Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

Özet

Bu protokol indüklenebilir piggyBac vektörler transkripsiyon faktörlerin ektopik ifade, bir spinal veya kranial kimlik ile motor nöronlar içine indüklenen pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve verimli dönüşüm sağlar.

Özet

Burada insan indüklenen pluripotent kök hücrelerden fonksiyonel omurilik ve kraniyal motor nöronları elde etmek için bir yöntem tarif (ıpscs). Motor nöron içine doğrudan dönüşüm transkripsiyon faktörleri alternatif modüller ektopik ifade ile elde edilir, yani Ngn2, Isl1 ve Lhx3 (NIL) veya Ngn2, Isl1 ve Phox2a (NSIP). NIL ve NıP sırasıyla spinal ve kraniyal motor nöron kimliğini belirtir. Protokollerimiz, NIP 'nin bir piggybac transpozon vektörü ile genomda stabil entegre edildiği değiştirilmiş IPSC hatları ile başlar. Transgenlerin ifadesi daha sonra doksisiklin ve yol açar, 5 gün içinde, ıpscs MN progenitors dönüşümüne. Sonraki olgunlaşma, 7 gün boyunca, spinal veya kranial MNs homojen nüfusa yol açar. Bizim yöntemi önceki protokoller üzerinde çeşitli avantajları tutar: son derece hızlı ve Basitleştirilmiş; viral enfeksiyon veya daha fazla MN yalıtım gerektirmez; farklı MN alt kitleleri (omurilik ve kranial) olgunlaşma dikkat çekici bir derece ile Üreten sağlar, eylem potansiyelleri trenler yangın yeteneği tarafından gösterilmiştir. Dahası, çok sayıda motor nöronları karışık nüfus arıtmadan elde edilebilir. IPSC-türev spinal ve kraniyal motor nöronlar Amilotrofik lateral skleroz ve motor nöron diğer nörodejeneratif hastalıkların in vitro modelleme için kullanılabilir. Homojen motor nöron nüfus hücre tipi spesifik ilaç gösterimleri için önemli bir kaynak temsil edebilir.

Giriş

Motor nöron (MN) dejenerasyonu amilotrofik lateral skleroz (ALS) ve spinal kas atrofi (SMA) gibi insan hastalıklarında etken rol oynar. İnsan MN karmaşıklığı özetlemek uygun in vitro hücre modeli sistemleri kurulması yeni terapötik yaklaşımlar gelişimine yönelik önemli bir adımdır. Belirgin plurilineage farklılaşma özellikleri ile donatılmış olan indüklenen pluripotent kök hücreleri (ıpscs), şimdi motor nöron hastalıkları etkilenen hastaların bir dizi türetilmiştir^1,2. MN hastalıklarına ilişkili patojen mutasyonları taşıyan ek IPSC hatları, kontrol "sağlıklı" pluripotent kök hücreleri³' ten başlayarak gen düzenleme ile üretilir. Bu çizgiler in vitro hastalık modelleme ve ilaç taraması için yararlı araçları temsil eder, MNs içine IPSC farklılaşma için uygun yöntemler mevcuttur sağlanır. Bu yöntemin gelişiminin arkasındaki mantık, MN hastalıklarıyla ilgilenen bilimsel toplumu, Olgun fonksiyonel MNs 'ye yol veren hızlı ve verimli bir farklılaşma protokolüyle sağlamaktayız. Bu yöntemin ilk avantajı, yürütme zaman dilimi olur. Güç başka bir ilgili noktası herhangi bir arıtma adım eliminasyon gelir. Son olarak, protokol motor nöronların iki farklı nüfus oluşturmak için kullanılabilir.

MNs farklı alt türleri oluşturma olasılığı MN hastalıkları modelleme için özellikle ilgilidir. Tüm MN alt türleri ALS ve SMA 'da eşit derecede savunmasız değildir ve farklı motor ünitelerinde semptomların başlangıcı prognozu büyük ölçüde etkiler. ALS 'de, üst ve alt ekstremitelerde başlayan semptomlarla spinal başlangıçlar yaklaşık 3-5 yıl içinde ölüme yol açar⁴. Tersine, kraniyal MNS dejenerasyonu ile başlayan bulber başlangıcı, en kötü prognoz vardır. Dahası, RNA-bağlayıcı proteinleri FUS ve TDP-43 mutasyonları olan hastalarda SOD1 mutasyonları⁵olan bireylere göre, bulber başlangıcı yüzdesi önemli ölçüde daha yüksektir. Alternatif MN farklılaşma protokollerinin neredeyse bütünlüğü, ipscs^6,7,8türevlerini ayırt etmek için omurilik karakterini gösteren retinoik asit (ra) aktivitesine dayanır. Bu spesifik MN alt türlerinden^9,10koruyucu olabilir içsel faktörler, eğitim olasılığını sınırlar.

