Bir Ex Vivo doku kültürü modeli Fibrovascular komplikasyon proliferatif diyabetik retinopati

Özet

Burada, proliferatif diyabetik retinopati Patofizyoloji üç boyutlu yerel doku karakterizasyonu ve ex vivo kültürü için hasta kaynaklı, cerrahi olarak eksize, fibrovascular dokuları kullanarak eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu ex vivo kültür modeli sınama veya yeni tedaviler geliştirmek için mükellef da.

Özet

Diabetik retinopati (DR) diyabet en yaygın mikrovasküler komplikasyon ve bir çalışma çağındaki erişkinlerde körlük neden olur. Diyabet ve oksijen kaynaklı retinopati geçerli hiçbir hayvan modelleri insan proliferatif diyabetik retinopati (PDR) tecelli tam menzilli ilerici değişiklikleri geliştirmek. Bu nedenle, hastalığın patogenezi ve patofizyolojisi anlayışı histolojik kesitler ve yalnızca ilgili patojenik etkenlere kararlı durum bilgi sağlayan yaklaşımlar vitreus örnekleri üzerinde büyük ölçüde güvendi. Kanıt artan dinamik hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matriks (ECM) etkileşimleri bağlamında üç boyutlu (3D) microenvironments yeni mekanik ve fonksiyonel çalışmalar geliştirilmesi için gerekli olduğunu gösterir tedavi stratejileri. Bu nedenle, cerrahi olarak PDR ile gözlerden eksize patolojik fibrovascular doku yıkıcı bu hastalığın hücresel ve moleküler mekanizmaları güvenilir bir şekilde çözmeye ve Roman klinik için potansiyel test etmek için yararlanılabilir ki biz olan müdahaleler. Bu sonlarına doğru biz ex vivo kültür insan PDR patofizyolojisi ilgili bir model olarak hizmet edecek cerrahi olarak eksize hasta kaynaklı fibrovascular doku (FT), 3D için yeni bir yöntem geliştirdi. FTs explants disseke ve ex vivo kültür ve 3D karakterizasyonu fibrin matris için gömülü. Bütün Dağı ayirt yerli FTs ve son nokta kültürlerin kapsamlı soruşturma doku kompozisyon ve 3D doku düzeyinde karakterizasyonu ortaya çıkarılması ilgili özellikleri için önemini vurgulayarak çok hücreli süreçlerin sağlar PDR patofizyolojisi. Bu model moleküler mekanizmaları, cep/doku süreç ve tedaviye yanıt-e doğru aynı zamanda yapılan değerlendirme PDR doku mimarisi ve microenvironment içinde dinamik biyokimyasal ve fiziksel etkileşimleri karmaşık bağlamında sağlayacaktır. Bu model PDR patofizyolojisi beyannamedir yana Ayrıca sınama veya yeni tedaviler geliştirmek için müsait olacak.

Giriş

DR diyabet, son üç yılda¹büyük oranlarda ulaştı bir hastalık ciddi bir oküler komplikasyondur. Yirmi yıl sonra tanı, diyabet tip 1 ve tip 2 diyabet retinopati şeker hastalığı başına bir lider yapmak, mevcut belirtileri ile % 60 hastaların hemen hemen her hastada yaş yetişkin²çalışma körlüğü neden olur. Mikrovasküler dejenerasyon ve iskemik hasar düzeyine göre DR Proliferatif DR (non-PDR) ve Proliferatif DR (PDR) sınıflandırılır. Son aşama hastalığı, PDR, iskemi ve inflamasyon indüklenen neovaskülarizasyon ve fibrotik vitreus arayüzü ile karakterizedir. Tedavi edilmemiş koşullarında, bu işlemlerin körlüğü nedeniyle vitreus kanaması, Retina fibrozis, tractional Retina dekolmanı ve neovasküler glokom^3,4yol açar. Son gelişmeler rağmen mevcut tedavi seçenekleri sadece DR aşamaları Retina hasar zaten ortaya çıkan zaman Diyabetik Makula ödemi ve PDR, dahil olmak üzere, hedef. Ayrıca, DR hastaların büyük oranda gelişmiş tedaviler^4,5,6için acil bir ihtiyaç gösteren geçerli tedavi armamentarium yarar değil.

