JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu kağıt bir mikrosıvısal kartuş tabanlı Kemiluminesan sistemi ve kullanışlılığı değerlendirilmesi ile serum özel immünglobulin E Anti tanılar algılamak için bir protokol sunar.

Özet

Alerjik hastalık hem yetişkinler hem de çocuklar yaygındır. Etken alerjenler tanımlaması hastalık yönetimi ve korunma önemlidir. Ancak, bir özel immünglobulin E (IgE) ölçüm sistemi yüksek fiyat-performans oranı ile anakara Çin, özellikle birinci basamak sağlık hastanelerde bulunmuyor. Bu kağıt alerjen özgü IgE serum içinde algılamak için bir mikrosıvısal kartuş tabanlı Kemiluminesan sistemi kullanarak ilke ve işlem yordamlar açıklanır. Sonuçları o--dan ImmunoCAP (sistem 1), endüstriyel standart ile karşılaştırıldı ve tekrarlanabilirlik sisteminin yaygın alerjenler için duyarlı hastalar algılamak için değerlendirdi. Sonuçlar ImmunoCAP (sistem 1) ile karşılaştırıldığında iyi hassas ve duyarlılık içinde serum özgü IgE çeşitli spreyini ve gıda alerjenleri karşı ama önemli ölçüde düşük maliyetli hafiye BioIC sistemi (sistem 2) olduğunu gösterdi. Sistem 1 daha düşük mali uygun fiyatta olan birinci basamak sağlık hastaneler anakara Çin'de iyi bir alternatif olarak hizmet verebilir.

Giriş

Alerji yaygınlığı giderek son on yıl içinde artmıştır ve1dünya nüfusunun 20-% 30 etkiliyor. Etken alerjenler tanımlaması hastalıkların yönetiminde önemli önem taşımaktadır. Çin'de kayıtlı içinde vivo cilt prick testler ülkede mevcut değildir, serum özgü IgE tüp bebek belirlenmesi en önemli ve yaygın olarak kullanılan araç için tip ı alerji beri2tanılar. Bu uygulamalar Batı dünyasında benzer, ancak rağmen ImmunoCAP sistemi (sistem 1), Floresans enzim bağlı immunosorbent temel sistemi, tüp bebek Anti tanı3altın standart olarak algılanan, Çin'deki kullanım çok nedeniyle sınırlıdır onun yüksek ekipman ve reaktif fiyat için. Bu nedenle yüksek fiyat-performans oranı ile yeni bir alternatif Anti Tanı sistemi çok gerekli.

BioIC (sistem 2) serum özgü IgE çoğaltılmış deneyleri için Kemiluminesan prensibi temel bir mikrosıvısal kartuş tabanlı sistemdir. 7 cm x 4 cm, ile bir boyutu mikrosıvısal kartuş plastik enjeksiyon kalıp üç katmandan oluşur. Termal derleme işlemleri sırasında iyi istikrar taşıyan 3 mm kalınlıkta şeffaf polikarbonat en üst kısmıdır. Akrilonitril, bütadiyen ve stiren (ABS) kopolimer inşa 3 mm kalınlığında alt tabaka ile birlikte 0,5 mm kalınlığında Orta tabaka silikon kauçuk hortumdur sandviç. Renk siyah olmak, Orta tabaka Kemiluminesan algılama sırasında alt arka plan sunar. Silika jel üzerine nitroselüloz membran (NC membran) ince bir tabaka farklı Alerjik proteinler lekelenme sağlayan reaksiyon bölgesine karşılık gelen konumundaki püskürtülür. Bu çalışmada mikrosıvısal sistem alerjen özgü IgE Serumda çoğaltılmış belirlenmesi için klinik performansını değerlendirmek etmektir.

Protokol

Bu çalışma ve insan serum numuneleri kullanımı ilk bağlı hastane Guangzhou Tıp Üniversitesi (GYYY-2016-73) Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Tüm katılımcılar kendi yazılı izni bağımsız olarak veya aileleri (durumunda çocuk) aracılığıyla verdik.

1. temel bilgiler çalışma grubu

Not: Anti bilgi deposu devlet anahtar laboratuvar, solunum yolu hastalığı (Hava-SKLRD) Guangzhou Enstitüsü solunum Hastanesi (GIRH) içinde kurulan bir büyük serum bankadır. Son on yılda başlatılan, hava SKLRD toplamak ve onların klinik bilgi (Tablo 1)4,5birlikte Alerjik hastalıkları olan hastalarda serum numuneleri depolamak başladı bile. Çalışmada sera üzerinden hava SKLRD ile gerçekleştirildi.

  1. Ocak 2015 Haziran 2018 için toplanan sera hava-SKLRD'ın veritabanını aramak ve duyarlı bölgede yaygın alerjenler bulundu hastalara alerjik hastalık ile seçin.
  2. Tüm seçili hastalar gibi alerjik rinit ve veya astım, Alerjik Dermatit ve/veya ürtiker, bağlı Alerjik hastalıklar var ve bu hastaların serum birden fazla serum alerjen özgü immünglobulin E (sIgE) içerdiğinden emin olun Bu bölgede yaygın alerjenler sistemi 1 tarafından tespit sensitizations.
  3. Eksik tıbbi kayıtları, bu takip, o kim onların serum numuneleri kullanımı için bilimsel amaçlar, bu tespit bir immün yetmezlik ile şu anda üzerlerinde immünoterapi ile ilgili onay vermeyi reddetmek için kayıp olan hastalar hariç tutmak veya immunomodulatory ajanlar, ya da bu paraziter enfeksiyonlar bulunmuştur.
  4. Hiçbir tedavi veya ilaç reçete laboratuvar bulguları girişime en aza indirmek için önce serum koleksiyonu verildi emin olun. Ölçütlerini karşılayan değil tüm serum numuneleri geri çevrildi.

2. çalışma akışı ve ölçümler ilgi

Not: 19 alerjenler belirlemek için 100 µL serum mikrosıvısal sistem ihtiyacı var. Venöz kan (5 mL) ayıran jel içeren bir vakum damar kullanarak her hastadan toplanmıştır. 1000 x g, 10 dk centrifuging sonra üst katman test etmek için toplandı. Kullanılmayan serum-80 ° C'de depolanan Test önce serum, oda sıcaklığında 30 dakika tutuldu ve bir girdap Mikser ile sarsıldı. Tekrarlanan donma-çözülme çevrimleri atlanma.

  1. Öncelikle sIgEs Dermatophagoides pteronyssinus (d1), Dermatophagoides farinae (d2), Blomia tropicalis (d201), Kedi tüyü (e1), köpek tüyü (e5), Bermuda çim (g2) tüm alerjenlere serum örnekleri test, timothy çimen) G6), hamamböceği (i6), Aspergillus fumigatus (m3), Candida albicans (m5), ragweed (w1), yumurta beyazı (f1), süt (f2), buğday (f4), fıstık (f13), soya (f14), badem (f20), (f23) Yengeç ve karides (f24). Madde 3 te verilen yönergeleri izleyin.
    Not: sIgE belirlenmesi tahlil ( Tablo reçetesigörmek) kiti ve ölçülen alerjen özgü IgE ile Kemiluminesan Çözümleyicisi tarafından yapıldı.
  2. Rastgele bir tekrarlanabilirlik çalışması için yeterli serum (en az 900 µL) ile örnekleri arasından üç örnek seçin. Değişmeden, her koşulda tutmak ölçmek üç sera alerjen sIgEs için her gün 9 gün boyunca (yani, toplam 900 x 9 = 100 µL serum).

3. yarı otomasyon sınama yordamı mikrosıvısal sisteminin

Not: Sistem 2 otomatik mikrosıvısal teknoloji, protein Mikroarray, soğuk ışık analizi, paralel IgE analizi ve görüntü işleme teknolojisi bütünleşmesidir. Sınama iletişim kuralı dört bölüme ayrılmıştır: hazırlık örnek yükleme, kuluçka ve ölçüm ekipmanları.

  1. Hazırlık ekipmanları
    1. PC ve analyzer güç aç.
      Not: Güç anahtarı bir taban üzerinde kaldı.
    2. LabIT programı PC başlatın. Karanlık çerçeve uyarı penceresi açılır kaçak testiçalıştırmak için Tamam ' ı tıklatın. Daha sonra işlemi arabirimi girmek için merkezi Logo'yu tıklatın.
      Not: Sistem daha 24 h için boşta kalırsa kaçak testi çalıştırmak için kullanıcı hatırlatacaktır.
    3. Reaksiyon Temp ve CCD (şarj kuplajlı cihaz) Temp ekranın sağ alt köşesindeki kontrol edin. Reaksiyon Temp yükselmesi gereken 37 ° C ± 1 ° C yaklaşık 10 dakika içinde ve CCD Temp bırak-15 ° C ± 1 ° c
    4. CCD Temp düştü sonra-15 ° C ± kaçak testi çalıştırmak 1 ° C. KAÇAK testi çalıştırmadan önce araç içinde yaptı diğer öğe yok emin olun ve kapıyı kapatın. Araçlar ' ı | Sistem Test | Kaçak testi. Test sırasında kapıyı açmayın. Test tamamlandığında, rapor penceresi açılır.
  2. Örnek yükleme
    1. Yıkama arabellek, 120 µL engelleme arabelleği, 60 µL conjugates A ve B, substrat A ve B, 60 µL ve 100 µL serum örneklerinin, 620 µL mikrosıvısal kartuş karşılık gelen reaktif tankındaki ekleyin.
  3. Kuluçka
    1. Kartuş kimliğitıklatın, barkod tarayıcı kartuşu seri numarasını inceden inceye gözden geçirmek, örnek kimliği girin, kartuşu çözümleyicisine koymak ve kapıyı kullanmak ve analizi başlatmak için Analyzer'ı ve Çalıştır ' ı tıklatın.
  4. Ölçüm
    1. İstatistiksel yazılım (örneğin, Excel) sonuçlarına ölçümün sonra verin.
      Not: 30 dk, kuluçka sonra analyzer otomatik olarak ölçüm gerçekleştirir ve sonucu raporlar.
  5. Uzakta-in belgili tanımlık çözümlemek arasında geçiş yapma
    1. Testi bitirdikten sonra rutin bakım için kartuşu çıkarın ve Çözümleyicisi'nin iç Isıtma demir ve elektromıknatıs % 75 alkolle hafifçe silin.
      Not: Değil zor tuşuna basın veya elektromıknatıs sallamak.
    2. LabIT penceresini kapatın. Sıcaklık izleme penceresi açılır. 5 ° C koruma moduna CCD ısıtır zaman otomatik olarak kapanır. O zamana kadar çözümleyici ve PC kapanma kapatmanın güvenli olacaktır.
      Not: el ile derece CCD Temp 5 ° C-arttı önce İzleme penceresini kapatmayın ve belgili tanımlık çözümlemek ne de PC kapanma sırasında CCD ısınma dönüş yapmak.

4. sIgE reaktivite tanımını

Not: bir su katılmamış serum numune için algılama sistemi 2 0.21 – 100 aralığıdır IU/mL.

  1. 0,35 IU/mL eşik değeri temel alınarak, pozitif6,7olmak 0,35 IU/mL aşan bir sIgE düzeyi göz önünde bulundurun. SIgE testleri reaktivite8olarak oranı: sınıf 1 (≥0.35 ve < 0.70 IU/mL), sınıf 2 (≥0.70 ve < 3.50 IU/mL), sınıf 3 (≥3.50 ve < 17.50 IU/mL), sınıf 4 (≥17.50 ve < 50.00 IU/mL), sınıf 5 (≥50.00 ve < 100.00 IU/mL) ve toplumsal sınıf 6 (≥100.00 IU/mL).

5. istatistiksel analiz

  1. Bir çubuk grafik 19 Allerjenler (şekil 1) pozitif oranı göstermek ve Levey-Jennings eğrisi algılama sistemi (Şekil 2)9tekrarlanabilirlik göstermek için kullanmak için kullanın.
  2. Üç en yaygın soluk çeken alerjenler ve gıda alerjenleri (toplamda altı alerjenler) seçin ve ben sistemi 1-klinik tanı performans10,11değerlendirmek için sonuçlar karşılaştırın. Uyum oranı, duyarlılık, özgüllük, pozitif ve negatif öngörü değerleri ve alıcının karakteristik (ROC) eğrisi (AUC) değerlendirme kriterleri faaliyet alanında bulunmaktadır.
  3. İki sistem arasında korelasyon açıklayan ve tutarlılık için kappa değeri kullanmak için Spearman'ın korelasyon analizi12 uygulanır. Kappa değeri olarak neredeyse kategorize mükemmel (0.8-1.0), önemli (0,6-0,8), orta (0.4-0.6), Fuarı (0,2-0,4) veya fakir (< 0,2)13. SPSS 23.0 ve MedCalc 11.0 istatistik analiz kullanın ve P tanımla < 0,05 olarak istatistiksel anlamlılık.

Sonuçlar

19 yaygın alerjenler için olumlu oranları
293 sera sonuçlarına şekil 3' te gösterilmektedir. Tüm soluk çeken alerjenler arasında D. farinae en yüksek pozitif oranı vardı (%80.89, 273/293), ö. tarafından takip Pteronyssinus (%78.84, 231/293). Gıda alerjenleri arasında yengeç en yüksek pozitif oranına sahip (%20.48, 60/293), %13.65 (40/293) karides için takip. Toplam pozitiflik oranı için sol...

Tartışmalar

Benzer sonuçlar için birçok diğer çalışmalar15,16,17, sera o evi gösterdi 293 Alerjik hastaların temel mikrosıvısal sistem sonuçlarından toz akarları ( D. pteronyssinus, dahil olmak üzere Ö farinaeve B. tropicalis) olan Çin'in güneyinde, alerjik hastalık ise gıda, süt, fıstık, karides ve yengeç olan Alerjik belirtiler neden yaygın alerjenler önde gelen ana soluk çeken alerje...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Profesör Mei Jiang istatistiksel analiz onun yardım ve Bay Hammer Tsui yazının hazırlanmasında teşekkür ederiz. Bu çalışmada Guangzhou bilim ve teknoloji Vakfı (201804020043) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (NSFC 81572063 ve NSFC 81802076) tarafından desteklenmiştir. Finansman grupları çalışma tasarımı, veri analizi, el yazması hazırlama ve yayınlama kararı ile kabul etti. Hiçbir diğer finansman bu çalışma için alındı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Agnitio BioIC AnalyzerAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)BA-G2000
BioIC Allergen specific-IgE Detection KitAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)DR17A12
BioIC Cartrideg Placement plateAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)T20SET
BioIC Reagent DispenserAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)DS-1
Image two-dimensional barcode machineAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)NLS-HR200
Software Package, LabITAgnitio Science & Technology(Taiwan, China)Version 2.4.12
VORTEX-5 Vortex MixerHaimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd.VORTEX-5

Referanslar

  1. Kamble, S., Bharmal, M. Incremental Direct Expenditure of Treating Asthma in the United States. Journal of Asthma Research. 46 (1), 73-80 (2009).
  2. Paganelli, R., et al. Specific IgE antibodies in the diagnosis of atopic disease. Clinical evaluation of a new in vitro test system, UniCAP, in six European allergy clinics. Allergy. 53 (8), 763-768 (1998).
  3. Wang, J., Godbold, J. H., Sampson, H. A. Correlation of serum allergy (ige) tests performed by different assay systems. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (5), 1219-1224 (2008).
  4. Sun, B., Zheng, P., Wei, N., Huang, H., Zeng, G. Co-sensitization to silkworm moth (Bombyx mori) and 9 inhalant allergens among allergic patients in Guangzhou, Southern China. PLoS ONE. 9 (5), e94776 (2014).
  5. Zeng, G., et al. Component-Resolved Diagnostic Study of Dermatophagoides Pteronyssinus Major Allergen Molecules in a Southern Chinese Cohort. Journal of Investigational Allergology & Clinical Immunology. 25 (5), 343-351 (2015).
  6. Luo, W., et al. grass pollen allergens and components detected in a southern Chinese cohort of patients with allergic rhinitis and/or asthma. Molecular Immunology. 78 (2016), 105-112 (2016).
  7. Zeng, G., et al. Longitudinal profiles of serum specific IgE and IgG4 to Dermatophagoides pteronyssinus allergen and its major components during allergen immunotherapy in a cohort of southern Chinese children. Molecular Immunology. 74 (2016), 1-9 (2016).
  8. Lee, J. H., et al. Specific IgE measurement using AdvanSure(R) system: comparison of detection performance with ImmunoCAP(R) system in Korean allergy patients. Clinica Chimica Acta. (9-10), 914-919 (2012).
  9. Eckels, J., et al. Quality control, analysis and secure sharing of Luminex(R) immunoassay data using the open source LabKey Server platform. Bmc Bioinformatics. 14 (1), 145 (2013).
  10. Bland, J. M., Altman, D. G. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet. 327 (8476), 307-310 (1986).
  11. Carletta, J. Assessing Agreement on Classification Tasks: The Kappa Statistic. Computational Linguistics. 22 (2), 249-254 (1996).
  12. Shyur, S. D., et al. Determination of multiple allergen-specific IgE by microfluidic immunoassay cartridge in clinical settings. Pediatric Allergy and Immunology. 21, 623-633 (2010).
  13. Cesana, B. M., Antonelli, P., Gallazzi, E., Marino, A. Comparison of measurement methods: an endless application of wrong statistical methods. Intensive Care Medicine. 37 (6), 1038-1040 (2011).
  14. Park, K. H., Lee, J., Sim, D. W., Lee, S. C. Comparison of Singleplex Specific IgE Detection Immunoassays: ImmunoCAP Phadia 250 and Immulite 2000 3gAllergy. Annals of Laboratory Medicine. 38 (1), 23-31 (2018).
  15. Teppo, H., Revonta, M., Haahtela, T. Allergic rhinitis and asthma have generally good outcome and little effect on quality of life - a 20-year follow-up. Allergy. 66 (8), 1123-1125 (2011).
  16. Fischer, J., et al. Prevalence of type I sensitization to alpha-gal in forest service employees and hunters. Allergy. 72 (10), 1540-1547 (2017).
  17. Li, J., et al. A multicentre study assessing the prevalence of sensitizations in patients with asthma and/or rhinitis in China. Allergy. 64 (7), 1083-1092 (2009).
  18. Ahlstedt, S. Understanding the usefulness of specific IgE blood tests in allergy. Clinical & Experimental Allergy. 32 (1), 11-16 (2002).
  19. Wood, R. A., Segall, N., Ahlstedt, S., Williams, P. B. Accuracy of IgE antibody laboratory results. Annals of Allergy Asthma & Immunology. 100 (2), 288-289 (2008).
  20. Aberer, W., Kränke, B., Hager, A., Wick, G. In vitro allergy testing needs better standardization--test results from different laboratories lack comparability mostly due to missing effective standards. International Archives of Allergy & Immunology. 108 (1), 82-88 (1995).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 146biochiphavacilikBioICbelirli IgEAntitan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır