JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, kültürde VX2 hücrelerini büyütmek ve tavşanlarda retroperitoneal lenf nodu metastazı olan endometriyal kanserortopik VX2 modeli oluşturmak için standart bir yöntem sunmaktadır. Ortotopik endometriyal kanser modelleri lenf nodaz metastazı tanısı için yeni görüntüleme yöntemlerinin klinik öncesi çalışması için önemlidir.

Özet

Endometrial kanser Kuzey Amerika'da en sık görülen jinekolojik malignitedir ve görülme sıklığı dünya çapında artmaktadır. Tedavi lenfadenektomi ile belirlenen lenf nodu tutulumuna bağlı olarak adjuvan tedavi li veya adjuvan olmayan cerrahiden oluşur. Lenfadenektomi birçok hastada terapötik yararı olduğu gösterilmeyen morbid bir işlemdir ve bu nedenle lenf nodu metastazlarını teşhis etmek için yeni bir yöntem gereklidir. Yeni görüntüleme ajanlarını test etmek için retroperitoneal lenf nodazı metastazı olan endometrial kanserin güvenilir bir modeline ihtiyaç vardır. VX2 endometrial kanser modeli literatürde sık sık tanımlanmıştır; ancak model kuruluş yöntemine göre önemli farklılıklar vardır. Ayrıca, daha önce sadece in vivo yayılan hücreler olarak bu modeli oluşturmak için kültürlü VX2 hücrelerinin kullanımı hakkında hiçbir çalışma bildirilmiştir. Burada VX2 endometrial kanser modelinin oluşturulması için standart laştırılmış cerrahi yöntem ve postoperatif izleme yöntemi sunmakta ve bu modeli oluşturmak için kültürlü VX2 hücrelerinin ilk kullanımı hakkında rapor vermekteyiz.

Giriş

Endometrial kanser, ya da rahim astar kanseri, dünya çapında ikinci en yaygın jinekolojik malignite ve gelişmiş ülkelerde en sık görülen malignite1. Endometrial kanser insidansı sürekli artmıştır, 2005-2013 yılları arasında yılda% 2.3 oranında artan mortalite karşılık gelen% 2.2 artışile 1,2,3. Pozitif lenf nodlarının varlığı sağkalım güçlü bir negatif belirleyici 4 olduğu gibi lenf nodu metastazlarının tanısı çok önemlidir4,5,6,7 ve uygulanmasına rehberlik edebilir adjuvan tedavi8,9,10,11,12,13. Lenf nodazı metastazları şu anda cerrahi pelvis ve karın ana kan damarları örten lenfatik doku kaldırarak teşhis edilir. Bu prosedür, bir lenfadenektomi olarak bilinen, iki büyük çalışmalar14, 15,16,17,18 ve bilinen çelişkili sağkalım verileri nedeniyle tartışmalıdır intraoperatif15,19,20 ve postoperatif morbidite riski21,22,23. Mevcut non-invaziv görüntüleme yöntemleri lenf nodülü diseksiyonu değiştirmek için gerekli duyarlılık ve özgüllük yok gibi24, yeni tanısal görüntüleme teknikleri geliştirmek için bir itme olmuştur. Bu yeni teknikleri niçin pre-klinik ortamda test etmek için retroperitoneal lenf nodazı metastazlı güvenilir bir endometrial kanser modeli gereklidir.

Tavşan VX2 tümör modeli akciğer26dahil olmak üzere birden fazla insan katı organ tümörleri25 çalışma için yaygın olarak kullanılan iyi kurulmuş bir modeldir , baş ve boyun27,28, karaciğer29, böbrek30, kemik31,32, beyin33, pankreas34 ve rahim35,36,37. VX2 modeli ilk olarak 1940 yılında Kidd ve Rous38 tarafından 193339yılında Shope tarafından keşfedilen bir cottontail tavşan papilloma virüsü başarıyla nakledilerek geliştirilmiştir. O zamandan beri, VX2 modeli in vivo muhafaza edilmiştir, Beyaz Yeni Zelanda tavşan kuadriseps kas seri geçit gerektiren40. Daha yakın zamanda, birden fazla grup başarıyla in vitro VX2 hücreleri büyüdü40,41,42 ve kültürlü hücre hattı korunmuş tümörigenecity gösterdi31, 42,43. VX2 tümörleri histolojik olarak anaplastik skuamöz hücreli karsinomlar44 olarak tanımlanır ve adenokarsinom26'yabenzeyen glandüler özellikler içerir. Tümörler implantasyon kolaylığı ile karakterizedir, hızlı büyüme ve hiper-vaskülarite44,45 ve güvenilir metastaz, en sık bölgesel ve uzak lenf düğümleri45. Rahim vasküler ve lenfatik anatomi benzerlikler46 yanı sıra ortotopik büyüme sitesi tavşan VX2 karsinom metastatik desen insan endometriyal kanser taklit sağlamak, VX2 modeli insan eğitimi için güvenilir bir model yapma metastatik hastalık. Ayrıca, anormal mikrovasküler proliferasyon47 gibi histolojik özellikleri, yanı sıra immünolojik48 ve genetik benzerlikler49,50 insanlar ve tavşanlar arasında tümör öneririz mikroçevre insan endometrial kanser yansıtabilir.

Birden fazla grup başarı yüksek bildirilen oranı ile retroperitoneal metastazlar ile endometrial kanser modeli oluşturmak için VX2 kullanımı bildirdin36,51,52; ancak, model oluşturma yöntemi açısından mevcut literatürde önemli farklılıklar vardır. Hücre süspansiyon dozları gibi düşük 4 x 105 hücre/ rahim boynuzu51 ve yüksek 5 x 109 hücreleri / rahim boynuzu37,53 gerekli VX2 hücresel doz üzerinde standart konsensüs ile bildirilmiştir. Ayrıca, rahim miyometrium36içine tümörün mikro-cerrahi implantasyonu da dahil olmak üzere aşı yöntemleri çeşitli bildirilmiştir , VX2 hücre süspansiyon37enjeksiyonu ,44,52 , 53 ve bazı durumlarda, rahim boynuzu ekleme önce innoculation52dikiş . Son olarak, bu modeli oluşturmak için kültürlü VX2 hücrelerinin kullanıldığını bildiren hiçbir grup yoktur. Bu çalışmanın amacı, VX2 modeli oluşturmanın başarılı bir standartlaştırılmış yöntemini göstermek ve tavşanda retroperitoneal metastazlar içeren endometrial kanser modelini oluşturmak için kültürlü VX2 hücrelerinin ilk kullanımını rapor etmektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Derin karın duvarı kapatma: Periton kesisini belirleyin ve periton, rektus kası ve fasyayı doku forsepsi ile tutarak tutun. Tüm hayvan çalışmaları, Üniversite Sağlık Ağı'nın hayvan salevi (ARC) onaylı tesislerinde ve onaylı hayvan kullanımı ve bakım protokollerine (AUP #3994/#4299) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. VX2 hücre hattı, Üniversite Sağlık Ağı'ndaki Dr. Aken's Lab'dan alındı.