Tarihi için birden çok diğer benn vivo hastalık/gelişimsel modeller ve diyabetik hayvan modelleri geliştirilmiştir, ama hiç biri tam kapsamlı patolojik özellikleri insan PDR^7,8' gözlenen beyannamedir. Ayrıca, kanıt artan ECM kompozisyon yanı sıra mekansal düzenleme ve hücresel ve acellular microenvironment⁹arasındaki etkileşimi tedavi yanıt sıkıca bağlı olduğunuzu belirtir. Biz bu nedenle, genelde vitrektomi PDR¹⁰cerrahi yönetiminin bir parçası olarak gören gözlerinden eksize FT patolojik malzeme insan PDR klinik bir model geliştirmek üzere yola çıktı.

Bu el yazması için 3D ex vivo kültür protokolünü açıklar ve cerrahi-varlığına, PDR karakterizasyonu hasta patolojik FT kaynaklı. Burada açıklanan yöntemi gösterdi yerli 3D PDR doku peyzaj başarılı deconstruction ve tekrarlama PDR patofizyolojisi anjiogenik ve fibrotik anormal gibi özelliklerinden son yayında kullanılan vasküler yapılar¹¹. Bu model ayrıca apoptozis ve yayılması gibi vasküler adacık oluşumu¹¹kolayca--dan ince histolojik kesitler, gibi dağınık şekilde takdir edemez roman özellikleri sınırlı saptandı. Vitreus sıvısı başarıyla başkaları tarafından kendi anjiogenik potansiyel değerlendirmek için 3D endotel küresel kültür ve angiostatic molekülleri¹²etkinliği üzerinde kullanılmıştır. PDR vitre uyarıcı kullanarak tahlil çimlenme vitro 3D lenfatik endotel hücre (LEC) küresel ile birleştirildiğinde, bizim model as için neovasküler doku içinde de yerel olarak ipuçları her iki çözünür vitreal katkısını faktörler ortaya Henüz kötü anlaşılır LEC katılımı PDR patofizyolojisi^3,11. PDR yönetiminde, vitreus cerrahi düzenli olarak gerçekleştirilen henüz zorlu işlemdir. Cerrahi cihazların ve teknikleri sofistike ve sürekli ilerleme görmek gibi fibrovascular proliferatif numune zamanında ve muhafazakar kaldırılması sadece vizyon sonucu artırır ama da için paha biçilmez doku materyalleri sağlar canlı insan dokusu microenvironment karmaşık translasyonel yönleriyle PDR patofizyolojisi ve tedavi yanıtlarının incelenmesi.

Protokol

Bu araştırma Kurumsal değerlendirme Komitesi ve Helsinki Üniversitesi Hastanesi etik kurul tarafından kabul edildi. İmzalı onay her hastadan elde edildi.

1. hazırlık çözümler, medya & donanım

1. Hızlı işleme emin olmak için fibrovascular doku (FT) topluluğu önce aşağıdaki donanımları hazırlamak.
   1. Steril-otoklav iki mikrodiseksiyon cımbız.
   2. 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 1 önceden ağırlığını PBS (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO₄^-3) 900 ml deiyonize su ve erimesi için karıştırın tablet çözülerek hazırlayın. 1 L ve steril-otoklav hazır çözüm kadar su sesi ayarlayın. Mağazada RT.
   3. Yukarıda belirtilen çözüm ve ekipman tek kullanımlık steril neşter, steril 6 cm hücre kültür çanak ve beş steril 12-şey hücre kültür tabak bir sepette toplamak.
2. 6 mg/mL 5 mL HBSS, bir su banyosu için en az 1 h 37 ° C'de içine dalmış bir 50 mL tüp kullanarak de içine insan fibrinojen plazminojen tükenmiş 30 mg çözülerek fibrinojen çözüm içinde Hanks dengeli tuz çözüm (HBSS) hazırlayın.
   Not: Bu çözüm 7 h (maksimum 10 h) su banyosu (37 ° C) kullanmadan önce tutulabilir.
3. Eski hazırlamak vivo kültür % 5 fetal buzağı serum (FCS) veya % 5 insan serumu, %0,4 endotel hücre büyüme ek, 10 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü, 1 μg/mL hidrokortizon ve 50 μg/mL viomisin için piyasada bulunan ekleyerek orta endotel hücre büyüme orta ve su banyosu kullanımı kadar 37 ° C'de unutmayın. 4 ° C'de için bir ay kadar saklayın.

2. fibrovascular doku diseksiyon

1. Eksize fibrovascular doku (FT) insan denekler trans konjonktival microincision vitreus, 23 ya da 20 gauge üç-port pars plana vitrektomi PDR vitreus cerrahi yönetiminin bir parçası olarak tarafından ameliyat toplamak.
   Not: FT segmentasyon ve delaminasyon, microscissors ile seçin ve göz içi microforceps sonu sürükleyici ile vitreus kavite kaldırıldı deneyimli vitreus cerrah tarafından kesme kullanarak çıkardım. Aşırı kaygı sağlam, hasarsız FT optik sinir veya patolojik neovasküler doku en sık yerleştirildiği zamansal vasküler arcade dahil olmak üzere oküler yapılar zarar vermeden kaldırmak için alınması gerekir. Çıkarılan doku boyutunu değişkendir genellikle 3 ve 50 mm²arasında değişen.
2. 6 cm hücre kültür çanak veya 1,5 mL tüp 1 mL steril PBS ıslak buz üzerinde yerleştirilen içeren FT tutmak ve hemen işleme için laboratuvar araştırma için aktar.
   Not: Bu araştırma birimi (laboratuar imkanları) fiziksel küçük eksize ft aktarım süreleri en aza indirmek için (veya) Hastanesi ameliyathane yakın olduğunuzu esastır. Bu durumda transfer az 5 dakika sürer ve explants fibrin içinde genellikle cerrahi kaldırıldıktan sonra 1-1.5 saat (maksimum 2 h) katıştırılır. Daha uzun aktarım süreleri 3D kültür üzerine etkisini test edilmesi gerekir.
3. FT PBS 1 mL (RT, 25 ° C) Oda sıcaklığında içeren 6 cm hücre kültür tabağına koyun ve 5 x amacı ile bir ters epifluorescence mikroskop kullanarak doku görüntüleri.
   Not: Resimler niteliksel değerlendirmesi ve belgeler için alındı. Doku boyutu, yoğunluk ve genel kompozisyon (Örneğin, vasküler yapılar) gözlemlemek mümkün.
4. FT² adet steril neşter ve mikrodiseksiyon Cımbız kullanarak bir dik diseksiyon stereomicroscope altında ~ 1 mm kesti. PBS, mikrodiseksiyon Cımbız kullanarak yerde içinde de sular altında doku, tutun ve açık kesim steril neşter kullanarak gerçekleştirmek. Bu yerel fibrovascular yapıları değiştirecek FT, yırtılma önlemek.
5. Her bireysel parça 1 mL steril PBS içeren 12-şey hücre kültür plaka bir kuyunun içine yerleştirin.
   Not: gerekirse, nazikçe keser gerçekleştirmeden önce mikrodiseksiyon Cımbız kullanarak FT levha üzerine yayıldı.

3. döküm dik Fibrin jel damlacıkları yerli FT ve Ex Vivo kültür karakterizasyonu için

1. Steril-filtre bir 10 mL şırınga monte adım 1.2 0,22 mikron filtre ile hazırlanan hazır fibrinojen çözüm.
2. Hazırlama aliquots fibrinojen çözüm (1,5 mL tüp başına 25 μL) ve tutmak RT. Prepare fibrin için bir aliquot, jel / her FT parça diseksiyon sonra elde edilen ve fibrin test etmek için ilave aliquots birkaç jel oluşumu.
3. Prepare Trombin ve 400 μg/mL aprotinin, 4 adet/mL içeren HBSS bir çözüm ahiret TA çözüm aradı ve RT. hazırla gerektiğinde bağlı olarak diseksiyon sonra elde edilen parça sayısı kadar TA çözüm tutmak (25 μL TA çözüm kullanılan her biri için FT/fibrin jel) ve fibrin jel oluşumu test ve yeterli bir çözüm fibrin jel damlacıkları döküm boyunca kullanılabilir olmasını sağlayabilmek için ilave bir miktar (Örneğin, 250 μL).
   Not: aprotinin fibrin jel bozulma önlemek için hücresel proteaz FTs^13,14tarafından ifade tarafından eklenirken Trombin fibrin polimerizasyon için gereklidir.
4. Fibrin jel oluşumu zamanlaması test: 25 μL TA çözüm 3.2 adımda hazırlanan bölünmemeli 25 μL fibrinojen çözüme ekleyin ve başka bir pipet için 50 μL ayarla kullanarak, pipetting tarafından tüp içinde karıştırın ve bir 6 cm hücre kültür tabak içine dağıtmak , dik bir damlacık şekillendirme.
   Not: Fibrin jel oluşumu ~ 1 dk içinde gerçekleştirilmelidir. Bu 1,5 dakika sürer Trombin 3.3 adımda hazırlanan TA solüsyona konsantrasyonu daha fazla Trombin hisse senedi çözüm ekleyerek artırılabilir. Fibrin jel oluşumu içinde 1,5 dk oluşana kadar onda biri Trombin hisse senedi çözüm başlangıçta kullanılan hacmi, art arda, eklenebilir. Fibrin jel oluşumu için kültür, dimensionality üç kritik zamanı hızlı jel fibrin jel altına batan ve böylece hücre 2D plastik yüzeyi ile temas geliyor FT parça (içinde 1,5 dakika) oluşumunu önler Kültür plaka, 2D hücre adezyon ve akıbet yol açabilir.
5. Bir FT parça steril bir cımbız kullanarak 24-şey plaka bir şey merkezinde yer ve emiş gücü ft önlemek için 0,5-10 μL pipet ile pipetting tarafından herhangi bir aşırı PBS kaldırın. Doku için cımbız sopa durumda plaka üzerinde doku parçasının yerleşim yardım etmek için ek bir cımbız kullanın.
   Not: FT/fibrin jelleri 48-şey plaka üzerinde reaktifler kullanımını azaltmak için artığını. Ancak, bu alanı daha sınırlıdır ve temas iyi duvar gelirse fibrin yayılır gibi daha zor.
6. 25 μL fibrinojen çözüme adım 3.2 bölünmemeli 25 μL TA çözüm ekleyin ve başka bir pipet kullanarak tüp içinde 50 μL karışıma pipetting tarafından ayarlayın. Plaka üzerinde iyi yerleştirilmiş FT parça dağıtmak ve 3D çevre matris FT ila sağlayan dik damlacık içinde FT parça eklemek için pipet aşağı yukarı 2 - 3 kez.
   Not: FT pipetting sırasında emişli değil ve hiçbir hava kabarcıkları oluşmuş olun. Ayrıca 1,5 dk içinde fibrin jel oluşturacak gibi karıştırma, kader ve pipetting hızlı bir şekilde adım 3.4 test olarak gerçekleştirilmesini sağlamak. Fibrin jelleri 48-şey plaka üzerinde döküm gerekiyorsa, fibrinojen çözüm 20 μL ve 20 μL TA çözüm kullanın.
7. 3.5 ve 3.6 FT parçalar için yineleyin.
8. Plakayı %5 CO₂ile oksijen bir atmosferde 37 ° C'de bir hücre kültür Kuluçka kuluçka tarafından katılaşmaya fibrin jel izin.
9. 0.5-1 sonra fibrin jel tamamen tarafından özenle oluşturulmuş s, onay plaka devirme. Plaka, fibrin jel oluşumu tamamlandığını gösteren hareket ettirildiğinde jel hareket etmez zaman 3.10 adıma geçin.
10. 100 μg/mL aprotinin ile desteklenmiş FT/fibrin jel ile ex vivo kültür orta (600 μL/de 24-şey plaka) veya 300 μL/kuyuda 48-şey plaka yerleşimi. Orta yavaşça drop-wise kader tarafından pipette.
    Not: Burada, aprotinin fibrin jel bozulma önlemek için hücresel proteaz FTs^13,14tarafından ifade kullanılır. Ex vivo kültür orta Ayrıca VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ gibi rekombinant büyüme faktörleri ile takıma girebilir (bakınız Tablo reçetesi)¹¹.
11. Ex vivo kültür plaka FT geri 37 ° C, % 5 CO₂ hücre kültür kuluçka ve kültür istediğiniz zaman dönemi için (Örneğin, 2 - 18 gün, uzun kültür dönemleri test edilmesi gerekecektir) yerleştirin. Orta % 50'si ile taze ex vivo kültür orta yerine üç günde.

4. "Matrix" in görüntüleme

1. Ex vivo kültürler FT görüntülerini aynı gün (gün 0) elde etmek ve (Örneğin, her geçen gün) kümesi aralıklarla, 3D büyüme izleyebilmek için bir ters epifluorescence mikroskop kullanarak.
   Not: elde edilen görüntüler için FT akıbet miktar iki dikey çapları toplam uzunluğu olarak karşıdan karşıya explant¹¹kullanılabilir.

5. yerel FT ve Ex Vivo kültür son nokta

Not: FT/fibrin jelleri (ex vivo kültürler FT) istediğiniz zaman aralığının ex vivo kültürlü veya yerel FT karakterizasyonu¹¹için aynı gün (yerel FT) sabit.

1. Kültür orta yerine 1 mL/4% paraformaldehyde RT. 1 h için PBS çözümünde de, yerel FT veya FT ex vivo kültürler sabitleyin 0.5-1 yerli FT/fibrin jel için tamir sonra eski ilavesi s vivo kültür orta (fibrin jel-değil var batırılmış ortamda, fiksasyon onlara zarar verir).
   Not: paraformaldehyde aşındırıcı, zehirli ve kanserojen olduğu gibi duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
2. PBS içinde FT/fibrin jel ile üç 5 dk yıkama durulama (2 mL/de).
3. PBS yerine 2 mL/de %0,02 sodyum azid içeren PBS ve daha fazla işleme kadar 4 ° C'de sabit fibrin jelleri saklayın. FT/fibrin jelleri depoda kuru değil emin olmak için parafin film ile plakalarının.
   Not: Sodyum azid zehirli olduğu gibi duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.

6. bütün-Mount ayirt boyama

Not: Bu protokol 5 gün süren ve gece incubations ile kesintiye belirtilen yerde. Herhangi bir noktada jelleri kuru fibrin izin vermeyin. Tüm adımlar RT aksi belirtilmedikçe gerçekleştirilir.

1. Aşağıdaki çözümleri boyama Protokolü başlamadan önce hazırlayın.
   1. Sonrası fiksasyon çözüm: eşit miktarda aseton ve metanol karıştırılarak 50: 50 aseton: metanol çözüm hazırlamak (Örneğin, 50 mL). -20 ° C'de mağaza Bu çözüm en son gün boyama önce hazırlamak. Bu çözüm geri-20 ° C'de depolanan ve sonraki stainings için kullanılabilir.
      Not: Bu çözüm duman başlıklı aseton ve metanol yanıcı ve sağlık için tehlikeli olduğu gibi hazır olun.
   2. Çözüm engelleme: % 15 fetal Sığır serum (FBS), % 0.3 Oktil fenol ethoxylate çözümünde PBS ilk ekleyerek 15 oranında hazırlamak FBS PBS için. Oktil fenol ethoxylate ekleyin ve çözülmeye karıştırın. 4 ° C'de mağaza
      Not: Bu çözüm içinde büyük miktarda peşin, 15 mL aliquotes-20 ° C'de depolanan ve boyama Protokolü başlatıldığında gün kullanmadan önce çözdürülen hazırlanabilir. Taze hazırlanmış veya taze çözdürülen aliquote boyama her iletişim kuralı için kullan.
   3. Çözüm yıkama: 1 litre PBS için 995.5 mL Oktil fenol ethoxylate 4.5 mL ekleyerek % 0.45 Oktil fenol ethoxylate takıma PBS hazırlamak. Çözülmeye karıştırın. Mağazada RT.
2. Dikkatle plaka üzerinden damlacıkları paslanmaz çelik kare uçlu bir spatula kullanarak kaldırın. Damlacık ilk ayırmanız kenarları merkezi kaldırma önce ve 12-şey plaka PBS 1 mL içeren bir kuyu için transfer.
   Not: Bu plaka biçimde sonrası fiksasyon, yıkama ve engelleme adımları gerçekleştirin.
3. Damlacıkları ile 1 mL buz gibi 50: 50 aseton: metanol çözeltisi ~ 1 dk (damlacıkları kenarlığını beyaz dönecek) sonrası tamir et.
   Not: aseton ve metanol sağlığı için tehlikeli olduğu gibi duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
4. 3-5 yıkar 2 ml (rehidrasyon tamamlandığında damlacıkları PBS çözümde batacağı) PBS ile durulayın.
   Not: sonrası fiksasyon sonra plastik yapışkan oldukları gibi pipet ucu damlacıkları dokunmaktan kaçının. Boyunca protokolünün, engelleme ve bu zarar ya da tamamen yok damlacıkları gibi çözümleri emme, yıkama alıyorum sonrası düzeltme, antikor, kaçının. Bunun yerine, plaka eğilme ve bir 500-5000 μL pipet kullanarak çözümler dikkatli bir şekilde çıkarın.
5. Engelleme çözüm 21,000 x g ve 4 ° C de 15 dakika santrifüj kapasitesi enkaz kaldırmak için.
   Not: Çözüm bölünmemeli 1,5 mL tüpler Santrifüjü için olabilir. Kullanılmayan çözüm 4 ° C'de saklanır ve tüm ilgili sonraki adımlar için kullanılır.
6. 500 μL damlacıkları kuluçkaya RT. 2 h için çözüm engelleme
   Not: kullanılan çözüm engelleme sesi azaltmak için plaka üzerinde bir destek yatırılabilir ve çözüm/damlacık kadar az 300 μL kullanılabilir.
7. (En az 30 μL/damlacık) birincil antikor karisimin çözüm ve santrifüj 21.000 x g de 15 dk ve 4 ° c için engelleme uygun seyreltme hazırlamak
8. (U) yuvarlak içine damlacıkları transfer-alt 96-şey plaka yuvarlak uçlu bir spatula kullanarak ve en az 30 μL/damlacık gecede 4 ° C'de birincil antikor karışımı ile kuluçkaya
9. Ertesi gün, transfer, çözüm/iyi, yıkama içeren 2 mL 12-kuyuya damlacıkları plaka durulama üç 5 dk ile ilk ve o zaman ile dokuz 30 dk yıkar yıkar. Son yıkama (2 mL), gece 4 ° C'de bırakın
10. Ertesi gün, üç kez PBS ile durulayın ve (U) yuvarlak içine damlacıkları transfer-alt 96-şey plaka.
11. Yıkama sırasında çözüm ve 21,000 x g ve 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapatmaktır fluorophore Birleşik uygun ikincil antikor karışımı (seyreltilmiş 1:500, en az 30 μL/damlacık) hazırlamak
12. Damlacıkları bir yuvarlak aktarmak (U)-alt 96-şey plaka yuvarlak uçlu bir spatula kullanarak ve ikincil antikor karışımı RT, ışıktan korunan 4 h için en az 30 μL ile kuluçkaya.
    Not: tüm sonraki incubations ve ışıktan korunan çamaşır adımları gerçekleştirin.
13. Damlacıkları 2 mL çözüm/iyi yuvarlak uçlu bir spatula, durulama üç 5 dk yıkama ile ilk kullanarak yıkama ve daha sonra dört 30 dk yıkama ile içeren 12-şey plaka içine aktarın. Son yıkama (2 mL), gece 4 ° C'de bırakın
14. Ertesi gün, beş 30 dk yıkama ile jelleri ve sonra üç kez PBS ile yıkayın. Son yıkama (2 mL), gece 4 ° C'de bırakın
15. Ertesi gün, damlacıkları bir yuvarlak aktarmak (U)-alt 96-şey plaka RT. az 30 dakika boyunca 10 μg/mL ile Höchst nükleer leke (en az 30 μL/damlacık) kuluçka tarafından yuvarlak kenarlı spatula ve counterstain çekirdeği kullanarak
    Not: 4' ile desteklenmiş orta montaj, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstaining çekirdeği için alternatif olarak kullanılabilir. Bu durumda, bu adımı ve adımı 6,16, doğrudan adıma 6.17 devam atlanır.
16. Damlacıkları PBS/iyi yuvarlak uçlu bir spatula kullanarak 2 mL içeren 12-şey plaka aktarmak ve üç kez PBS ile durulayın.
17. Mikroskop bir slayda damlacıkları aşağıdaki gibi bağlayın:
    1. Bir kare şeklindeki 22 x 22 mm coverglass kenarlarında hızlı sağlamlaştırma montaj orta dar bir tabaka uygulayın ve ~ 1 dakika kurumaya bırakın. Bu adımı her damla için ayrı ayrı, montaj orta aşırı sertleşme önlemek için uygulayın.
       Not: hızlı sağlamlaştırma montaj orta sağlığı için tehlikeli olduğu gibi duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
    2. 2 mL deiyonize su içeren bir 12-şey kalıbının kuyuya daldırma tarafından damlacığı durulayın ve yuvarlak uçlu bir spatula kullanarak bir mikroskop slayt aktarın. Fazla suyu emici kağıt küçük bir parça kullanarak kaldırın.
    3. 15 μL damlacığı sağlamlaştırma antifade montaj ortamına dağıtmak.
       Not: Eğer Höchst nükleer leke kullanılan değil, alternatif olarak, 4', içeren orta montaj 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanılabilir.
    4. Yavaşça mikroskobik slayt üzerinde damlacık karşısında hızlı sağlamlaştırma montaj orta ile kapak cam getirin ve yerleşmek izin.
       Not: Hızlı sağlamlaştırma orta mikroskobik slayt için sopa ve damlacık tutmak.
18. 6.17 bütün damlacıklar için yineleyin. İki damlacıkları her mikroskop slaytta bağlayın.
19. Slaytlar RT ~ 2 h için kurumasına ve gecede 4 ° C'de saklamak izin. Slaytları yatay olarak yerleştirilmiş ve ışıktan korunan emin olun.
20. Görüntü lekeli yerli veya son nokta FT ex vivo kültürler confocal mikroskop ya da bir optik parça işlevi ve 20 x veya 40 x amacı ile donatılmış bir dik epifluorescence mikroskop kullanarak. Doku büyük bir bölgeyi hemen yakalama kiremit işlevini kullanın.

Sonuçlar

PDR fibrovascular doku özellikleri ve protein ifade daha derin bir anlayış esas olarak vitreus örnekleri ve ince histolojik FT bölümleri^3,15,16,17güvendi. Cerrahi olarak eksize yararlanmak için biz yola 3D doku organizasyon ayrıntılı incelenmesi ve PDR, çok hücreli fizyopatolojik süreçleri için bir yöntem geliştirmek için hasta patolojik FTs e...

Tartışmalar

İlgili doku microenvironment güvenilir işlevsel hücre ve moleküler mekanik sonuçları için önemi göz önüne alındığında, bu doku ortamı sağlamak uygun deneysel modelleri bulmak için zorunludur. Burada açıklanan ex vivo PDR kültür modeli fibrin gömülü FTs için PDR patofizyolojisi mekanizmalarının incelenmesi PDR klinik örnekler yerel, karmaşık ve çok hücreli bağlamında verir.

Kritik iletişim kuralına uygun fibrin jel oluşumu, FT ve boyama sırasınd...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Microforceps	Medicon	07.60.03	Used for handling the FTs
Disposable Scalpels - Sterile	Swann-Morton	0513	Used for FT dissection
Culture dish, vented, 28 ml (60mm)	Greiner Bio-One	391-3210	Used for dissection and for testing fibrin gel formation
Cell culture plates, 12-well	Greiner Bio-One	392-0049	Used for FT dissection and whole-mount immunofluorescence
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 15 mL	Greiner Bio-One	391-3477
Reagent/centrifuge tube with screw cap, 50 mL	Greiner Bio-One	525-0384
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF	Millipore	SLGV033RS	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Syringe, 10 mL	Braun	4606108V	Used to sterile-filter the fibrinogen solution
Polypropylene Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Fisher	FB74031
Cell-Culture Treated Multidishes, 24-well	Nunc	142475	Used for casting the FT/fibrin gels for native FT characterization and ex vivo culture
Cell culture plates, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Used for whole-mount immunofluorescence
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Used for whole-mount immunofluorescence
Coverslips 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Used for mounting
Absorbent paper	VWR	115-0202	Used for mounting
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	Used for preparing 1x PBS
Fibrinogen, Plasminogen-Depleted, Human Plasma	Calbiochem	341578
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9394-500ML	Used for preparing the fibrinogen and TA solution
Fetal bovine serum	Gibco	10270106	Used for preparing the blocking solution
Human Serum	Sigma-Aldrich	H4522	Aliquoted in -20 °C, thaw before preparing the ex vivo culture media
Gentamicin Sulfate 10mg/ml	Biowest	L0011-100
Endothelial cell media MV Kit	Promocell	C-22120	Contains 500 ml of Endothelial Cell Growth Medium MV, 25 mL of fetal calf serum, 2 mL of endothelial cell growth supplement,  500 μL of recombinant human epidermal growth factor (10 μg/ mL) and 500 μL of hydrocortisone (1 g/ mL)
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Used for storage of the native and ex vivo cultured FTs. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection. Use in fume hood.
Acetone	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Used to prepare the post-fixation solution. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213	Used to prepare the post-fixation solution. TOXIC: wear protective gloves and/or clothing. Use in fume hood.
Triton X-100 (octyl phenol ethoxylate)	Sigma-Aldrich	T9284	Used for whole-mount immunofluorescence. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249	For nuclei counterstaining. HARMFUL: wear protective gloves and/or clothing, and eye and/or face protection.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Mounting medium with nuclei counterstaining. Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Eukitt Quick-hardening mounting medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Wear protective gloves and/or clothing, and eye protection. Use in fume hood.
Thrombin from bovine plasma, lyophilized powder	Sigma-Aldrich	T9549-500UN	Dissolve at 100 units/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Aprotinin from bovine lung, lyophilized powder	Sigma	A3428	Dissolve at 50 mg/ mL, aliquote and store at -20 °C, avoid repeated freeze/ thaw
Name	Company	Catalog Number	Comments
Growth factors
Recombinant human VEGFA	R&D Systems	293-VE-010	50 ng/ mL final concentration
Recombinant human VEGFC	R&D Systems	752-VC-025	200 ng/ mL final concentration
Recombinant human TGFβ	Millipore	GF346	1 ng/ mL final concentration
Recombinant human bFGF	Millipore	01-106	50 ng/ mL final concentration
Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary antibodies
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
Cleaved caspase-3 (5A1E)	Cell Signalling	9664	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
ERG (EP111)	Dako	M731429-2	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
GFAP	Dako	Z0334	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	Used at 1:1500 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	R&D Systems	AF2089	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Goat Alexa 568 Secondary Ab
NG2	Millipore	AB5320	Used at 1:100 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	Used at 1:200 dilution, Goat anti Rabbit Alexa 568 Secondary Ab
Prox1	R&D Systems	AF2727	Used at 1:40 dilution, Chicken anti Goat Alexa 594 Secondary Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore	MAB3757	Used at 1:100 dilution, Donkey anti Mouse Alexa 488 Secondary Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	Used at 1:400 dilution, Cy3 conjugated
Name	Company	Catalog Number	Comments
Secondary antibodies
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Goat Anti-Rabbit IgG	Invitrogen	A-11012	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Donkey anti-Goat IgG	Thermo Scientific	A-11057	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor568 Goat anti-Rabbit IgG	Thermo Scientific	A-11036	Used at 1:500 dilution
Alexa Fluor594 Chicken Anti-Goat IgG	Molecular Probes	A-21468	Used at 1:500 dilution
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopes
Axiovert 200 inverted epifluorescence microscope	Zeiss		For imaging of the fresh and fibrin-embedded FT
SZX9 upright dissection stereomicroscope	Olympus		For FT dissection
LSM 780 confocal microscope	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT
AxioImager.Z1 upright epifluorescence microscope with Apotome	Zeiss		For imaging of whole-mount immunostained FT