Fare embriyonik kök hücrelerinde bir önceki çalışma ile tutarlı¹¹, son zamanlarda ınsan ıpscs ektopik ifade Ngn2, Isl1 ve LHX3 (NIL) BIR spinal MN kimlik indükler göstermiştir, Ngn2 ve Isl1 artı Phox2a (n) kranial MNS¹²belirtin. Bu nedenle, 12 gün boyunca işlevsel özelliklere sahip insan MNs üretimini sağlayan etkili bir protokol geliştirdik. Bu yöntemin amacı, kısa bir zaman diliminde ve arıtma (örneğin, FACS) gerek kalmadan elde etmektir, hücre nüfusu yüksek spinal veya kranial kimlik ile MNs için zenginleştirilmiştir.

Protokol

1. Insan iPSCs 'nin Bakımı

1. Matris kaplı plakaların hazırlanması
   1. Çözme bir 5 mL matris şişe (bkz. malzeme tablosu) 4 °c gece. Orijinal matris stokları farklı stok konsantrasyonlarda gelir ve plakaya veri sayfasında belirtilen seyreltme faktörü göre yapılır, bireysel lot için özel. Matrisin erken jelini önlemek için şişe ve tüpler buz soğuk tutmak önemlidir. Buz üzerinde önceden soğutulmuş cryotubes içinde plakaya içine matris dağıtma. Kullanılmayan plakaya-20 °c ' de dondur.
   2. Yaklaşık 2 h çözülmek için buzda bir kısım yerleştirin.
   3. 50 ml konik tüpte 20 ml soğuk dmem/F12 ile matrisin kısım seyreltmeli.
   4. İyi karıştırın ve 35 mm yemeklere (diğer yemeklerin yüzey alanı başına eşdeğer tutarlar) 1 mL seyreltilmiş matrisin dağıtımı yapın.
   5. Kaplama sağlamak için oda sıcaklığında 1 saat için seyreltilmiş matris içeren yemekleri tutun.
      Not: Parafilm ile mühürlenmiş yemekler, 2 haftaya kadar 4 °C ' de depolanabilir.
2. Stok çözeltisi (20 ml) ve 1 adet yumuşak hücre dağılma reaktörünün çalışma plakaya hazırlanması (bkz. malzeme tablosu).
   1. PBS 'de 10 mg/mL 'ye toz eritin (CA^{2 +}/mg^{2 +} ücretsiz).
   2. 0,22 μm filtre membran ile filtre sterilize edilir.
   3. 20 plakaya (her biri 1 ml) hazırlayın ve-20 °c ' de saklayın.
   4. Kullanmadan önce, PBS 'de bir kısım seyreltin (CA^{2 +}/mg^{2 +} ücretsiz) 1 mg/ml (1x çalışma aliquots).
      Not: 1x çalışma plakaya 2 hafta kadar 4 °c ' de depolanabilir.
3. İnsan IPhone 'ları geçmekle.
   1. Başlamadan önce: 4 °C ' de depolanırsa, 37 °C ' de kuluçsa ön sıcak matris kaplı plakalar 20-30 dk. oda sıcaklığında önceden sıcak insan iPSC orta miktarı (bkz. malzeme tablosu) gerekli. Ön sıcak DMEM/F12.
   2. Aspirate kültür ortamı.
   3. Ipscs 'yi PBS ile durulayın (CA^{2 +}/mg^{2 +} ücretsiz).
   4. 1x nazik ayrışma solüsyonu ekleyin (35 mm 'lik bir çanak için 0,5 ml). 37 °C ' de kolonilerin kenarları tabandan ayrılmaya başlayana kadar genellikle 3-5 dak.
   5. Yumuşak ayrışma çözümünü aspirate, IPSC kolonilerini ayırmamaya dikkat edin.
   6. Hücreleri dmem/F12 (35 mm çanak için 2 ml) ile yıkayın ve hücreleri ayırmak için dikkatli olmak Aspire. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
   7. İnsan iPSC Orta (35 mm çanak için 1 mL) ekleyin.
   8. Kolonileri bir hücre kaldırıcısı ile yavaşça ayırın ve 15 mL tüpüne aktarın.
   9. Bir P1000 pipetör 3-4 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yavaşça hücre kümeleri kırmak.
   10. Matris kaplı plaka (ler) den süpernatant aspirate.
   11. İnsan iPSC orta uygun kültür hacmi hücreleri tohum. Bölünmüş oranı satırdan satıra değişebilir ve yaklaşık 1:4-1:8. Günlük orta değiştirin.

2. NIL ve NıP Indüklenebilir iPSC hatları üretimi

1. Hücre transfeksiyon.
   1. Hücreleri PBS ile durulayın (CA^{2 +}/mg^{2 +} ücretsiz).
   2. Hücre ayrışma reaktif ekleyin (bkz. malzeme tablosu) (35 mm çanak Için 0,35 ml) ve tek hücreler ayrılıncaya kadar 37 °c ' de inkübasyon (5-10 dk).
   3. Bir P1000 pipetör 3-4 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme ile yavaşça komple hücre ayrımı.
   4. 15 mL 'Lik bir tüpte toplayın ve PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +} ücretsiz) ' ye 10 ml ekleyin. Hücreleri say.
   5. Pellet 10⁶ hücreler ve pelletini içinde 100 μL tampon R (hücre Elektroporasyon kiti dahil, bkz. malzeme tablosu).
   6. Transfeksiyon için Plasmid DNA ekleyin: 4,5 μg transpoze vektörü (EPB-BSD-TT-NIL veya EPB-BSD-TT-NIP¹²) ve 0,5 μg piggybac transposase Plasmid¹³.
   7. Hücre Elektroporasyon sistemi ile transfect ( malzeme tablosunabakın) üreticinin talimatlarına göre ve daha önce aşağıdaki parametrelerle³ açıklanan: 1.200 V voltaj, 30 MS genişlik, 1 darbe. 10 μM Y-27632 ile tamamlayıcı insan IPSC orta hücreleri tohum (ROCK inhibitörü, malzeme tablosubkz) 6 mm matris kaplı çanak.
2. Antibiyotikler ile seçim.
   1. Transfeksiyondan iki gün sonra kültür ortamına 5 μg/mL Blasticidin ekleyin.
   2. Transfürif olmayan hücrelerin çoğu 48 h 'de Blasticidin seçimi içinde ölecek. Genomda transgenler entegre değil hücreleri karşı-seçmek için en az 7-10 gün boyunca Blasticidin hücreleri tutun.
   3. Farklı sayıda transgenler ve farklı entegrasyon sitesi içeren hücrelerden oluşan karışık bir nüfus olarak stabil transfenli hücreleri koruyun veya tek klonları yalıtın.
   4. 1 μg/mL doksisiklin indüksiyonunda, Ngn2 için transgeni özgül astar ile RT-PCR tarafından, transgenlerin etkili bir ifade için kontrol etmek için ek bir çanak hazırlamak (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Ters: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), daha önce açıklanan¹².
   5. Bu aşamada, insan iPSCs (bkz. malzeme tablosu) için donma ortamında NIP-ipsc hatlarının romanını dondur.

3. motor neuron farklılaşma

1. Hücrelerin hücre kesilmesi reakajıyla açıklandığı gibi ayırmak (Steps 2.1.1.-2.1.3.). 15 mL tüp ve DMEM/F12 5 hacimiyle seyreltilmiş hücreleri toplayın. 10 μM kaya inhibitörü ile tamamlayıcı hücre ve insan ipsc orta pelletini Pellet. 62.500 hücreler/cm²yoğunluğu matris kaplı yemeklerle hücreler ve tohum saymak.
2. Sonraki gün, DMEM/F12 ile orta değiştirin, 1x istikrarlı L-glutamin analog ile tamamlayıcı, 1x esansiyel olmayan amino asit (NEAA) hücre kültürü takviyesi ve 0.5 x penisilin/streptomisin, ve içeren 1 μg/mL doksisiklin. Bu farklılaşma gün 0 olarak kabul edilir. 1. gün, orta ve doksisiklin yenileyin.
3. 2. gün, 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 ve 1 μg/mL doksisiklin içeren (1x B27, 1x istikrarlı L-glutamin analog, 1x NEAA ve 0.5 x penisilin/streptomisin) olan Nörobasal Orta (neurobasal/B27) orta, orta değiştirmek (bkz . malzeme tablosu ). Her gün 5 kadar orta ve doksisiklin yenileyin.
4. 5. gün: hücre ayrışma reaktif ile hücreler ayrışma (bkz. malzeme tablosu).
   1. Hücreleri PBS ile durulayın (CA^{2 +}/mg^{2 +} ücretsiz).
   2. Hücre ayrışma reakajının (35 mm 'lik bir çanak için 0,35 ml) ekleyin ve tüm hücre tek tabakalı çanak ayrılır kadar 37 °c ' de inkübasyon. Tek hücrelerin inkübasyon sırasında ayrılmaz unutmayın.
   3. 1 mL DMEM/F12 ekleyin ve hücreleri 15 mL 'Lik bir tüpte toplayın.
   4. Bir P1000 pipetör 10-15 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme ile yavaşça komple hücre ayrımı.
   5. 4 mL DMEM/F12 ekleyin ve hücreleri saymak.
   6. Bu aşamada, üretici talimatlarına göre, hücre donma Orta ( malzeme tablosunabakın) motor nöron ataları dondurmak.
   7. Pellet hücreleri ve nöronal Orta içinde pelletini (nörobazal/B27 orta ile tamamlayıcı 20 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF ve 200 ng/ml L-askorbik asit, bkz: malzeme s tablosu) 10 μM kaya inhibitörü ile desteklenmektedir.
   8. Poly-ornitin/laminin üzerindeki hücreleri tohumlama-veya alternatif olarak matris kaplı desteklerin yoğunluğu 100.000 hücreler/cm². İmmünostatik analiz için polimer lamel magazini (bkz. malzeme tablosu) ile μ-Slide plastik destekler kullanın.
5. 6. gün, taze nöronal orta ROCK inhibitörü yoksun orta değiştirin. Sonraki günlerde, her 3 günde bir ortamın yarısını yenileyin. Kültür ortamı, yüzeyden dekolmanı önlemek için çok dikkatli bir şekilde değiştirilmelidir.

4. immünostam Analizi

1. Hücre fikreme. Hücreleri PBS ile durulayın (CA²+/mg^{2 +}ile) ve PBS 'de% 4 civarında formaldehite (CA^{2 +}/mg^{2 +}ile) Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküye yapın.
   Dikkat: Paraformaldehyde zehirli ve kansere neden olduğundan şüpheleniliyor. Cilt ve gözler ile temasından kaçının ve kimyasal duman kaputu altında tutunuz.
2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0,1 Triton X-100 içeren PBS (CA^{2 +}/mg^{2 +}ile) ile geçirgen.
3. Antikor engelleme çözeltisi içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye (ABS:% 3 BSA, PBS 'de CA^{2 +}/mg^{2 +}ile).
4. ABS: Anti-TUJ1 (1:1000; tavşan) ve anti-Oct4 (1:200; fare) veya anti-sohbet (Anti-Kolin asetiltransferaz; 1:150; keçi) Primer antikorlar ile Oda sıcaklığında 1 h için inküye. Bkz. malzeme tablosu.
5. ABS 'de uygun eşek ikincil antikor çifti ile Oda sıcaklığında 45 dk için inküat: Anti-fare Alexa Fluor 647 (1:250), Anti-tavşan Alexa Fluor 594 (1:250) ve anti-keçi Alexa Fluor 488 (1:250). Bkz. malzeme tablosu.
6. 0,4 μg/mL DAPı 'de 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, çekirdekleri etiketlemek için inküye yapın.
7. Floresan mikroskobun görüntülenmesi için hücreleri montaj Orta (bkz. malzeme tablosu) ile bağlayın.

5. yama ile fonksiyonel karakterizasyon-kelepçe kayıtlar

1. HEPES hazırlamak-equilibrated dış solüsyon (NES) aşağıdaki gibi: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mm MgCl₂, 10 mm HEPES, ve 10 mm glikoz. 290-300 MΩ arasında Osmolarite ayarlayın. 1N NaOH kullanarak 7,3 için pH ayarlayın ve çözümü 4 °C ' de saklayın.
2. İç solüsyonu hazırlayın: 140 mM K-glukonat, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl₂, 10 mm HEPES, 2 mm MG-ATP, 0,3 mm na-GTP. 1m Koh ile 7,3 için pH ayarlayın ve Osmolarite yaklaşık 290 MΩ ayarlanır kontrol edin. Çözümü-20 °C ' de küçük aliquots 'da dondurur.
3. Deneyleri çalıştırmadan önce, NES çözümünü su banyosundan yaklaşık 28-30 °C ' ye önceden ısıtın.
4. Bazı borosilikat mikropipetleri çekin (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) bir uç direnci taşıyan: 5-6 MΩ ve pipet tutucusuna monte etmeden önce hücre içi çözeltisi ile doldurun.
   Not: Tel yüzeyinde AgCl 'nin üniforma tabakası oluşturmak için en az 30 dakika boyunca kayıt elektrot ve referans elektrot su klorür Gümüş Teller unutmayın.
5. Petri çanağını kayıt odasına aktarın ve 1-2 mL/dak 'da NES çözümüyle odasına bırakın. Solüsyonu sıcak tutmak için 30 °C sıcaklıkta bir satır içi ısıtıcıdan geçen akışa izin verin.
6. Electrofizyoloji kayıt odasını dik mikroskop altında yerleştirin. Yama kelepçe amplifikatör ile membran akımları kaydedin ve uygun bir yazılım ile veri elde.
7. Amplifikatör kontrol yazılımını açın ve 1 değeri ve 10 kHz 'de Bessel filtresinde sinyal kazanımı ayarlayın. Bessel filtresinin örnekleme frekansından 2,5 kat daha düşük olduğundan emin olun.
8. Kayıt yazılımında gerilim kelepçe ve akım kelepçe denemeleri için deneysel protokolleri ayarlayın.
9. Protokol ayarında, epizodik stimülasyon modunu işaretleyiniz ve örnekleme sıklığını 25 kHz olarak ayarlayın. Sonra, dalga formu sekmesine gidin ve gerilim veya geçerli adım genlik ve uzunluğu takip olarak yazın.
10. Voltaj-Gated sodyum akımları için, 15 gerilim basamakları (50 MS süresi)-100 mV ila + 40 mV (10 mV artışı) kullanın. Yamalı hücreye atladıktan sonra protokol çalıştırın-60 mV amplifikatör üzerinden bir tutma potansiyeli. Benzer şekilde, voltaj-Gated potasyum akımları (250 MS süresi her)-30 mV ile + 50 mV (10 mV artışı)-40 mV kaydedilmiş hücre tutan voltaj basamakları ile uyarılır.
11. IPSC-türetilmiş kranial ve spinal MNs, kelepçe hücreleri, geçerli kelepçe modunda, bir membran potansiyeli-70 mV ve kullanım 4 akım darbeleri (1 s süresi her) artan amplitüd (+ 20 pA + 80 pA; 20 pA artışı) ateş özelliklerini araştırmak için.
12. Her hücre voltajı-aktif akımları için elde, uyarılmış ateş aktivitesi ve üç pasif özellikleri tüm hücre kapasitans (cm), hücre membran direnci (RM) ve Istirahat membran potansiyeli (RMP) olarak.

Sonuçlar

Şekil 1' de farklılaşma yönteminin şematik bir açıklaması gösterilir. İnsan ipscs (WT I Line³) EPB-BSD-TT-NIL veya EPB-BSD-TT-NIP ile transfekte edildi, oluşturulan, Blasticidin seçimi üzerine, istikrarlı ve indüklenebilir hücre hatları¹², bundan sonra IPSC-NIL ve IPSC-NIP olarak anılacaktır, sırasıyla. Farklılaşan hücreler pluripotency Marker OCT4 ve Pan-neuronal Marker TUJ1 ifadesi için karakterize edildi. İmmünosti...

Tartışmalar

Bu protokol, insan ıpscs 'yi, kemiğe özel transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifadesi sayesinde Spinal ve kranial motor nöronlara verimli bir şekilde dönüştürmeyi sağlar. Bu transgenler, doksisiklin ile indüklenebilir ve piggyBac transposon tabanlı vektörü sayesinde genomda stabil bir şekilde entegre edilir. Karma bir nüfusa göre, piggyBac vektörünün bir veya birkaç kopyası, tek hücrelerin genomuna rasgele entegre edilecek ve genom bütünlüğü değişimi riskini arttırır. Dahası, iPSC subkl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	chemicals for electrophysiological solutions
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Cell dissociation reagent
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594	Immunological Sciences	IS-20152-1	Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF	PreproTech	450-02	Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin	Sigma-Aldrich	203350	Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software	Molecular Devices	Clampex 10	Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Gamma secretase inhibitor
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR	Bio-Rad	1708841	Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate	Sigma-Aldrich	G4500	chemicals for electrophysiological solutions
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid	LKT Laboratories	A7210	Used in cell culture as an antioxidant
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope	Olympus	iX83 FluoView1200	Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium	Ibidi	50001	Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier	Molecular Devices	700B	Membrane currents recording system
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	chemicals for electrophysiological solutions
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	chemicals for electrophysiological solutions
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	157-8	Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope	Olympus	BX51VI	Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera
Y-27632  (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Support for high–end microscopic analysis of fixed cells