1. In vitro VX2 hücre hattının oluşturulması

  1. Tavşan quadricep kas ve fare kanadı büyüme VX2 tümör Hasat.
    1. Dondurulmuş VX2 tümör blokları (1 cm x 1 cm), neşter bıçak kullanarak bir kültür plakası üzerinde kıyma ve hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) sırayla tüm hücrelerin 1 mL son bir hacim için gergin sağlamak için sırayla hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) küçük miktarlarda ekleyerek 70 μm filtre ile zorlanma.
    2. Hücreleri sayın ve 1 x 107/mL konsantrasyonuna %0,9 fosfat tamponlu tuzlu çözelti ile seyreltin ve steril bir tüpte buz üzerinde yerleştirin.
      NOT: Tümör blokları, tavşan kuadriseps kaslarında VX2 tümörlerinin daha önce yayılmasından bir laboratuvar işbirlikçisinden elde edilmiştir.
    3. % 2-5 inhale isoflurane ile bir kadın beyaz Yeni Zelanda tavşan (ağırlık 2.5-3.5 kg) anestezi, enjeksiyon sitesi örten kürk kaldırmak ve povione-iyot çözeltisi ile enjeksiyon sitesi temizlemek. Hazırlanan VX2 hücre süspansiyonunun (5 x 106 hücre/mL) 500 μL'sini tavşanın kuadriseps kaslarına enjekte edin. 10. günden itibaren tümör büyümesi için tavşanı klinik olarak izleyin.
    4. Tümörler 1-1,5 cm çapa ulaştıktan sonra tavşanötenihale (kaliperlerle dışarıdan ölçülür) veteriner onaylı bir yöntemle. Kalp hızı ve solunum hızı da dahil olmak üzere hayati belirtileri kontrol ederek ötenazi doğrulayın. Betadine solüsyonu ile bölgeyi temizledikten sonra steril aletler kullanarak tümörü çıkar.
    5. Steril aletler kullanarak biyolojik bir güvenlik kabininde, neşter bıçak kullanarak 10 cm doku kültürü çanak üzerinde küçük parçalar (0.2 cm) halinde tümör kıyma. Adım 1.1.1'de açıklandığı gibi 1 mL HBSS kullanarak tümör parçalarını 70 μm hücresüzden geçirin. 200 μL'de 7,5 x 105 hücre elde etmek için %0,9 tuzlu çözelti kullanarak hücreleri sayın ve seyreltin.
    6. Analize erkek NOD scid gama fareler (ağırlık 25 g) kullanarak 4% isoflurane kullanarak 1 L/dk ve anestezi korumak 2% izofluran. Fareler anestezi edildikten sonra, 27 gauge iğne kullanarak fare kanadının deri altı dokusuna adım 1.1.5'ten çözeltinin 200 μL'sini enjekte edin.
  2. VX2 hücrelerinin in vitro olarak toplanması ve geçirilmesi
    1. Tümörler kaliper kullanarak çapı 1 cm'ye ulaşana kadar ksenogreft büyümesini klinik olarak haftada iki kez izleyin.
    2. Bir CO2 odasına yerleştirerek veya % 4 isofluran gazı ile anestezi sonra servikal çıkış gerçekleştirerek fareler ötenazi. Biyolojik güvenlik kabininde steril koşullar altında tümörleri tüketim.
    3. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) 3 mL içeren 6 cm doku kültürü çanak 1-2 mm adet içine bir neşter ile kıyma tümörleri / Ham's F12 + 10% fetal sığır serum (FBS) medya.
    4. Hücreler tümör parçalarından büyümeye başlayana kadar tümör parçalarını %5 CO2 ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde bozulmadan iki gün bekletin. Daha sonra, hücre birleşmesi için ışık mikroskobu ile günlük kültürlü plakaları kontrol edin. %70 birleştiğinde, şişeye %0,05 tripsin 1 mL ekleyerek ve 37 °C inkübatöre 5 dakika süreyle geri koyarak hücreleri trypinizie eler.
    5. 6 mL DMEM/Ham F12 + %10 FBS orta ile tripsini nötralize edin, 4 °C'de 300 x g'de5 dk hücre ve santrifüj toplayın. Yeni DMEM/Ham'ın F12 + %10 FBS medyasında 3,5 mL'lik süpernatant ve yeniden askıya peletçıkarın. Tohum taze 6 cm kollajen I plakaları ile kaplı plakalar 1.6 x 106 plaka başına plaka başına yaklaşık% 50 hücre tohumlama yoğunluğu elde etmek.
      NOT: %50 hücre yoğunluğu, bağlıyken plakanın yüzey alanının %50'sini alan hücreleri ifade eder.
    6. Erken geçiş: Yukarıdaki işlemi (deneme, tohumlama) hücreler 5 kez geçirilinceye kadar tekrarlayın ve tavşan genomik DNA'sını fare genomik DNA'sından ayırt etmek için nicel bir PCR testi kullanarak PCR ile hücre hattı saflığını değerlendirin (bkz. adım 1.3.1-1.3.4).
      NOT: 8 pasajdan sonra hücreler kollajen olmayan kaplamalı düzenli yapışık doku kültür plakaları üzerinde yayılabilir.
    7. DMEM/HAM F12+%30 FBS+%10 DMSO'daki hücrelerin flakon başına 2 x 106 konsantrasyonda geçiş, trypnize ve dondurun. Deneyler için gerekli olana kadar hücreleri sıvı nitrojende saklayın.
  3. Hayatta kalan hücrelerin VX2 kökeninin teyidi:
    1. Saflaştırılmış genomik fare ve tavşan DNA'sından standart bir tedavi oluşturun (Adım 1.3.2 ve Adım 1.3.3). LINE-1 retrotransposon elemanının ikinci açık okuma çerçevesi içinde türe özgü dizileri hedefleyen astarlar kullanın.
      NOT: CRPV E6 için astar dizileri şunlardır: 5'- GATCCTGGACCCAACCAGTGand 5'-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. LINE-1 retrotranspozon elemanları kullanıldı. Tavşan LINE-1 için Astar dizileri şunlardır: 5'-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC ve 5'-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGT GTGT Astar lı mouse LINE-1 için şunlardır: 5'-AATGGAAAGAACATTCACGTG ve 5'-CCTTCCTTTTGACCAAGGTATTTG
    2. CRPV E6 için standart bir eğri oluşturmak için, üreticiprotokolüne uygun ticari bir kit kullanarak VX2 tümör hücre lisat (Step 1.1.1) arındırın. Ticari bir analiz kullanarak bu DNA'yı ölçün. Düşük EDTA-TE tamponunda 225 pg/μL'den 0,925 pg/μL'ye kadar 6 seri seyreltme gerçekleştirin. Fare genomik DNA'sı için standart bir eğri oluşturmak için, düşük EDTA-TE tamponunda 100 μg ticari fare genomik DNA'sını 125 pg/μL'den 0,0125 pg/μL'ye kadar 5 seyreltmede seyreltin.
    3. 1.3.2 basamaktaki numunelerden alınan her seyreltilmiş çözeltiden 4 μL'lik bir çözeltiyi kuyulara yerleştirin ve numuneleri bir PCR termocycler'da çalıştırın. Termocycler yazılımı otomatik eşik ayarlarını kullanarak standart bir eğriyi hesaplamak için her çalıştırmadaki Cq değerlerini ve her bir çalışandaki DNA miktarlarını kullanın.
    4. Bir termocycler üzerinde 2 adımlı bisiklet (98 °C ve 60 °C) 40 döngü ile PCR gerçekleştirmek için standart qPCR prosedürleri kullanın. Tavşan VX2 hücre hattında en az fare kontaminasyonu olduğundan emin olmak için eşik değerleri belirleyin ve delta Ct değerlerini >35'te ayarlayın. Her reaksiyonun toplam hacmi 10 μL, 5 μL 2x Mastermix, 1 μL ileri + ters astar 250 nM reaksiyonda son astar konsantrasyonu ve 4 μL DNA örneği nden oluşuyordu.
      NOT: PCR performans ayrıntıları içinreferanslar 54,55 bakın. Eşik değerleri oluşturulur ve tavşan VX2 hücre hattında en az fare kontaminasyonu olduğundan emin olmak için delta Ct değerleri >35 olarak ayarlanır. QPCR ile güvenilir algılama için önerilen VX2 DNA seviyesi 1-10 pg'dir.

2. VX2 hücre kültürü ve hücre süspansiyon oluşturulması

  1. VX2 hücreleri içeren (adım 1.2.7'de dondurulmuş) 37 °C'de bir su banyosunda 1 dakika boyunca çözülme şişeleri ve hücreleri 10 mL kültür ortamına sahip konik bir santrifüj tüpüne aktarın (1:1 DMEM/F-12 + %10 FBS ve %1penisilin-streptomisin). 107 x g8 dakika santrifüj, supernatant atın ve medya 9 mL hücre pelet yeniden askıya.
  2. Yeniden askıya alınan hücreleri büyük bir kültür şişesine aktarın. Hücreleri 37 °C'de titremeden kuluçkaya yatırın. Işık mikroskobu kullanarak hücreleri günlük olarak kontrol edin ve kültür ortamını her üç günde bir değiştirin.
  3. Enjeksiyon için kültürlü VX2 hücre süspansiyonunun oluşturulması
    1. Hücreler %80 birleştiğinde şişeye 3 mL 0.25 tripsin ekleyerek hücreleri trypınıe. 5 dk. Konik santrifüj tüpüne çözelti ve 107 x g'de 8 dk santrifüj için solüsyon aktarın ve süpernatantı çıkarın.
    2. Hücre peletlerini 9 mL fosfat tamponlu tuzlu su, santrifüj ile 3 kez yıkayın ve yukarıdaki gibi supernatant çıkarın. Hücreleri sayın ve 4 x 107 hücre/mL konsantrasyonuna %0,9 fosfat tamponlu tuzlu çözelti ile seyreltin ve buz üzerinde steril konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
  4. Enjeksiyon için in vivo propagated VX2 hücre süspansiyonunun oluşturulması
    1. Dondurulmuş VX2 tümör blokları (1 cm x 1 cm), neşter bıçağı kullanarak bir kültür plakası üzerinde kıyma ve adım 1.1.1 gibi 70 μm filtre ile zorlanma çözülme. Tüm hücrelerin son hacmi 1 mL'lik bir süre için gergin olduğundan emin olmak için az miktarda HBSS ekleyin. Hücreleri sayın ve 1 x107/mL konsantrasyonuna % 0.9 fosfat tamponlu tuzlu ile seyreltin ve steril bir tüp içinde buz üzerinde yerleştirin.
      NOT: Tümör blokları, tavşan kuadriseps kaslarında VX2 tümörlerinin daha önce yayılmasından bir laboratuvar işbirlikçisinden elde edilmiştir.

3. Cerrahi Model Kurulumu

  1. Cerrahi anestezi nin kurulması ve ameliyat öncesi hazırlık
    1. Pre-medicate kadın beyaz Yeni Zelanda tavşan (2.5-3.5 kg) 1 saat önce acepromazine enjeksiyonları kullanarak planlanan cerrahi işlem (1 mg / kg IM) ve meloxicam (0.2 mg /kg SQ). % 2-5 inhale isoflurane ile bir kadın beyaz Yeni Zelanda tavşan (ağırlık 2.5-3.5 kg) anestezi, enjeksiyon sitesi örten kürk kaldırmak ve povione-iyot çözeltisi ile enjeksiyon sitesi temizlemek.
    2. Entübatize antakte tavşan laringeal maske hava yolu kullanarak (LMA) ve bant ile yerinde güvenli, inhale isofluran dozu% 2-5 arasında titrating tarafından derin anestezi koruyarak. Hayati belirtileri kontrol ederek (solunum hızı, kılcal dolgu, varsa oksijen doygunluğu) ve ağrıyı düşündüren belirtilerin izlenmesi (hareket, uyaranlardan çekilme, sesler) veya ışık tanitibaren ameliyat anesteziyi işlem boyunca düzenli olarak izleyin anestezi (hareket, LMA tüpü çiğneme).
      NOT: Bu cerrahi anestezi izleme deneyimi olan biri tarafından yapılmalıdır.
    3. Marjinal dorsal vene 22-gauge kulak-ven kateteri yerleştirin. Cerrahi deri kesisi öncesinde sefazolin (20 mg/kg) intravenöz 10 dk uygulayın.
    4. Ameliyat masasına tavşan yerleştirmeden önce pelvis ve karın üzerinde Klip saç, daha sonra ameliyat masasına bir sırt pozisyonunda tavşan yerleştirin. 3 aşamalı cerrahi cilt hazırlığı (betadin sabunu, klorheksidin solüsyonu, betadin solüsyonu) kullanarak cerrahi alanı temizleyin. Kasık kemiğinin üst kısmını toprakla işaretledikten sonra cerrahi alanı laparotomi perdeleri ile örtün ve alt karının 5 cm x 5 cm'lik alanını açıkta bırak.
  2. Laparotomi kesisinin oluşturulması ve rahim boynuzlarının tanımlanması
    1. Cerrahi bir şapka ve yüz maskesi tak. Klorheksidin veya betadine cerrahi scrub solüsyonu kullanarak ellerinizi temizleyin. Steril tekniği kullanarak, steril bir elbise ve steril cerrahi eldiven giyin.
    2. # 11-blade neşter kullanarak, deri ve tavşan karın deri ve deri altı doku yoluyla symphysis pubis için 2.5 cm uzunluğunda kesi 1 cm cranial olun. Rektus fasyası incise ve altta yatan periton ortaya çıkarmak için yanal rektus kasları incelemek. Yüzey altıbağırsak veya diğer karın organları temiz olduğundan emin olduktan sonra keskin periton girin.
    3. Idrar kesesini tanımlayan ve eldivenli bir parmağı üstün, posteriora ve yanal olarak mesanenin tepe üzerinde süpüren rahim boynuzları bulun.
      NOT: Gerekirse, tam mesane dijital basınç kullanılarak boşaltılabilir. Bir kez bulunan, karın duvarı üzerinde dinlenmek için karın kesisi ile rahim boynuzları getirmek.
    4. 3-0 örgülü emilebilir dikiş kullanarak, cervices yaklaşık 1.5-2.0 cm distal her rahim boynuzu tek bir dikiş ligasyon gerçekleştirin. Her boynuz lateral yönü boyunca çalışan rahim arterler, sadece medial dikiş yerleştirin. Distal uterin boynuzları tıkamak için dikişleri snugly kravat(Şekil 1).
  3. Miyometriyal VX2 aşısı
    1. 27-gauge iğne kullanarak, dikiş bölgesine (dikiş site arasında) her uterin boynuz proksimal miyometrium içine adım 2.3.2 (kültürlü VX2 modeli için) veya 2.4 (in vivo propagated VX2 modeli için) daha önce hazırlanmış VX2 hücre süspansiyon 0,5 mL enjekte ve serviks). 1 dakikadan fazla enjekte edin ve hücrelerin altta yatan rahim boşluğuna enjekte edilmediğinden emin olun. Inhale isofluran kullanarak anestezi keleretler (%2-5) ve Bain devresi olan bir anestezi makinesi.
    2. Hücrelerin sızıntısını en aza indirmek için enjeksiyondan sonra 30 s için miyomdeneme enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın. Hemostaz için enjeksiyon ve dikiş siteleri inceleyin ve karın içine rahim boynuzları geri yerleştirin.
  4. Cerrahi kesinin kapatılması
    1. Derin karın duvarı kapatma: Periton kesisini belirleyin ve periton, rektus kası ve fasyayı doku forsepsi ile tutarak tutun.
      1. Bunu yapmak için, kesi bir tepe de kesi derin ve derin diğer yüzeysel yüzeysel yüzeysel yüzeysel yüzeysel yüzeysel yüzeysel yüzeysel dikiş tarafından dikiş çapa. Düğüm at. Ekli sütür kullanarak, karın duvarının katmanları aracılığıyla kesiye dik dikişler bir taraftan diğer yana kesi boyunca adım-akıllıca çalışma yapmak. Dikiş ve kesme kravat.
    2. Yüzeysel karın duvarı kapatma: Deri kesi sinin apeksini belirleyin ve gömülü subcuticular 3-0 emilebilir poli-filament sütür kullanarak karın derisini dikin. Cilt kenarlarına karşı kapalı kesi cerrahi tutkal uygulayın.
      1. Bunu yapmak için, kesi bir tepe de dikiş çapa, kesi bir tarafında yüzeysel derin dikiş ve diğer derin yüzeysel. Düğüm at. Ekli dikişleri kullanarak, dermal tabakada, kesi boyunca yan yana çalışan kesiye paralel dikişler yapın. Dikiş ve kesme kravat.
  5. Ameliyat sonrası bakım
    1. Anesteziden uyanma: Kesi kapatıldıktan sonra isofluran'ı kapatın ve uyanışın belirtilerini izlerken tavşanın maskeyle oksijen solumasına izin verin (örn. spontan hareketler, göz açma ve gırtlak maskesi hava yolundaki çiğneme hareketleri). Bu işaretler belirtildiğinde tavşan ektübate ve tavşan uyarı ve bağımsız olarak oturup kadar maske ve sıcak bir battaniye ile oksijen sağlamak.
    2. Ameliyat sonrası izleme: Tavşanları günde iki kez 4 gün ve ameliyat sonrası 10 gün boyunca günde iki kez izleyin. Genel durumlarını, yiyecek ve su alımlarını, idrar ve dışkı çıkışlarını, ağrı değerlendirmelerini, ağırlıklarını, hayati belirtileri (kalp hızı, solunum hızı) ve şişlik, eritem, akıntı veya şişkinlik arayan cerrahi yerlerini izlemek, değerlendirmek.
    3. Postoperatif ağrı kontrolü: Meloxicam'ı günlük (0.2 mg/kg SQ) ameliyat sonrası 48 saat ve ağrı değerlendirmesine göre gerektiğinde uygulayın. Ameliyat sonrası hemen buprenorfin ivedi ve her 12 saat (0.01-0.05 mg/kg SQ) 24 saat ve sonra ağrı değerlendirmesine göre gerektiğinde
    4. Antibiyotikler (enrofloksasin 5mg/kg IM) veterinertarafından tavsiye edildiği gibi yara enfeksiyonunu önlemek için ameliyat sonrası yedi gün boyunca günlük olarak verilebilir. Dehidratasyon ve yumuşak gıdalar veya diğer diyet takviyeleri için gerekli günde iki kez subkutan sıvılar (15 mL SQ) uygulayın kilo kaybı için gerektiği gibi günlük olarak sağlanmaktadır.

4. Tümör Büyüme İzleme

  1. Klinik İzleme: Post-operatif gün 14'ten itibaren tümör büyümesinin klinik belirtileri için her 2 günde bir tavşanları izleyin. Tümör büyümesinin klinik belirtileri azalmış oral alımı içerebilir, uyuşukluk, abdominal hassasiyet, palpabl abdominal kitle ve sekotrofi kaybı.
  2. Görüntüleme ve invaziv izleme
    1. BT görüntüleme: Ameliyat sonrası gün 21-28, pre-medicate, anestezi ve entübasyon tavşan daha önce 3.1.1-3.1.2 açıklandığı gibi. Bir pre-klinik CT tarayıcı bir dorsal pozisyonda tavşan pozisyon ve intravenöz iohexol kontrast ajan 10 mL uygulandıktan sonra pelvis ve karın görüntüleri elde.
    2. Cerrahi izleme: Genel anestezi altındayken görüntüleme den sonra tavşanları ameliyathaneye aktarın. Pozisyon, hazırlık ve daha önce adım 3.1.4 açıklandığı gibi tavşan perde ve önceki kesi ile uzunluğu yaklaşık 1,5 cm tekrar laparotomi kesi gerçekleştirmek. Ve rahim boynuzları tanımlayın ve dikkatle tümör için inceleyin. Kesiyi kapatın ve daha önce adım 3.5.2-3.5.4'te açıklandığı gibi ameliyat sonrası bakım sağlayın.
    3. Tavşan modeli kullanımı: Eğer tavşanlarda cerrahi izleme sırasında tümör olduğu tespit edilirse, planlanan deneyler için tavşan endometrial kanser modellerini kullanın. İn vivo yayılan hücrelerden oluşturulan tavşanları 4 haftalık aşılama sonrası ek deneyler için kullanın ve daha yavaş tümör büyümesini hesaba katmak için yaklaşık 5-6 hafta sonra kültürlü VX2 hücrelerinden oluşturulan tavşan modellerini kullanın. Tümörler 1-1,5 cm çapa ulaştıktan sonra tavşanötenihale (kaliperlerle dışarıdan ölçülür) veteriner onaylı bir yöntemle. Kalp hızı ve solunum hızı da dahil olmak üzere hayati belirtileri kontrol ederek ötenazi doğrulayın. Betadine solüsyonu ile bölgeyi temizledikten sonra steril aletler kullanarak tümörü çıkar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Endometrial kanser modelinin oluşturulmasında yirmi sekiz tavşan kullanıldı. Tavşanların deney sırasında ortalama ağırlığı 2,83 kg (2,71-3,58 kg) olarak ydı. Rahim tümörleri başarıyla% 75 genel bir model başarı oranı için 21 tavşan büyüdü. Protokole rahim dikitinin eklenmesinden önce, rahim dikitesi eklendikten sonra başarı oranı %81 iken% 57 idi. 7. tavşandan sonra ilk düşük model başarı oranına yanıt olarak protokole rahim dikme eklendi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, bir VX2 endometrial kanser modelinin kurulması için standart bir cerrahi yöntem bildirdik ve bu modeli oluşturmak için kültürlü VX2 hücrelerinin ilk kullanımı rapor. Tümör alma oranı% 75 daha önce literatürde bildirilen% 100 oranı dahadüşüktür 35,37,53,56; ancak patolojik olarak doğrulanmış lenf nodaz metastazlarının %90 oranı bu modelin önceki çalışmalar?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Terry Fox Araştırma Enstitüsü (PPG#1075), Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (Vakıf Grant #154326), Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü (704718), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir. Сanada Yenilik vakfı ve Prenses Margaret Kanser Vakfı.

Ben ilk VX2 modeli ve dondurulmuş VX2 tümör blokları kurulması için ilk VX2 hücreleri sağlamak için Dr Marguerite Akens teşekkür etmek istiyorum. Ben Ilk VX2 hücre kültürü deneyleri ve Lili Ding VX2 hücre kültürü ile yardımcı olmak için gerçekleştirmek için yardımcı olduğu için Marco DiGrappa teşekkür etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
11-blade scalpel, Sterile, DisposibleAspen Surgical (VWR)80094-086
22-gague ear vein catheterCDMV14332
3-0 absorbable poly-filament suture (Polysorb)Covidien356718
3-0 braided absorbable suture (Polysorb)Covidien356718
70uM cell strainer, Individually wrapped, NylonFalcon352350
Acepromazine (Atravet)CDMV1047
Betadine soap (Poviodone iodine 7.5%)CDMV4363
Betadine solution (Poviodone iodine 10%)UHN Stores457955
BuprenorphineMcGill University
CefazolinUHN in-patient pharmacyNo Cat # Needed
Chlorhexidine solutionCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 100mm dishesCorning354450brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 24-well platesCorning354408brand not important
Corning BioCoatCellware, Collagen Type I, 6-well platesCorning354400brand not important
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *LDEV-free, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320brand not important
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacin (Baytril injectable)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Fetal Bovine Serum, Qualified, Canadian Origin, 500mlLife Technologies12483020brand/source not important
IsofluraneUHN in-patient pharmacyNo Cat # Needed
Isohexol contrastGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0.5%)CDMV104674
Normal SalineHouse Brand (UofT Medstore)1011
PBSMulticell or Sigma331-010-CL or D8537-500mL
Penicillin/Streptomycin (100mL; 10000U Penicillin, 10000ug Streptomycin)Corning-CellgroCA45000-652
Sterile Hanks Balanced Salt Solution (-Ca++, -Mg++, -Phenol Red)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Jan-11
Surgical Glue (Tissue Adhesive)3M Vetbond14695B
Trypsin (0.25%), Proteomics GradeSigmaT-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0.05%, 100mlWisent Inc325-542-ELbrand not important

Referanslar

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109(2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49(2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859(2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmaSay 151Endometrial KanserOrtotopik kanser modeliVX2 h cre hattLenfadenopatiTav an modeliCerrahi modelH cre K lt r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır