Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Özet

Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.

Özet

2D hücre kültürü sistemlerinin çeşitli sınırlamaları, canlı dokuların uzamsal ve kimyasal karmaşıklığını daha iyi taklit eden ve in vivo doku fonksiyonlarını taklit etmek üzere 3D hücre kültürü ve analiz platformlarına ilgi uyandırdı. Mikrofabrikasyon teknolojilerinde son gelişmeler, hücrelerin iyi tanımlanmış bir ekstrasellüler matrisin (ECM) ve tanımlanan çözünür veya matris ilişkili biomolecules setine entegre edilebilir 3D in vitro ortamlarda gelişimini kolaylaştırmış. Ancak teknolojik engelleri araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanımı sınırlıdır. Burada, 3 boyutlu kültür ve hücre ile deney için basit cihazlar oluşturmak için bir yöntem tarif ve 3D mikro ortamlarda çok hücreli organoids tanımlı bir kemoçekici gradyan ile. Biz bu platformun epitelyal hücrelerin ve organoidlerin epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörlerinin degradelere tepkisini analiz etmek için kullanımını göstermektedir. EGF degradeler, meme organoidlerde yönlendirilmiş şube oluşumuna yol açan birkaç gün boyunca cihazlarda istikrarlı oldu. Bu analiz bize hücre grupları tarafından toplu degrade algılama daha hassas vs tek hücreler sonucuna izin verdi. Ayrıca fotolitografi tesisleri veya gelişmiş yumuşak litografi teknikleri gerektirmeyen imalat yöntemini de tarif ediyoruz. Bu yöntem, kanser dahil olmak üzere kalkınma ve patolojik devletlerin Analizi bağlamında 3D hücresel davranışları incelemek için yararlı olacaktır.

Giriş

Fizyolojik ortamda, hücreler, bir ekstrüle matrisine (ECM) gömülür ve bir bolluk biomolecules maruz kalır. Hücreler ve çevredeki mikroçevre arasındaki etkileşimler, göç, büyüme, farklılaşma ve hayatta kalma dahil olmak üzere farklı phenotypes kontrol hücre içi süreçleri düzenleyen^1,2. Konvansiyonel 2D hücre kültüründe hücresel davranışlar hakkında çok şey öğrenildi. Ancak, 3D Hidrojeller gömülü hücreler ile intravital görüntüleme ve deneme gelişiyle, hücre davranışları önemli farklar Basitleştirilmiş 2D in vitro kültürler vs 3D doku benzeri ortamlar tanınmıştır. Hücreler ECM lifleri ile etkileşime girirken ve 3D matriks içindeki mekanik özelliklerini hissederken, jelin malzeme sertliği 2D in vitro sistemde tam bağımsız bir değişken değildir. Ölçümlendirme, fokal yapışma oluşumunu değiştirir, farklı hücre morfolojisi ve davranışları ile sonuçlanır. Ayrıca, 2B yüzeydeki hücreler, 3B 'de tüm yönlere açık olan hücrelerden daha az sinyal verme ipuçları ortaya çıkar.

Bu sınırlamalar, yaşam dokularının uzamsal ve kimyasal karmaşıklığı temsil eden ve daha iyi in vivo doku fonksiyonları tahmin 3D sistemlerin çıkarlarını artmıştır. Bunlar, ECM^3,4' te rasgele serpiştirilmiş hücrelere Self-montajı hücresel mikroyapıları olarak organoids birçok formda geliştirilmiştir. Microimalat teknolojileri son gelişmeler 3D kültür sistemleri^{5,6, 7,8,9} çeşitli türleri gelişlerini kolaylaştırmış fenotipik değişiklikler ve incelemek için çözünür sinyallere hücresel tepkiler; Ancak teknolojik bariyerler araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanımı sınırlandırmaktadır. Birçok durumda, imalat süreçleri fotolitografi teknikleri ve yumuşak litografi için arka plan bilgiler gerektirir. Dahası, bir cihaz inşa etmek ve uzun bir süre boyunca cihazın optimum fonksiyonunu elde etmek için çeşitli faktörler kontrol edilmelidir.

Yöntemimiz, hücreleri ve çok hücreli organoidleri tanımlanan kemoçekici degradelerle 3B mikro ortama birleştirmek ve ardından EGF¹⁰' a epitelyal yanıtları analiz etmek IÇIN 3B PDMS cihazının nasıl oluşturulacağını açıklar. Verilerimiz, yüzeysel EGF degradelere yanıt vermek için organoidlerin kapasitesinin, hücre içi kimyasal bağlamanın Gap kavşakla ortaya çıkması anlamına gelmiştir. Zayıf ve gürültülü uzamsal olarak dereceli girişlerin daha kesin tespiti için organoidlerin potansiyelini göstermektedir. İmalat süreci temiz oda tesisi veya fotolitografi teknikleri gerektirmez. Ancak, 3D PDMS cihaz 3D fizyolojik çevre gerekli faktörleri içerir. Bu yöntem 3D hücresel davranışlarını incelemek için yararlı olacaktır ve farklı hücre tipleri, kemoçekiciler ve ECM kombinasyonları ile büyük bir araştırma potansiyeline sahiptir.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanan protokollere uygun olarak yapılmıştır.

1. mezofluidik cihazın imalatı

1. 3D CAD yazılımı kullanarak PDMS cihazı için kalıp maskesini Tasarla.
2. Isıl dirençli reçine ile stereolitografi ekipmanlarını kullanarak kalıbı yazdırın.
   Not: burada açıklanan prosedürler ticari 3B baskı hizmeti tarafından gerçekleştirilmiştir.
3. 10:1 oranında kür ajanı ile bir PDMS monomer çözümünü iyice karıştırın. Cihazın imalatı için 3 mL PDMS karışımı gereklidir. Toplam hacim imal edilecek kalıplar sayısına bağlıdır.
4. 1 saat boyunca bir vakum kurutucu içinde bir in-house laboratuvar vakum veya vakum pompası kullanımı ile bir vakum uygulayarak karışımı Degas.
5. Toz kaldırmak için yapışkan bir bant ile kalıp yüzeyini DAB ve sonra kalıp PDMS karışımı dökün. Baloncuklar işlemde tanıtılırsa, vakum kurutucu içinde tekrar gaz giderme. Küf sütunlar arasında sıkışmış kabarcıklar keskin bir iğne ile onları alay tarafından kaldırılabilir.
   Not: oda sıcaklığında gaz giderme işlemi 1 saat veya daha az içinde yapılmalıdır.
6. 80 °C ' de 2 saat ısıtarak PDMS 'ye tedavi yapın. Kalıp oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
7. Bir bıçak ile kalıp ve PDMS arasındaki sınırı keser ve sonra dikkatle kalıp PDMS soyulmak.
8. PDMS parçasını 22 mm x 22 mm kaplaması sığdırmak için kırpın ve girişe bir delik takın.
   Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.
9. Düşük tüy dokusu ve% 70 etanol ile yüzeyleri silerek PDMS parçası ve 22 mm x 22 mm lamel magazini temizleyin. Sonra yapışkan bir bant ile dabbing büyük toz parçacıkları çıkarın.
10. PDMS parçasını ve lamel magazini 'ı otoklavlama (121 °c ' de 8 dakika ıslak, 15 dakika kuru) veya 1 saat boyunca UV ışığa maruz kalma ile sterilize edin.
11. Doku kültürü kaputu içinde 5 dakika boyunca korona deşarj tabancası ile PDMS parçası ve kapak kayma alt yüzeyi tedavi ve sonra onları bir araya bağ.
    DIKKAT: alt kısmında Polistiren köpük gibi herhangi bir iletken olmayan malzeme koymak ve bu süreçte tüm iletken malzemeleri çıkarın. Kollajen jel ve cam coverslip arasında bağ artırmak için tedavi sonra, 5 dakika içinde, hemen cihaza kollajen enjekte.

2. hücre hazırlığı: primer meme nevuslardır yalıtım

Not: meme nevuslardır yalıtım detayları önceki çalışma bulunabilir¹¹. Her türlü tek hücreli veya nevuslardır kendi izolasyon/dekolmanı protokollerine göre hazırlanabilir.

1. Doku rahatlatır ve 37 °c ' de 50 ml kolajenaz/tripsin çözeltisi (fare başına 10 ml) içinde 30 dakika için sallamak kadar bir neşter ile farelerin meme bezi dokusu Mince/F12, 0,1 g tripsin, 0,1 g kolajenaz ile tamamlayıcı , 5 mL FBS, 250 μL 1 μg/mL insülin ve 50 μL, 50 μg/mL gentaminisin.
2. 10 dakika boyunca 1.250 x g 'de collagenase/tripsin çözeltisi Santrifüjü aspirasyon ile süpernatant çıkarın. Hücreleri 10 mL DMEM/F12 'de dağıtın ve 1.250 x g 'de santrifüjler 10 dk. Aspirasyon ile DMEM/F12 kaldırdıktan sonra, 4 mL DMEM/F12 ile 40 μL DNase (2 ünite/μL) ile tamamlayıcı hücreleri yeniden askıya alın.
3. 2-5 dakika boyunca DNase çözümünü el ile sallayın ve ardından 10 dakika boyunca 1.250 x g 'de santrifüjün.
4. Dört diferansiyel santrifüjleri ile tek hücrelerden ayrı organoidler (Nabız 1.250 x g ve santrifüj 3-4 s durdurmak amaçlanan hıza ulaştığında). Her nabız arasında, süpernatant Aspire ve dmem/F12 10 ml Pelet pelletini.
5. 1% penisilin/streptomisin ve 1% insülin-transferrin-Selenium-X kollajen hazırlama için dmem/F12 büyüme orta istenilen miktarda son Pelet yeniden askıya.

3. kollajen hazırlama ve enjeksiyon

Not: diğer ECM jelleri kendi jelleşme protokollerine göre hazırlanabilir.

1. Hazırlamak kollajen tipi ı çözüm (3,78 mg/mL), 10X DMEM, 1 N NaOH çözüm, buz üzerinde normal büyüme ortamı.
   Not: prosedür tamamlanana kadar buzda tutun.
2. 6 μL 1 N NaOH çözeltisi, 200 μL büyüme orta ve 50 μL 10 DMEM önceden soğutulmuş mikrosantrifüjle tüp içine ekleyin ve çözümü iyice karıştırın.
3. Önceden karışık çözüme 425 μL kollajen ekleyin ve pipetleme ile iyice karıştırın.
4. Kollajen karışımı kısa bir süre Santrifüjü (daha az 5 saniye) ayırmak ve karışımı kabarcıkları kaldırmak için.
5. Lif oluşumunu teşvik etmek için 1 saat boyunca buz üzerinde nötralize kollajen çözeltisi tutun.
6. Kollajen karışımı içine hücre süspansiyon 50 μL ekleyin ve iyice karıştırın.
   Not: son kollajen konsantrasyonu 2 mg/mL 'dir.
7. Tüm oda doldurulana kadar PDMS cihazının girişinde 200 μL pipet kullanarak çözüm enjekte edilir. Kollajen karışımı sütunların boşlukları üzerinden taşırsa, jelleşme sonra keskin cerrahi bıçak ile aşırı kollajen jel kesip.
8. Cihazı 37 °C ' de,% 5 CO₂ ile 1 saat boyunca kuluçkunda tutun.
9. Her iki tarafın rezervuarlarını büyüme ortamına doldurun ve cihazı 37 °C ' de kuluçta tutun,% 5 CO2 ile Konfokal görüntüleme gerçekleştirilene kadar.

4.3B görüntüleme ve miktar

1. Bir Konfokal mikroskop ve Pre-set sıcaklık ve CO₂ Için 37 °c ve% 5, sırasıyla canlı hücre görüntüleme kültürü odası yükleyin. Nem almak için, odanın rezervuar su ekleyin ve gerekirse odaya ıslak mendiller yerleştirin.
2. PDMS cihazını Odaya yerleştirin ve EGF 'i gradyan oluşumunda EGF 'in ' kaynak ' olarak bir rezervuar olarak ekleyin. Diğer rezervuar, uzamsal olarak dereceli EGF dağıtımının geliştirilmesi için gerekli olan bir ' lavabo ' hizmet verecektir. 2,5 Bu çalışmada 0,5 nM/mm gradyan yapmak için lavaboya EGF nM eklendi.
3. İlgi organoids hacmi kapsayan Z-yığını aralığını ayarlayın ve görüntüleme başlar.
   DIKKAT: fototoksisite önlemek Için, Konfokal görüntülemede daha düşük bir lazer yoğunluğu deneyin veya Multi-foton görüntüleme teknikleri kullanın.
4. Ticari yazılım veya özel yapılan bir program kullanarak 2B görüntü yığınlarından 3B görüntüyü yeniden oluşturun. Organoids veya bireysel hücrelerin göç uzanan dalları uzunluğunu ve açısını ölçmek. Burada, ımagej kullanarak orgoid gövdesinin etrafında bir serbest anahat çizerek miktar ölçümü gerçekleştirin.

Sonuçlar

EGF, meme bezlerinde morfojenin dallanma ve invaziv kanser büyümesinde memenin epitelyal hücrelerinin göçüne rehberlik eden kritik bir kemoçekicinin temel düzenleyicisidir. Yukarıda açıklanan mezoskopik fluidik cihazları, hücrelerin tanımlanabilen EGF degradeleri (Şekil 1a, B)¹⁰' a yanıtını incelemek için kullandık. Cihaz 5 mm genişliğinde, 10 mm uzunluğunda ve 1 mm boyunda bir kültür alanı ve...

Tartışmalar

PDMS kalıpları imalat ticari bir 3D baskı hizmeti kullanılarak yapılmıştır, ama aynı zamanda yüksek uç 3D yazıcı-ev tarafından gerçekleştirilebilir. Çeşitli 3D imalat yöntemleri arasında, stereolitografi yüksek çözünürlüklü kalıp üretimi için tavsiye edilir. PDMS kür yüksek sıcaklıkta oluştukları için (80 °C), malzemelerin yeterli sıcaklığa dayanıklı olması, hangi açıkça belirtilmelidir, baskı dış kaynaklı ise. Bir termal Post-Cure parçanın termal direnci artırmak iç...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
22mm x 22mm coverslip	Fisher Scientific	12-542-B
Collagen I, Rat	Fisher Scientific	CB-40236
Collagenease	Sigma-Aldrich	C5138
COMSOL Multiphysics 4.2	COMSOL Inc		Used for simulating diffusion dynamics
10x DMEM	Sigma-Aldrich	D2429
DEME/F12	Thermo Fisher	11330032
DNase	Sigma-Aldrich	D4623
EGF Recombinant Mouse Protein	Thermo Fisher	PMG8041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life technologies	16140-071
Fiji-ImageJ			Used for measuring branching length and angles
Gentamicin	GIBCO	5750-060
IMARIS	Bitplane
Insulin	Sigma-Aldrich	19278
Insulin-Transferrin-Selenium-X	GIBCO	51500
Low-lint tissue	Kimberly-Clark Professional	Kimtech wipe
Mold Material	Proto labs	Accura SL5530
Mold printing equipment	Proto labs	Stereolithogrphy	Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm
Mold printing Service	Proto labs	Custom	https://www.protolabs.com/
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770
Penicillin/Streptomycin	VWR	16777-164P
Spinning-disk confocal microscope	Solamere Technology Group
Sylgard 184	Electron Microscopy Sciences	184 SIL ELAST KIT	PDMS kit
Trypsin	Sigma-Aldrich	T9935