JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fare mesane tümörleri N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine kanserojen (BBN) ile indüklenen vardır. Mesane tümörü üretimi türdeş olmayan; Bu nedenle, tümör yükünü doğru bir değerlendirme randomizasyon deneysel tedavi için önce gereklidir. Burada tümör boyutu ve sahne değerlendirmek için bir hızlı, güvenilir MRI protokol mevcut.

Özet

Fare mesane tümörü modelleri yeni tedavi seçenekleri değerlendirme için kritik öneme sahiptir. Çünkü onlar yakından insan Tümörlerinin genomik profilleri çoğaltma ve hücre modelleri ve xenografts farklı olarak, sağladıkları, mesane tümörleri N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (BBN) kanserojen ile indüklenen hücre satır-tabanlı modeller üzerinde avantajlı bir immunotherapies incelenmesi için iyi fırsat. Ancak, mesane tümörü üretimi türdeş olmayan. Bu nedenle, tümör yükünü doğru bir değerlendirme randomizasyon deneysel tedavi için önce gereklidir. Burada açıklanan bir BBN fare modeli ve mesane kanseri tümör yükünü vivo içinde hızlı ve güvenilir manyetik rezonans (MR) sırası (gerçek FISP) kullanılarak değerlendirmek için iletişim kuralı olduğunu. Ultrason, aksine Bay operatör bağımsızdır ve basit sonrası edinme görüntü işleme ve gözden geçirme için sağlar çünkü bu basit ve güvenilir bir yöntemdir. Mesane eksenel görüntüleri kullanarak, ilgi mesane duvar ve tümör bölgelerinde analizini mesane duvar ve tümör alan hesaplama için izin verir. Bu ölçüm ex vivo mesane ağırlık ile karşılıklı olarak ilişkilendirir (rs0,37, p = 0,009 =) ve tümör sahne (p = 0,0003). Sonuç olarak, BBN immunotherapies değerlendirilmesi için idealdir türdeş olmayan tümörler oluşturur ve MRI hızlı ve güvenilir bir şekilde tümör yükünü randomizasyon deneysel tedavi silah için önce değerlendirmek.

Giriş

Mesane kanseri en sık beşinci kanser olduğunu genel olarak, yaklaşık 80.000 yeni olgu ve 20171Amerika Birleşik Devletleri'nde 16.000 ölümlerin sorumlu. Mesane kanseri2sistemik tedavisinde önemli gelişmeler olmadan yaklaşık 30 yıl sonra heyecan verici ve zaman zaman dayanıklı yanıt-e doğru gelişmiş hastalarda son anti-PD-1 ve anti-PD-L1 denetim noktası inhibitörü denemeler göstermiştir ürotelyal Karsinomu3,4,5. Ancak, hastaların sadece yaklaşık % 20 bu tedaviler için objektif bir tepki göstermek ve daha fazla çalışmalar mesane kanseri olan hastalarda immünoterapi etkin kullanımı genişletmek için ihtiyaç vardır.

Fare mesane kanseri modelleri yeni tedaviler6,7preklinik değerlendirilmesi önemli araçlardır. Tümör boyutu için fareler farklı tedaviler için rastgele denetlemek için tümör yükünü değerlendirildi ve tedavi grupları arasında kontrollü. Önceki çalışmalarda ultrason veya bioluminescence orthotopic hücre satır-tabanlı mesane kanseri modelleri8,9,10,11değerlendirmek için kullanmış. Ancak, her iki tekniğin de çeşitli dezavantajları mevcut. Ultrason ölçümleri ve operatör becerileri ile etkiledi üç boyutlu özellikleri ve yüksek Uzaysal çözünürlük eksikliği. Bioluminescence yöntemleri sadece tümör hücreleri yarı kantitatif değerlendirilmesi sağlayabilir ve mesane Tarihçe görselleştirme için izin vermez. Ayrıca, bioluminescence tüysüz fareler veya fare ile beyaz ceket kollarındaki genlerinde hızlı hücre satır-tabanlı modelleri ile yalnızca kullanılabilir.

Manyetik rezonans görüntüleme (MRG), öte yandan, geniş bir doğru görselleştirme sağlar doku kontrast ve tümör yükünü kantitatif değerlendirilmesi sergilenmesi anatomik görüntüleri yüksek çözünürlüklü edinimi benzersiz esneklik sunar Kollarındaki özellikleri hızlı gerek kalmadan. Bay görüntüleri uygun analiz boru hatları ile daha kolay tekrarlanabilir ve 3-b görsel olarak mesane garanti. En büyük Mr incelenmesi ve ilgili yüksek maliyetler yüksek işlem hacmi deneyleri sınırlamak için gerekli süreyi sınırlamalardır. Ancak, birçok araştırma Bay dizileri etkin bir şekilde algılamak ve hücre satır-tabanlı mesane tümörleri izlemek için kullanılan yüksek kaliteli tanılama görüntüleri sağlayabilir göstermiştir; Böylece, yüksek üretilen iş analizi9,12için kullanılabilir.

Burada, güvenilir ve verimli bir şekilde kanserojen kaynaklı mesane tümörleri farelerde karakterize etmek için non-invaziv bir Bay tabanlı yöntemi açıklanmaktadır. Bunu yapmak için biz bir hızlı görüntüsü sağlarken hala yüksek kaliteli ve yüksek Uzaysal çözünürlük (~ 100 mikron) kısa tarama oturumları garanti kararlı duruma devinim Bay tekniği ile (gerçek FISP), algılama ve mesane ölçümü için kullanmak tümör13. Ayrıca, bu non-invaziv MRI tahlil doğruluğunu onaylamak için biz MRI kaynaklı parametreleri ve ex vivo mesane ağırlık gibi patolojik olarak teyit tümör sahne arasındaki ilişki tanımlamak.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Northwestern Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. indüksiyon tümörler BBN ile

  1. Erkek C57/BL6 fareler, her en az 6 hafta eski edinin.
    Not: Erkek farelerde mesane kanseri daha hızlı ve dişi fareler14,15' ten sürekli olarak geliştirmek.
  2. N-nitrosobutyl(4-hydroxybutyl) Amin (BBN) % 0.05 bir doz içme suyu ekleyin. Opak bir kapta saklayın ve fareler16içme suyu olarak ad libitum sağlar.
    Not: BBN çözüm açık bir kap içinde saklamak kanserojen17düşer.
  3. Haftada iki kez % 0.05 BBN su değiştirin.
  4. Hayvanlar hematüri, firma mesane ve kitleler de dahil olmak üzere mesane tümörleri ile ilişkili sıkıntının işaretleri inceleyerek izlemek. Haftada iki kez veya yerel IACUC yönergelere uygun olarak fareler bakarak kontrol edin.
  5. Pozlama1816 ve 24 hafta arasında geliştirmek tümörler bekliyoruz.

2. Mr Kur

  1. Steril serum fizyolojik bir Subkutan Enjeksiyon gerçekleştirmek (0,1-0,2 mL 25-27 G iğne ve 1 mL şırınga kullanarak) mesane dolum kolaylaştırmak için MRG önce 10 dak.
  2. Her fare %100 O2 ve isoflurane (% 2-%4 gerektiği gibi) gaz karışımı ile anestezi. Anestezi yeterli bir uçak devam etmeden önce para çekme refleks (ayak tutam) sınayarak doğrulayın. Steril göz merhem hayvan için geçerlidir.
  3. Fare inhale isoflurane (% 0,5-%3) teslim etmek için bir nosecone ile outfitted görüntüleme tutucu aktarın.
  4. Vücut ısısı ve fizyolojik kayıt bilgisayara bağlı bir rektal sıcaklık probu kullanılarak solunum izlemek.
    Not: Normal vücut ısısı (36-37 ° C) hayvan Bay tutucu inşa dolaşım sıcak su devresi kullanarak korunur. Sıcaklık rektal algılayıcı ile ölçülmüş ve fizyolojik izleme bilgisayarda adanmış fizyolojik izleme yazılımı kullanarak kaydedildi. Aynı sistem göğüs kafesi ve 3-kurşun Elektrokardiyogram elektrotlar yoluyla pnömatik yastık ile ölçülen solunum ve Elektrokardiyogram sinyalleri kaydetmek için kullanılır. Solunum sinyal de MRI edinme tetikleme ve solunum hareket ile ilişkili yapıların azaltılması için kullanılır.

3. Mr resim alma

  1. Kadrat vücut bobin uyarma için kullanmaktadır.
  2. 4 kanallı alıcı bobini alt karın ilgi bölgesinden gelen sinyallerin en iyi duruma getirilmiş algılamasını etkinleştirmek için taranan fare yerleştirin.
  3. Fotoğraf tüm fare vücudun tri-Aksiyel bir dizi elde etmek için entegre düşsel bilgisayar yazılımı aracılığıyla otomatik ayarlamalar başlatın. Bu görüntülerin başvuru kümeden faiz (Bu durumda, mesane bölge) bölgesi tanımlayın.
  4. Üç farklı referans radyolojik kare kullanarak Aksiyel, koronal ve sagittal uçaklar boyunca dik dilimlenmiş görüntülerin elde etmek.
  5. Aşağıdaki Bay parametreleri ile sıralı (tümleşik görüntüleme yazılımındaki özelliklerinden biri olarak dahil) görüntüleme doğru FISP kullanmak: TR 900 = MS, TE 2 ms, SK = = 70, 14 ortalamalar.
    Not: T1/T2 ağırlığı dahil olmak üzere tanılama kaliteli, hızlı görüntüleme için bu parametre kümesi sağlar < fare başına 10 dak.
  6. Uzamsal çözünürlük ve dilim kalınlığı geometrik parametreler entegre görüntüleme platformu grafik arabirimi ile kullanıcı tarafından seçilen göre belirlenir. Bu bir uçak-Çözünürlük 0,148 mm ile 0,5 mm kalınlıkta mesane tüm genelinde dilimleri bir dizi olur.

4. Bay görüntü analizi

  1. 0.5 mm kalınlığında dilimler ve uçak-Çözünürlük 0,148 tüm mesane kapsayan mm kümesi tanımlar.
  2. Tıbbi görüntü analizi yazılım için analiz biçiminde karşılık gelen görüntüleri ile klasörü seçerek verin.
  3. "Temsilcisi Aksiyel görünümü" mesane nicel analiz Merkezi tarafından oluşturulan resimlerle kaydırma ve mesane, mesane duvar ve Lümen görselleştirme için izin veren Orta noktayı, bir dilim tanımlama seçin.
    Not: Merkezi dilim en büyük çapı ile seçilmiş kişi olmalıdır.
  4. Dikkatli bir şekilde el ile mesane (BLAdışarı) dış kenarındaki ve mesane (BLAiçinde) Lümen iç etrafında sınırları izini sürerek faiz (ROI) bölge betimlemek (bkz. Şekil 2şematik ve temsilcisi resimler) Seçili temsilci Aksiyel görünümünde.
  5. Mesane duvarının yüzey alanı hesaplamak için dış kenarından iç Lümen çıkarma.
    Duvar BLA BLAdışarı - BLAiçinde =
    Not: Bir denetim mesane tümör ile yüzey alanı mesane tümörlü daha az olacağı tahmin edilmektedir.

5. ötenazi ve mesane diseksiyon

  1. BBN maruz kalma 20 hafta sonra standart işletim yordamlar uygun olarak yerel IACUC yönergeleri kullanarak fare ötenazi.
  2. Kesi ile % 70 etanol, alanı temizleyin sonra kavramak ve Forseps ile karın duvarı cilt kaldırın.
  3. Bir ensizyon gelen kasık symphysis xiphoid işlemi için yapmak.
  4. Keskin Periton boşluğuna Forseps ile açgözlü ve makasla incising deşmek.
  5. Orta çizgi alt karın içinde yer alan mesane tanımlayın.
  6. Tanımlamak ve göbek ve karın duvarı mesane kubbe bağlanma medyan Umbilikal ligament kesti.
  7. Mesane kubbe countertraction sağlamak ve yapıları, seminal veziküller, rektum ve yağ gibi çevreleyen uzak mesane incelemek için Forseps ile kavramak.
  8. Mesane girerek üreter tanımlamak ve mesane yakın makas ile kesme.
  9. Mesane cephalad kaldırma, üretra makasla kesmek ve mesane kaldırın.
  10. Hemen mesane PBS ile durulama sonra tartın.

6. histolojik muayene mesane doku

  1. Mesane doku % 10 tarafsız tampon formalin 36-48 h, oda sıcaklığında (RT) için fix.
  2. Doku parafin blok içinde katıştırma, slayt sonraki sınav için kesme ve Hematoksilen ve Eozin mikroskobik inceleme için kaydıraklı leke19,20daha önce açıklandığı gibi.
  3. Fare mesane düşük mikroskobik incelenmesi gerçekleştirmek (2.5 x ve 10 x) ve yüksek (20 x ve 40 x) büyütme, makroskopik lezyonlar, Hiperplazi, in situKarsinom, papillomas, Papiller tümörler ve invaziv neoplazmlar19 için incelenmesi , 21.

Sonuçlar

Açıklanan (şekil 1) iletişim kuralını kullanarak, C57/B6 erkek farelerde mesane tümörleri indüklenen. MRI 16 haftalıkken gerçekleştirilmiş ve fareler 20 hafta euthanized. Ex vivo mesane ağırlık (BW) her fare için kaydedildi. Slaytlar Hematoksilen ve Eozin ile lekeli ve tüm Histoloji slaytlar için tümör sahne incelendi.

Bay kullanarak tümör yükünü analiz etmek, mesa...

Tartışmalar

Tümör modellerin doğru görüntüleme uygun öncesi ötenazi evreleme ve deneysel tedavi başlangıcından önce hayvan randomizasyon için gereklidir. Burada sunulan işlemi uygulayarak, biz (1) mesane tümörleri BBN kanserojen kullanarak oluşturmak ve (2) mesane tümörü yük MR. bir Bay türetilen alan ölçüm (BLAduvar) ilişkilendirir önemli ölçüde ile kullanılarak tabakalaşmak için metodoloji göstermek ex vivo mesane ağırlık ve patolojik tümör sahne alanı ile ilişkilidir.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

J. J. M. Gazi sağlık yönetim hak tarafından finanse edilen BX0033692-01 vermek. J. J. M. de kanser araştırma Robert H. Lurie kapsamlı Kanser Merkezi, Northwestern Üniversitesi'nde John P. Hanson Vakfı tarafından desteklenmektedir. Biz Merkezi translasyonel görüntüleme için MRG edinme sağlayan ve işleme için teşekkür ederiz. Finansman kaynakları el yazması veya yayın için göndermek için karar yazılı olarak herhangi bir rolü yoktu.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6 miceThe Jackson Laboratory664Mice
N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine carcinogen (BBN)TCI AmericanB0938Carcinogen
0.9% normal salineHospira, IncNDC 0409-488-02
IsofluranePiramal HealthCare60307-120-25Anesthetic
7Tesla ClinScan MRIBrukerNADedicated Small Animal Imaging MRI
SyngoSiemensNAMR Integrated Imaging Software
Model 1030 Monitoring & Gating SystemSmall Animal Instruments, Inc. (SAII)NASmall animal physiologic monitoring
Formalin, Neutral Buffered, 10%SigmaHT501128Fixative
Eosin YFisher ScientificNC1093844Histologic staining agent
HematoxylinFisher Scientific23-245651Histologic staining agent
Jim7Xinapse SystemsNAMedical image analysis software
GraphPad Prism v7.04GraphpadNAGraphing software
R v3.4.2The R Project for Statistical ComputingNAStatistical software
R package pROC v1.10.0.The R Project for Statistical ComputingNAROC analysis

Referanslar

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Abdollah, F., et al. Incidence, survival and mortality rates of stage-specific bladder cancer in United States: a trend analysis. Cancer Epidemiology. 37 (3), 219-225 (2013).
  3. Rosenberg, J. E., et al. Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. The Lancet. 387 (10031), 1909-1920 (2016).
  4. Sharma, P., et al. Nivolumab monotherapy in recurrent metastatic urothelial carcinoma (CheckMate 032): a multicentre, open-label, two-stage, multi-arm, phase 1/2 trial. The Lancet Oncology. 17 (11), 1590-1598 (2016).
  5. Bellmunt, J., et al. Pembrolizumab as Second-Line Therapy for Advanced Urothelial Carcinoma. New England Journal of Medicine. 376 (11), 1015-1026 (2017).
  6. Chan, E., Patel, A., Heston, W., Larchian, W. Mouse orthotopic models for bladder cancer research. BJU International. 104 (9), 1286-1291 (2009).
  7. Zhang, N., Li, D., Shao, J., Wang, X. Animal models for bladder cancer: The model establishment and evaluation (Review). Oncology Letters. 9 (4), 1515-1519 (2015).
  8. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75 (4), 799-804 (2010).
  9. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. The Journal of Urology. 145 (6), 1297-1301 (1991).
  10. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU International. 101 (1), 120-124 (2008).
  11. Vandeveer, A. J., et al. Systemic Immunotherapy of Non-Muscle Invasive Mouse Bladder Cancer with Avelumab, an Anti-PD-L1 Immune Checkpoint Inhibitor. Cancer Immunology Research. 4 (5), 452-462 (2016).
  12. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. Journal of Urology. 170, 1375-1378 (2003).
  13. Chung, H. W., et al. T2-weighted fast MR imaging with true FISP versus HASTE: comparative efficacy in the evaluation of normal fetal brain maturation. American Journal of Roentgenology. 175 (5), 1375-1380 (2000).
  14. Miyamoto, H., et al. Promotion of bladder cancer development and progression by androgen receptor signals. Journal of the National Cancer Institute. 99 (7), 558-568 (2007).
  15. Bertram, J. S., Craig, A. W. Specific induction of bladder cancer in mice by butyl-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine and the effects of hormonal modifications on the sex difference in response. European Journal of Cancer. 8 (6), 587-594 (1972).
  16. Nagao, M., et al. Mutagenicity of N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine, a bladder carcinogen, and related compounds. Cancer Research. 37, 399-407 (1977).
  17. Hirose, M., Fukushima, S., Hananouchi, M., Shirai, T., Ogiso, T. Different susceptibilities of the urinary bladder epithelium of animal species to three nitroso compounds. Gan. Gann; The Japanese Journal of Cancer Research. 67 (2), 175-189 (1976).
  18. Shin, K., et al. Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma. Nature Cell Biology. 16 (5), 469-478 (2014).
  19. Epstein, J. I. Chapter 17: Immunohistology of the Bladder, Kidney, and Testis. Diagnostic Immunohistochemistry. , 624-661 (2019).
  20. Cohen, S. M., Ohnishi, T., Clark, N. M., He, J., Arnold, L. L. Investigations of rodent urinary bladder carcinogens: collection, processing, and evaluation of urine and bladders. Toxicologic Pathology. 35 (3), 337-347 (2007).
  21. Wood, D. P. Tumors of the bladder. Campbell-Walsh Urology. 11 (92), 2184-2204 (2016).
  22. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nature Reviews Cancer. , (2016).
  23. Kaneko, S., Li, X. X chromosome protects against bladder cancer in females via a KDM6A-dependent epigenetic mechanism. Science Advances. 4 (6), eaar5598 (2018).
  24. Smilowitz, H. M., et al. Biodistribution of gold nanoparticles in BBN-induced muscle-invasive bladder cancer in mice. International Journal of Nanomedicine. 12, 7937-7946 (2017).
  25. Dai, Y. C., et al. The interaction of arsenic and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine on urothelial carcinogenesis in mice. PLoS One. 12 (10), e0186214 (2017).
  26. Williams, P. D., Lee, J. K., Theodorescu, D. Molecular Credentialing of Rodent Bladder Carcinogenesis Models. Neoplasia. 10 (8), (2008).
  27. Fantini, D., et al. A Carcinogen-induced mouse model recapitulates the molecular alterations of human muscle invasive bladder cancer. Oncogene. 37 (14), 1911-1925 (2018).
  28. . NCCN Guidelines in Clinical Oncology - Bladder Cancer 5.2018 Available from: https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/bladder.pdf (2018)
  29. Costa, M. J., Delingette, H., Novellas, S., Ayache, N. Automatic segmentation of bladder and prostate using coupled 3-D deformable models. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention. 10 (Pt 1), 252-260 (2007).
  30. Rosenkrantz, A. B., et al. Utility of quantitative MRI metrics for assessment of stage and grade of urothelial carcinoma of the bladder: preliminary results. American Journal of Roentgenology. 201 (6), 1254-1259 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser ara t rmalarsay 145idrar kesesi neoplazmlarmanyetik rezonans g r nt lemekanserojenfarelerBBNmesane kanseri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır