile ilgili olarak transfected her hücrenin konumu görüntü ve tek tek hücreler saat, gün veya hafta boyunca izlemek Kullanıcı sağlar. Bu görüntüleri ardışık olarak görüntülendiğinde, hücre ölümü floresan, Morfoloji ve parçalanma her hücre için ölüm zamanını atanması olanaklı kılmak hücre vücudun karakteristik değişiklikler tarafından işaretlenir. Hazard fonksiyonu tarafından belirlenen ölüm, hesaplanan oranı daha sonra nicelik arasında koşulları karşılaştırıldığında veya tekdeğişirli veya çok değişkenli Cox orantılı tehlikeler analiz12kullanarak hücresel özellikleri seçmek için ilgili. Birlikte, bu yaklaşımların oranları hücresel popülasyonlar arasında hücre ölümü ve hücre ölümü ve/veya hayatta kalma (Şekil 1) önemli ölçüde tahmin değişkenleri tanımlaması doğru ve objektif ayrımcılık etkinleştirin.

Bu yöntem her sonrası Mitotik hücre tür biçimleri kaplama çeşitli ve hayatta kalma izlemek için kullanılabilmesine rağmen bu iletişim kuralını transfecting ve fare kortikal nöronlar kültürlü bir 96-şey tabak içinde görüntüleme için koşullar anlatacağız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm omurgalı hayvan iş kullanımı ve bakımı hayvanlar Michigan Üniversitesi (iletişim kuralı # PRO00007096) Komitesi tarafından kabul edildi. Deneyleri dikkatle hayvanlar kurban sayısını en aza indirmek için planlanmaktadır. Hamile kadın vahşi tipi (WT), transgenik olmayan uzun Evans fareler (Rattus norvegicus) ev sahipliği yaptığı tek başına çevre zenginleştirme ile donatılmış ve Michigan Üniversitesi'nde Laboratuvar hayvan Tıp (ULAM) için birimi tarafından yapılan bakım odalarında NIH destekli Rehberi uygun bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları. Bütün fareler için ötenazi, ötenazi Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi kurum ve Michigan Üniversitesi yönergeler önerileri ile tutarlı önce mümkün olduğunca az zaman tarafından ötanazi yöntemleri konut rutin tutuldu Türler yönergeleri.

1. malzeme hazırlama

  1. 19 – 20 fare pups ve kültür için 4 gün vitro, poli-D-lizin kaplamalı plakalar üzerinde mililitre başına 106 hücre x 0.5, kortikal nöronlar13,14daha önce açıklandığı gibi fare embriyonik günden kortikal nöronlar incelemek, 15,16,17,18,19.
  2. Plazmid DNA bir endotoksin-Alerjik plazmid DNA izolasyon tarafından anlatılan adımları takip ilgi hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Bir spektrofotometre kullanarak sonuç DNA ölçmek.
  3. 4 (DIV4), aliquot, filtre sterilize ve 37 ° c 6 mL, aşağıdaki ortam kuluçkaya tüp bebek günde 25 mL nöronal serum medya (RSM; örneğin., OptiMEM), düşük bazal medya (Koyulmus), 40 mL NBKY (Koyulmus + 1 mM kynurenic asit + 10 mM MgCl27 pH için ayarlanabilir,. 4), 10 mL NBC (Koyulmus + 1 x nöronal hücre kültür özel sayı + 1 L-glutamin takviyesi x + 1 kalem Strep x).
    Not: Listelenen birimler transfecting bir 96-şey plaka için yeterlidir. Malzemeler tablo belirli reaktifler için başvurun.

2. sıçan kortikal nöronların transfection

  1. Sağlanan örnek transfection sayfası değiştirmek (bkz. ek dosya 1) plaka tipi, plaka harita, DNA'lar, sayısını ayarlayarak DNA konsantrasyon ve wells (yeşil kutuları) sayısı.
    Not: Toplam DNA özetliyor şey, başına 0.2 µg için ne olursa olsun, ister bir (e.g., DNA'a) veya daha fazla (örneğin, DNA B ve C) DNA yapıları eklenir her şey için.
  2. Elektronik tablodan çalışan, RSM ve DNA uygun miktarda bir tüp içinde birleştirmek. RSM ve transfection reaktifi (örneğin, Lipofectamine) ayrı bir tüp uygun miktarda birleştirin.
  3. Oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.
  4. DNA ve transfection reaktif RSM karışımları birleştirin ve RT 20 dk için kuluçkaya.
  5. Bu kuluçka adımı sırasında bir çok kanallı pipet kullanın ve yıkamak için steril plastik kaplar hücreleri 2 x 100 µL Koyulmus kuyu başı ile. Klimalı ortam (CM) ayırma ve 37 ° C'de depolayın Bu ve aşağıdaki adımları için nöronlar havaya maruz zamanı en aza indirmek için özen gösterin.
  6. Koyulmus medyayı çıkarın ve NBKY kuyu başına 100 µL yerine.
  7. 20 dk geçti sonra transfection reaktif/DNA karışımdan 50 µL dropwise her şey için ekleyin.
  8. Transfection reaktif/DNA komplekslerinde 37 ° C'de 20 dk için hücrelerle kuluçkaya
  9. 2 x NBKY ile durulayın ve cm 100 µL ve NBC 100 µL iyi ücret ile değiştirin.
  10. Başarılı bir şekilde transfected hücreleri floresan mikroskopi transfection 16-24 h içinde tarafından görünür olmalıdır. Verimliliği ölçmek için floresan mikroskop transfection 37 ° C'de gecede kuluçka sonra denetlemek için kullanın.
    Not: Bu teknik bir genel transfection verimlilik % 5-10 içinde sonuçlanır.

3. görüntüleme

  1. Plaka motorlu bir sahne ile floresan mikroskop yer ve plaka yansıma her zaman hizalamak kullanıcının izin verir (örneğin, kalenin dibinde bir işareti) bir güvene kurmak. Bu başvuru için Mütevelli görüntüsünü kaydedin.
  2. İlgi alanına gidin ve x-y koordinatları göreli olarak güvene dikkat edin.
  3. Transfected hücreleri floresan bir etiket ifade üzerinde odaklanın.
  4. Floresan görüntü uygun kanal veya kanalları (örneğin, kırmızı floresan protein [RFP], yeşil flüoresan protein [GFP], ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), el ile veya otomatik bir şekilde alabilir. Düzenli aralıklı aralıklarla birkaç görüntü alarak, iyi bir montaj görüntü işleme sırasında birleştirilebilecek (bkz. Adım 4).
    Not: Boşluğu büyütme, optik mikroskop ve dedektör boyutu da dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. Genel olarak, optik aralığı bitişik görüntüler arasında arasında 90 – 95 oranında görüntü örtüşme küçük bir derece için izin ve hizalama özelliği için tek tek her görüntünün boyutunu olacak.
  5. Bu gerekli, özgün güvene kaydırılmasını sıklıkta her zaman adımları tekrarlayın. Sağkalım analizi için hücre tipi ve deneme amacı bağlı olarak her 6-24 h görüntüleme gerçekleşir.

4. görüntü işleme

Not: Resim alma, işleme adımları bir dizi görüntü analizi önce gerekli. Bunlar, bunlarla dikiş, istifleme ve arka plan çıkarma (Şekil 1) için sınırlı değildir. Bir görüntü yığını veya hücreleri açıkça ayırt kendi arka plan ve birden çok kez puan üzerinden takip edilmesi kolay olan saat serisi oluşturmak için aşağıdaki adımları hedefidir. Adanmış bir FIJI makro (Image_Processing.ijm, ek dosya 2' ye bakın), temel dikiş, istifleme, gerçekleştirir ve arka plan çıkarma. Her adım ve görüntü işleme işlemi sırasında göz önünde bulundurulacak parametreleri açıklaması tartışma bölümünde sağlanmıştır.

  1. Ham veriler veya Şekil 2' de gösterilen biçimlendirmesiyle eşleşecek şekilde giriş dizini ayarlayın.
  2. Eğer zaman puan bitişik olmayan (örneğin, T1, T2, T3), klasörü yeniden adlandırın bu böylece bunlar olur. Image_Processing makro kaza değil emin olmak için kritik bir adımdır yığınlama sırasında.
  3. Açık bilgisayar programı, o zaman'ı tıklatın ve Image_Processing makro Fiji çubuğuna sürükleyin için Fiji simgesini çift tıklatın. Bu makro Fiji içinde açılacaktır.
  4. Giriş dizini içeren görüntüleri, istenen çıkış dizinini dikişli ve yığılı karakterler görüntüler için görüntüleme timepoints sayısı, floresan kanalları ve plaka biçimi belirtmek için Image_Processing makro 2-7 satırlık ayarlayın.
  5. Görüntüleri elde sırasını belirler. Bu test etmek için el ile bir montaj FIJI görüntülerin eklentileri damla aşağı yemek listesi | manevra tarafından dikiş Dikiş | Kılavuzu/koleksiyonunda dikiş. Doğru bir şekilde dikişli görüntü üretilen kadar açılan menüleri türü ve Düzen içinde ayarları.
  6. 8 ve 9 bu seçimleri eşleşecek şekilde Image_Processing makro hatlarında GRID_TYPE ve STITCH_ORDER değişkenleri ayarlayın.
  7. İyi başına çekilen fotoğraf sayısı hat 10 Image_Processing makrosunda ayarlayarak belirtin.
    Not: Görüntüleri için bir 2 x 2 Montaj DIM bu satırı okur musunuz = 2.
  8. Arka plan çıkarma gerekiyorsa, satır 14 BGSUB Image_Processing makrosunda ayarlamak = true.
  9. Image_Processing makro içini kaplamak 15 ayarlayarak haddeleme topu yarıçapı ayarlayın.
    Not: En iyi sonuçlar için yarıçapı için en az ayarlayın çapı görüntüdeki en büyük ön plan nesnesinin.
  10. Image_Processing makro başlatmak için Çalıştır ' ı tıklatın. Bir kez başladı, Image_Processing otomatik olarak dikiş, istifleme ve arka plan çıkarma ilerler.

5. hücre ölümü Puanlama

Not: Tartışma bölümünde daha fazla bilgi için bkz: skor hücre ölümü ve sansür üzerinde.

  1. Görüntü yığınları Image_Processing komut dosyası tarafından üretilen bulun. Bunlar Fiji'de açın.
  2. Aracı gelin FIJI içindeki tek tek her hücre bir sayı ile etiketlemek için kullanın. Her noktası hücre tanımlayıcı ROI (bölge ilgi) Yöneticisi için katacak sonunda t tuşuna basın.
    Not: Tanımlayıcılar için etiketleri ve Tümünü göster onay kutularını ROI Yöneticisi'nde tıklatarak görüntülenmeyecektir.
  3. Her görüntü yığını ve kaydına her hücre zaman ya ölür ya da Survival_spreadsheet.csv (bakınız ek dosya 3) dosyasında sansür gerekiyor timepoint timepoints yoluyla ilerleme.
    1. Her hücre nerede onun de karşılık gelen ve yatırım getirisi sayısı o kadar iyi içinde her hücre için benzersiz bir tanımlayıcı (kimlik) oluşan elektronik tablo, tek bir satır kaplar. tp_death bir hücre ölüm saat içinde gerçek zaman time_death temsil ederken yaşadığın için gözlenen son saat noktasıdır. Her hücre için bu veri girişi. Hayatta kalma kullanarak daha sonraki analiz için bu yapısını korumak için çok önemlidir. R (bkz. ek dosya 4).
      Not: hücre ölümü belirlemek için ölçütleri açısından büyük önem taşıyor ve hücre türüne bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Üç ana kriterler ölü nöronlar11,20 (Şekil 3) tanımlaması kullanılır: floresan yoğunluğu (örneğin, 69 s nöron 1) kaybı hücre vücut (örneğin, 188 s nöron 2) ve neurite kaybı yuvarlama bütünlüğü veya blebbing (örneğin, 188 s nöron 2).
  4. Kaydı son sütununda hücreyi sansür durumunu.
    Not: Burada, kendine özgü biçimi nedeniyle sansür ele alınır sansürsüz hücreleri 1tarafından işaretlenmiş ise R, 0tarafından sansürlü hücreleri işaretlenir. Son zaman noktası yaşamak tüm hücreleri sansür ve bu nedenle 0işaretlenmiş unutmayın.

6. Cox orantılı performans analizi ve görselleştirme sonuçları tehlikeleri

  1. Gerekirse, https://cran.r-project.org/mirrors.html, R studio indirin.
  2. R studio açın ve hayatta kalmak için simgesini çift tıklatın. R komut dosyası.
  3. İmleci hayatta kalma hat 2. R ve hayatta kalma kütüphane yüklemek için ana R studio penceresinde Çalıştır düğmesini tıklatın.
  4. Hat 5 hayatta kalma değiştirin. R dosyasının konumunu eşleşmesi için komut dosyasını Survival_spreadsheet.csv. Bir dataframe olarak hayatta kalma verileri yüklemek için Çalıştır ' ı tıklatın.
  5. 8 ve 9 satırları vurgulamak ve Cox orantılı tehlikeler analiz gerçekleştirmek için R studio konsol penceresinde Çalıştır düğmesini tıklatın. Sonuçları ve çıkış istatistik R studio konsol penceresinde görünür.
  6. Satırları 12-16 hayatta kalma vurgulamak. R ve R Studio araziler sekmesinde görünür ölüm Arsa toplu riski üretmek için çalıştırma düğmesine basın. Bu dosyayı arsa üzerinde Aktar düğmesini tıklayarak kaydedilebilir.
  7. Bu bir Kaplan-Meier eğrisi olarak hayatta kalma verileri çizmek için arzu edilir eğer hatları 19-24 hayatta kalma vurgulayın. R ve çalıştırma düğmesine basın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada açıklanan transfection yordamı kullanarak, DIV4 sıçan kortikal nöronlar floresan protein mApple kodlama bir plazmid ile transfected. 24 saat sonrası transfection başlayarak, hücreleri floresan mikroskopi her 24 h 10 gün üst üste görüntüsü. Sonuç görüntüleri Şekil 2' de gösterildiği gibi düzenlenen sonra dikişli, yığılmış ve hücre ölümü (Şekil 1) attı. Şekil 3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, doğrudan tek hücre olarak nöronal hayatta kalma izlemek için metodoloji sunulur. Ayrık zaman puan ve hücre tüm nüfus için sınırlı olan geleneksel deneyleri aksine hücre ölümü için çeşitli faktörlere hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme, gibi sürekli değerlendirilmesi için bu yöntem sağlar ve nasıl her faktörü hücresel hayatta kalma ileriye dönük bir şekilde etkilediği belirleyebilirsiniz.

Bu metodoloji deneysel ihtiyaçlarını geniş ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Steve Finkbeiner ve üyeleri Finkbeiner lab robot mikroskobu öncü için teşekkür ederim. Biz de ilk yazılım görüntü işleme için gerekli ve sağkalım Analizi otomatik bina için Dan Peisach teşekkür ederim. Bu eser nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) R01-NS097542, Michigan Üniversitesi'nde Protein katlanır hastalığı girişimi ve Ann Arbor etkin ALS karşı için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Neurobasal MediumGIBCO21103-049
Opti-MEMGIBCO31985-070
CompactPrep Plasmid Maxi KitQiagen12863
Magnesium chloride HexahydrateSigmaM9272
Kynurenic Acid HydrateTCIH0303
Poly D-LysineMilliporeA-003-E
GlutamaxGIBCO35050-061
Lipofectamine 2000Invitrogen52887
B27 supplementThermo FisherA3582801
Penicillin/StreptomycinGIBCO15140122
96 well platesTPP0876

Referanslar

  1. Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
  2. Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
  3. Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
  4. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  5. Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
  6. Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
  7. Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
  8. Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
  9. Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  10. Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
  11. Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
  12. Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
  13. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
  14. Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
  15. Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
  16. Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606(2018).
  17. Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005(2017).
  18. Park, S. -K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805(2017).
  19. Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
  20. Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 143h cre l matefloresans mikroskobuotomasyontransfectionsa kal m Analizi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır