Vasküler Endotel Hücrelerini Doğrudan Gözlemlemek Için En Yüz İmmünofloresan Boyama

Özet

Burada, doğrudan fare aort endotel hücrelerini gözlemlemek için immünofloresan boyama için bir protokol sıyoruz. Bu teknik, endotel hücrelerinin farklı akış desenlerinde hücresel ve moleküler fenotiplerini incelerken ve ateroskleroz gelişiminde yararlıdır.

Özet

Endotel fenotip ve morfolojideki anormal değişiklikler ateroskleroz patogenezinde ilk olaylar olarak kabul edilir. Bozulmamış endotel doğrudan gözlem işlevsiz endotel hücrelerinde hücresel ve moleküler olayları anlamak için değerli bilgiler sağlayacaktır. Burada, bilim adamlarının bozulmamış endotel yüzeyinin net görüntülerini elde etmelerini ve molekül ekspresyon desenlerini yerinde analiz etmelerini sağlayan değiştirilmiş bir yüz immünofloresans boyama tekniğini tanımlıyoruz. Yöntem basit ve aort farklı sitelerde tüm endotel monolayer gözlemlemek için güvenilir. Bu teknik, özellikle erken bir aşamada, ateroskleroz patofizyolojisi anlamak için umut verici bir araç olabilir.

Giriş

Vaskülatürerken erken değişiklikler öncelikle endotel, hangi hücreler arası sıkı kavşak kompleksleri ile kan ve damar duvarı arasında seçici bir bariyer olarak işlev ler başlatın¹. Önemli kanıtlar endotel fonksiyonu²modülasyonunda kan akışının mekanik etkileri için kritik bir rol işaret ediyor. Sıvı kesme stresi, kan akımı tarafından oluşturulan bir sürtünme kuvveti, farklı damar hücre morfolojisi ve fonksiyonu ayırt edici şekillerde, farklı vasküler sitelerde belirli akış paradigmaları bağlı olarak^2,3. Aterosklerotik lezyonlar tercihen rahatsız kan akımı bölgelerinde meydana (d-akış), damar eğrilikleri gibi, akış bölücüler, ve şube noktaları, sabit akış bölgeleri ile karşılaştırıldığında (s-akış), arter in düz segment gibi. Bu nedenle, endotel morfolojisi ve molekül ekspresyonu desenlerinin doğrudan gözlemi, değişen akış paradigmaları altında endotel hücrelerinin yapısal ve fonksiyonel fenotiplerine önemli bilgiler sağlamalıdır.

Kültürlü endotel hücreleri, sıvı kesme stresinin, çevreleyen sitokinlerin ve hücre-hücre dışı matriks etkileşimlerinin etkisinin kaybolması nedeniyle kısmen in vivo'da yaptıkları gibi gerçek fenotipi ifade edemeyebilirler. Bu yardım için, bozulmamış endotel hücre monolayer klasik immünohistokimya kullanılarak enine kesitler üzerinde incelenebilir. Ancak, endotel monolayer genellikle açıkça gözlemlenemez o kadar ince ve kırılgandır. En yüz immünohistokimya endotel iç yüzeyini gözlemlemek için kullanılmıştır ama endotel kolayca altta yatan doku dan sıyrılmış çünkü sonuçları ya karmaşık ya da düzensiz, ya da sıçan veya tavşan arteriyel duvarın sadece bir parçası, kimin duvarları kalın,^4,5monte edilir.

Fare modelleri birçok açıdan diğer hayvanlara göre önemli avantajlara sahiptir. Burada C57BL/6 farede aort kemeri ve torasik aortun endotel hücrelerini analiz etmek için modifiye edilmiş bir en yüz immünofloresans tekniği ni uyguluyoruz. Böyle bir teknik yaygın olarak farklı akış desenleri endotel patofizyolojisi çalışma ve ateroskleroz^gelişiminde6,^7,8,9,10kullanılmıştır. Bu yöntem bilim adamlarının endotel yüzeyinin tamamını net bir şekilde gözlemlemelerine ve farklı sıvı kesme stresi altındaki bölgelerde belirli bir proteinin ifade desenlerini karşılaştırmalarına olanak tanır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Şangay Jiao Tong Üniversitesi Hayvan Kaynakları Komitesi tarafından onaylanan deneysel protokollere uygun olarak yapılmıştır.

1. Fare aortu perfüzyonu

1. Kısaca, sodyum pentobarbital (50 mg /kg vücut ağırlığı) intraperitoneal enjeksiyonları ile 12 haftalık C57BL/6 fareler anestezik. Kuyruğu hafifçe çimdikleyerek uygun anesteziyi onaylayın.
   NOT: Herhangi bir hareket gözlenmezise, hayvan deneylere başlamak için yeterince anesteziye başlar.
2. Farenin patilerini yapışkan bantlarla kağıt havlu yığınına bantlayın.
3. Pİşir ile farenin deri tutun ve toraks üstüne karın makas bir çift ile deri kesti.
4. Göğüs kafesinin altındaki karın boşluğunu keskin bir makasla açın.
5. Sternumu forsepsle kaldırın ve diyaframı kesin; sonra, göğüs kafesini kesilerek göğüs boşluğunu ortaya çıkar.
6. Vena kavasını karaciğerin hemen üstünde, makasla kes.
7. Basınç perfuse (100 mmHg) akciğerler ve karaciğer soluk hale gelene kadar sol ventrikül ile 40 adet / mL heparin içeren önceden chilled normal tuzlu ile 5 dakika için arterağacı. Daha sonra, 3 dakika için fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) prechilled% 4 paraformaldehit ile perfuse.
8. Aort maruz kalana kadar tüm kasları, organları ve yağ çıkarın.
9. Fareyi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.

2. Aortun diseksiyonu ve uzunlamasına açılması

1. Aortu bir diseksiyon mikroskobu altında açıkça ortaya çıkarın ve aort boyunca bağ dokularını mümkün olduğunca temiz, hassasçerterler ve bir çift hassas makas ile çıkarın (Şekil 1).
2. Bir çift hassas makasla kalpten çölyak gövdesine kadar göğüs aortu inceltin ve PBS ile 6 cm hücrekültür çanak içine aort koyun. Düz segment karşılanana kadar aort uzunlamasına, daha küçük eğri boyunca ve daha büyük eğri boyunca açın. Şekil2'de gösterildiği gibi, aort kemerinin üç dalını, innominate de dahil olmak üzere, sol ortak karotis ve sol subklavian arteri mikrosiküllü olarak kesin.

3. Aortun ön tedavisi ve immünboyamı

1. 10 dakika PBS%0.1 polioksietilen oktil fenil eter ile aortu permeabilize edin ve 12 kuyulu hücre kültür plakasında oda sıcaklığında %2,5 polisorbat 20'ye 1 saat oda sıcaklığında bulunan Tris-tamponlu salin (TBS) %10 normal keçi serumu ile engelleyin.
2. Daha sonra, 5 g/mL tavşan anti-VCAM-1 ve 5 g/mL sıçan anti-VE-kadherin ile aort inkübülmesi engelleme tampon, bir gecede 4 °C.
3. Numuneyi yıkama solüsyonuyla 3x duruladıktan sonra (%2,5 polisorbat içeren TBS 20), floresan konjuge ikincil antikorları (1:1.000 seyreltme, Alexa Fluor 555 etiketli anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 488 etiketli anti-rat IgG) 1 saat boyunca odada uygulayın Sıcaklık. Yıkama çözeltisinde 3 x durulayın.
4. 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (1 μg/mL) ile aort le karşı leke 10 dakika ve yıkama çözeltisinde 3x durulayın.

4. Aortun cam kaydırağa montajı

1. Aortu, parlak yüzeyi aşağı doğru bir kapak kaymasına yerleştirin ve daha önce kapak kayması üzerine bırakılan antifade montaj çözeltisine yavaşça hareket ettirin. Numuneyi düz tutmak için aortu hafifçe gerin.
2. Kapak kayma ters ve slayt cam üzerine koyun. Numune ve cam arasında herhangi bir hava kabarcığı kalmasına izin vermemeye özen gerekir.

5. Aort gözlemi

1. Bir lazer tarama konfokal mikroskop ile aort inceleyin.
2. Image-Pro Plus yazılımı ile en yüz görüntülerinde istenilen bölgeden farklı kanalların renk yoğunluklarını analiz edin.

Sonuçlar

12 haftalık Bir C57BL/6 fare ötenazi ve 40 adet / mL heparin içeren normal tuzlu ile perfüzyon ve daha sonra, prechilled 4% paraformaldehit. Fare aort bir diseksiyon mikroskobu altında maruz kaldı (Şekil1), diseksiyon, ve uzunlamasına açık kesilmiş (Şekil 2). Vasküler endotel hücrelerinin en yüz immünoreskence boyaması Şekil 3 ve Tablo1'de gösterildiği gibi yapıl...

Tartışmalar

Endotel lipidler, inflamatuar mediatörler ve sıvı kesme stresi^1,11,12dahil olmak üzere çok sayıda proaterojenik faktörlere maruz kalmaktadır. Yerinde endotel hücrelerinin doğrudan gözlem hücre morfolojisi değişiklikleri analiz etmek için özel avantajlar sağlar, hücreler arası kavşaklar, ve yaralanma uyaranlarına yanıt molekül ekspresyon desenleri.

Önceki çalışmalar arteriyel...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antifade mountant	Servicebio	G1401
Delicate Forceps	RWD Life Science	F11001-11
Delicate Scissors	RWD Life Science	S12003-09
Dissecting Forceps	RWD Life Science	F12005-10
Mciro Spring Scissors	RWD Life Science	S11001-08
Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100)	Amresco	M143
Polysorbate 20 (Tween 20)	Amresco	0777
VCAM-1 antibody	Abcam	ab134047
VE-Cadherin antibody	BD Biosciences	555289
Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG	invitrogen	A-31572
Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG	invitrogen	A-21208
Laser Scanning Microscope	Carl Zeiss