JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

Özet

CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF)-aracılı istikrarlı topolojik etki alanlarını ilişkilendirme (TADs) oynamak önemli bir rol TADs komşu bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri. CTCF embriyonik geliştirme, vücut desenlendirme, hematopoiesis ve leukemogenesis kontrol HOX genleri kayma ve zamansal ifade düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Ancak, olup olmadığını ve nasıl Kromatin organizasyon ve HOX gen ekspresyonu HOX ilişkili loci CTCF sınırları düzenleyen büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Geçerli protokol TAD oluşumu ve HOX gen CTCF ilişkili Kromatin sınırlarına engellemeden etkilerini incelemek için tüm CTCF bağlama HOXA/B/C/D loci Siteler'de hedefleme belirli sgRNA havuza alınan Kütüphane oluşturuldu ifade. CRISPR-Cas9 ile genetik tarama, HOXA7/HOXA9 genler (CBS7/9) arasında bulunan CTCF bağlama sitesinde kritik bir regülatör oncogenic Kromatin etki alanı, hem de Ektopik HOX gen korumak için önemli olarak belirlenmiştir MLL yeniden düzenlenmiş Akut Miyeloid Lösemi (AML) ifade desenleri. Böylece, bu sgRNA Kütüphane yaklaşım eleme içinde belirli bir gen loci aracılı CTCF genom örgüt yeni anlayışlar sağlar ve aynı zamanda her iki kodlama metin notlu genetik düzenleyici elemanlarının fonksiyonel karakterizasyonu için bir temel sağlar ve kodlamayan, sonrası İnsan Genom Projesi dönemde normal biyolojik süreçler sırasında.

Giriş

Son genom etkileşim çalışmaları insan nükleer genom formları hücre tipleri ve türler arasında korunmuş topolojik ilişkilendirirken etki (TADs) kararlı saptandı. Ayrı etki alanları içine genom organizasyonu kolaylaştırır ve düzenleyici elemanlarının (örneğin, arttırıcılar ve rehberleri) arasındaki etkileşimler kısıtlar. CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF) TAD sınırları bağlar ve komşu TADs1içinde bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri kritik bir rol oynar. Ancak, her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler'de etkileşim, bu kez bir hücre tipi ama diğer telkin içinde belirli bir sitenin bir Kromatin bariyer olarak çalışmasını genom geniş CTCF veri bağlama ortaya o CTCF işlevleri Kromatin sınırları2oluşumunda diğer faaliyetleri ile birlikte. Ne bilinmemektedir olsun sınır elemanları (CTCF-bağlayıcı siteleri) doğrudan CTCF biyolojik işleve bağlı olan ve nasıl bu bağlantıları ortaya olduğunu. Bu nedenle, belirli CTCF bağlayıcı siteleri genom içinde doğrudan TADs oluşumunu düzenleyen ve organizatörü/artırıcı etkileşimleri bu etki alanlarında veya komşu etki alanları arasında denetlemek öngörmekteyiz. İnsan ve fare genom sıralama projeleri ve sonraki epigenetik analizleri, genom kopyası yeni moleküler ve genetik imzaları ortaya çıkardı. Ancak, belirli imzaları/değişiklikler gen düzenlemesi ve hücresel işlev, hem de onların moleküler mechanism(s) rolü var. henüz tam olarak anlaşılması

CTCF-aracılı TADs fonksiyonel Kromatin etki alanları3,4,5temsil kanıt birden çok satırı destekler. Her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler'de etkileşim, genom geniş CTCF ChIP-seq veri CTCF bir Kromatin engel bir hücre tipi ama diğer2kez görür saptandı. CTCF genom organizasyonu4,6,7arabuluculuk tarafından geliştirme aşamasında önemli bir rol oynar. CTCF sınırları bozulma engelliler artırıcı/organizatörü etkileşimleri ve gelişimsel tıkanıklık için önde gelen Gen ekspresyonu. Bu CTCF TADs aracılı öneriyor sadece yapısal bileşenleri, aynı zamanda uygun artırıcı eylem ve gen transkripsiyonu5,8,9için gerekli yasal birimleri vardır.

HOX genleri embriyonik gelişim sırasında kritik rol oynarlar ve onlar onların ifade desenleri geçici ve dağınık şekilde kısıtlanır. HOXA locus hESCs ve IMR90 hücreleri1bir sınır CTCF ilişkili öğe anterior ve posteiror genler ayıran iki kararlı TADs oluşturur. Son raporlar gösterdi HoxBlinc, bir HoxB ilişkili locus lncRNA CTCF oluşumu aracılık eder TADs ve HOXB odağı etkileşimlerde artırıcı/organizatörü yönetti. Bu ön HOXB gen etkinleştirme sırasında ESC bağlılık ve farklılaşma10yol açar. Ayrıca, belirli bir gen loci HOXA odağı da dahil olmak üzere, CTCF İLETİMLERİNİZE TAD değişti etki alanları lineage belirli bir gen ifade profilleri aracılı ve hastalık Birleşik11,12gelişimi ile ilişkili. Kanıt CTCF gen transkripsiyonu koordine ve işlevsel etki alanlarına genom organize ederek hücre kimliğini belirlemek için birincil işlevini destekler.

Embriyonik gelişim sırasında hematopoiesis, rolü rağmen hematopoetik kök ve progenitör hücre (HS/PC) işlevi HOX genleri düzenler. Bu10,13,14,15yayılması ve farklılaşma arasındaki dengeyi kontrol ederek yapılır. Ifade HOX genleri sıkıca belirtimi ve hematopoetik hücrelerin en yüksek HS ifadede farklılaşma boyunca düzenlenir / PCs. HOX gen ekspresyonu yavaş yavaş azalır, en düşük fiyat seviyeleri ile olgunlaşma sırasında gerçekleşen hematopoetik hücrelerin16farklı. HOX gen bozukluk HS/PC'lerin lösemik dönüştürme17,-18önde gelen dysregulating kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerine göre lösemik dönüşümünün baskın bir mekanizmadır. Ancak, kurulması ve normal oncogenic ifade desenleri HOX genleri hem de ilişkili düzenleyici ağları vs koruma mekanizması belirsizdir.

CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane tarama protein kodlayıcı genlerin19 lncRNA20 ve miRNA21 farklı türler gibi de kadar kodlamayan genler olarak sorguya çekmek için yaygın olarak kullanılmış. Ancak, yüksek üretilen iş genom sıralama sgRNA Kütüphane tarama doğrulamak için sık sık uygulandığından CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane yeni genomik hedefler belirlemek için maliyeti yüksek, kalır. Bizim sgRNA eleme sistemi belirli genom loci üzerinde odaklanmıştır ve hedefleme sgRNAs aracılığıyla tek adımlı RT-PCR marker gen ekspresyonu HOXA9gibi göre değerlendirir. Ayrıca, sıralama sgRNA genom ve Indel mutasyonlar entegre edildi doğruladı Sanger site hedefleme sgRNA tanımlamak için tespit edilebilir. Loci özgü CRISPR Cas9 genetik tarama yoluyla, CBS7/9 Kromatin sınır oncogenic Kromatin etki alanı oluşturmaktan ve bakımını yapmaktan Ektopik HOX gen ifade desenleri AML patogenezinde önemli bir düzenleyici olarak belirlenmiştir 12. yöntemi gelecekteki epigenetik terapi için potansiyel terapötik hedef olarak embriyonik geliştirme, hematopoiesis, leukemogenesis, aynı zamanda CTCF sınır CTCF sınır sadece belirli işlevini tanımlamak için yaygın olarak uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. CTCF sgRNALibrary Online bir araç kullanarak tasarım

  1. CTCF bağlayıcı siteleri içinde genetik pertürbasyon platformu (GPP) tasarımcı araç (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) kullanarak insan HOX loci hedefleme sgRNA tasarım.
  2. 1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA genler (şekil 1, Tablo 1) Hedefleme hedefleme sgRNAs oluşan toplam sentez. Her hedefleme DNA öğe 5-10 farklı sgRNAs tarafından hedeflenmektedir.

2. sgRNA Kütüphane klonlama

  1. Sentezlenmiş oligonucleotides CRISPR lentiviral omurga vektör (lentiCRISPRv2) kopyalayın.
    1. 2 h 37 ° C'de BsmBI restriksiyon enzimi ile LentiCRISPRv2 vektör sindirmek.
    2. Daha büyük bant varlığı için bak (yaklaşık 12,873 bp) jel BsmBI sindirim sonra Tarih ve sonra jel ekstraksiyon kiti ile arındırmak.
      Not: 2 kb küçük dolgu parça aynı zamanda sindirim sonra üzerinde jel var, ancak bu göz ardı edilmemelidir.
    3. Sentezlenmiş oligonucleotides ligate ve LentiCRISPR vektör 150 ile sindirilmiş ng, LentiCRISPR DNA, 10 µM oligos, 10 x T4 ligaz arabelleğinin 2 µL, T4 ligaz, 1 µL 1 µL sindirmek ve sonra onları gecede 16 ° C'de kuluçkaya.
  2. Lentiviral CRISPR/sgRNA Kütüphane amplifikasyon için elektro-yetkili hücreleri dönüştürme.
    1. Electroporator 1.8 hazırlamak kV, 200 Ω ve 25 µF. Daha sonra kurtarma SOC kitle 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak ve LB Ampisilin antibiyotik plakaları 37 ° C'de önceden ısıtmak
    2. Buz 10 min için yetkili hücrelerdeyse çözülme.
    3. 1.5 mL mikro-santrifüj tüpleri ve 1 mm elektroporasyon cuvettes buzda hazırlayın.
    4. 25 µL 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü yetkili hücrelerinin içine 10 ng/µL Kütüphane plazmid DNA 1 µL mix ve karışımı yavaşça el ile bir kaç kez tüp alt flicking tarafından.
    5. Küvet yeterince soğuk olduğunda, DNA/yetkili cep karışımı için transfer. İki kez tezgah dokunun ve herhangi bir su damlacıkları küvet kağıt mendil ile dış üzerinden silin. O zaman küvet elektroporasyon modülünde yer ve nabız tuşuna basın.
    6. Hemen 975 µL 37 ° C Önceden ısıtılmış SOC medya ekleyin. Karıştırmak yanında yukarı ve aşağı pipetting ve 15 mL tüp aktarmak.
    7. Döndür ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    8. 100 µL hücreleri SOC kitle 900 µL sulandırmak ve 100 µL LB Ampisilin antibiyotik agar tabağa yerleştirin. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
  3. Plazmid DNA ayrıntılı olarak üreticinin iletişim kuralı bir maxi-prep sütun kullanarak Birleşik kolonilerden ayıklayın.
    1. LB agar plaka tüm kolonileri scrape ve 2 mL LB Ampisilin antibiyotik orta starter kültürü aşılamak ve gecede 37 ° C'de dinç (~ 200 x g) sallayarak ile kuluçkaya.
    2. Starter kültür 1:500 LB Ampisilin orta 100 mL seyreltik ve 12-16 dinç (~ 200 x g) sallayarak ile h 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. Santrifüjü 6.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından bakteri hücre Pelet hasat
    4. Bakteriyel Pelet 10 mL süspansiyon arabellek yeniden askıya alma.
    5. Lizis arabellek 10 mL ile askıya alınmış Pelet parçalayıcı ve şiddetle ters 4 - 6 kez. Lysate oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    6. Lysate 10 mL soğuk nötralizasyon arabellek ile etkisiz hale getirin. Yavaşça tüpler 4 - 6 kez ters çevirme tarafından mix ve buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya.
    7. Spin aşağı 13.500 x g 4 ° C'de 30 dk de Derhal yeni bir tüp plazmid DNA içeren süpernatant aktarın.
    8. 2.3.7. adımı yineleyin ve hemen yeni bir tüp plazmid DNA içeren süpernatant aktarmak.
    9. Denge arabellek 10 mL uygulayarak sütun equilibrate ve boş sütuna tarafından yerçekimi akışını sağlar.
    10. Süpernatant sütununu ekleyin ve reçine yerçekimi akış tarafından girmek izin.
    11. Sütun 2 x 30 mL, arabellek yıkama ile yıkayın.
    12. DNA elüsyon arabellek 15 mL ile elute.
    13. 10.5 mL oda sıcaklığında isopropanol eluted DNA ile DNA çökelti. Mix ve spin hemen 15.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de aşağı ve yavaşça süpernatant dikkatle boşaltmak.
    14. DNA Pelet 5 mL % 70 etanol, santrifüj DNA Pelet 10 dak için 15.000 x g de de ile yıkayın ve açık süpernatant atın.
    15. 2.5.14 iki kez daha tekrarlayın.
    16. 15.000 x g 10 dk de DNA Pelet santrifüj kapasitesi ve yavaşça süpernatant DNA Pelet rahatsız etmeden dikkatle boşaltmak.
    17. 5-10dk için Pelet kuruması ve DNA arabelleği (TE tampon, pH 8.0) gerekli bir hacim içinde çözülür.

3. yüksek titresi sgRNA Kütüphane Lentivirus üretimi

  1. Hücre hazırlık: Kültür HEK293T hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 (vol/vol) fetal sığır serum (FBS) ve T-25 şişeler %1 (vol/vol) penisilin-streptomisin (PS) antibiyotik ile takıma DMEM). Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2yer onları.
  2. Lentivirus paket: co transfect HEK293T hücreleri ile arıtılmış Kütüphane vektörlerin adım 2, 15 µg paket plazmid (psPAX2) ve belgili tanımlık virüs hasat önce 48 h (pMD2.G) zarf plazmid 10 µg 20 µg.
  3. Virüs koleksiyonu: sonra 48 s, collectthe virüs süpernatant ve virüs 0,45 µm düşük protein bağlayıcı PVDF membran süpernatant filtre.
  4. Virüs konsantrasyon: 50-fold dar kurutma başlığını kullanarak lentiviral süpernatant konsantre ve adım 5'te virüs MOI test.
  5. Virüs depolama: Aliquot konsantre virüs ve-80 ° C dondurucu deposunda.

4. en iyi duruma getirilmiş puromisindir konsantrasyonu

  1. Lösemi hücre kültürü: Kültür MOLM13 AML hücrelerinde RPMI % 10 (vol/vol) fetal sığır serum (FBS) ve 1 x T-125 şişe penisilin-streptomisin (PS) antibiyotik ile takıma 1640. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2yer onları.
    Not: Hücreleri genellikle bir bölme oranı 1:4 ya da 1:6, asla hücreleri ulaşmak izin daha fazla % 70 confluency, her 4-5 d geçirilir.
  2. MOLM13 hücreleri bir 12-şey plaka 1.0 x 104 hücre/mL, bir şey (2.0 x 104 hücreleri) başına 2 mL hacmi, yoğunluğu ile ayarlayın.
  3. Zamanlı Kurs tahlil: puromisindir artan konsantrasyonları (0.1 µg/mL, 0.2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL ve 2.0 µg/mL) 7 gün için hücrelerle tedavi MOLM13
    1. MOLM13 hücreler puromisindir tedavi gün 0 olmadan ve puromisindir tedavi olarak bir denetim olmadan 3 Çoğalt wells 0 günden 7 gün ayarlayın.
    2. MOLM13 hücreleri 0.1 µg/mL, 0.2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL ve 2.0 µg/mL, ayrı ayrı, 3 Çoğalt wells içeren her deneysel koşulu ile tedavi.
    3. Canlı hücre oranı saymak ve gün 0 gün 7 tüm koşulları içeren bir hayatta kalma eğrisine olun.
  4. Sağkalım eğrisi: leke hücreleri ile her puromisindir konsantrasyon için hayatta kalma eğrileri elde etmek için Trypan mavi ve sayısı canlılığı günlük.
  5. En az puromisindir konsantrasyonu en iyi duruma getirme: hangi tüm MOLM13 hücresi öldürdün 5-7 gün arasında Trypan mavi boyama, üzerinden en az puromisindir konsantrasyonu belirlemek.

5. titrasyon MOLM13 lösemi hücreleri Lentiviral Kütüphanesi

  1. AML hücreleri hazırlık: toplamak MOLM13 AML hücreleri iletim orta ile (RPMI 1640, %10 FBS, % 1 PS ve 8.0 µg/mL kaplama orta) 1.5 x 10 bir yoğunluk6 /mL hücreler.
  2. MOLM13 hücreleri 1.5 x 106 hücrelerde her şey ile 12-şey plaka yerleştirin.
  3. Lentivirus çözülme: Konsantre lentivirus-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve buz çözme.
  4. Mix MOLM13 hücreleri konsantre lentivirus ayrı Wells, 0, 1, 2.5, 5, da dahil olmak üzere farklı bir doz 7.5 ve 10 µL (Toplam 6 grup).
  5. Hemen bu karışımları 1000 x g 33 ° c 2 h için de santrifüj kapasitesi ve 12-şey plakaları 37 ° C ve %5 CO2 kuluçka makinesi 4 h için geri aktarmak.
  6. 4 h sonra spin 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de enfekte hücreleri aşağı.
  7. Yavaşça hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin ve taze medya (RPMI 1640, % 10 FBS ve % 1 PS), transduced hücrelerle yeniden askıya alma ve sonra onları T-25 Şişeler için aktarmak ve puromisindir olmadan 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  8. 48 saat sonra 2 Şişeler (2 grup) bu hücreleri bölme: 1 µg/mL puromisindir ile 5 gün boyunca tedavi bir deney grubu ve kontrol grubu 5 gün puromisindir tedavi olmadan.
  9. Sigara transduced kontrol hücreleri ölene puromisindir seçimi 1 µg/mL puromisindir göre adım 4 ile 5 gün yerine getirir. Taze medya 2 günde karşılığında.
  10. İletim için en iyi duruma getirilmiş MOI değer ile puromisindir puromisindir tedavi olmadan hücre sayısı ile tedavi canlı hücre sayısı bölerek ölçmek.

6. iletim havuza alınan CRISPR-Cas9 KO Kütüphanesi

  1. İletim lentivirus ile: 1.5 x 106 MOLM13 hücreleri havuza alınmış sgRNA lentivirus ortamda 0.3 MOI ile enfekte (RPMI 1640, %10 FBS, % 1 PS ve 8 µg/mL kaplama orta) 6-şey plaka ve hücreleri lentivirus enfeksiyonu olmadan bir denetimi olarak kullanabilirsiniz.
  2. Hemen 1000 x g 33 ° c spinfect ile 2 h için de 6-şey plaka hücreleri santrifüj kapasitesi ve tabakları 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 4 h için geri aktarmak.
  3. 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de enfekte hücreleri aşağı spin.
  4. Yavaşça hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin ve taze medya (RPMI 1640, % 10 FBS ve % 1 PS), transduced hücrelerle yeniden askıya alma ve sonra onları T-25 Şişeler için aktarmak ve puromisindir olmadan 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
  5. 48 saat sonra 5 gün için 1 µg/mL puromisindir hücrelerle tedavi. Taze medya için 2 gün sonra döviz ve optimum hücre yoğunluğu devam et.
  6. Seyreltme yöntemleri sınırlama ile 96-iyi tabaklar tek klon tohum ve 37 ° C ve % 5 CO2tek bu klonlar kuluçkaya. Onları 3-4 hafta boyunca kültür.
  7. Tek bir hücre bir nüfus büyür sonra hücrelerin yarısı 24-şey plakaları puromisindir seçimi altında daha fazla kültür için içine transfer ve bir sonraki adımda bu klonlar doğrulayın. Hücreleri kalanı tutmak.

7. tek adımlı RT-qPCR havuza alınan CRISPR-Cas9 KO kitaplıkla taranması

  1. Marker gen HOXA9 bir adım ters transkriptaz Polimeraz zincir reaksiyonu (tek adımlı RT-qPCR) ile ifade değerlendirerek eleme sgRNA entegre klon etkinliğini belirlemek.
    Not: HOXA9 son derece leukemogenesis22,23MOLM13 AML hücrelerinde ifade.
  2. Kont sgRNA MOLM13 ve transfer 1 x 104 hücreyi iyi bir 96-şey PCR plaka başına entegre.
  3. 1000 x g 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi ve sonra iyice kaldırmak ve süpernatant ile bir damlalıklı hücre Pelet bozmadan atın.
  4. PBS arabelleği 125 µL hücrelerle yıkama ve 1000 x g 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi. Sonra bir pipet kullanarak süpernatant 120 µL kaldırmak ve yaklaşık 5 µL PBS her iyi muhafaza.
  5. Hücre lizis arabellek, İndinavir K çözüm (10 mg/mL) 1 µL ve Dnaz çözüm (1 mg/mL) 1 µL 48 µL içeren hücre lizis ana Mix 50 µL her şey için ekleyin. Sonra yukarı ve aşağı hücre Pelet yeniden askıya almak için 5 kez damlalıklı.
  6. Karıştırmak 37 ° C'de 5 dk ardından oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya ve sonra 75 ° C 5 min için.
  7. Hücre-80 ° C dondurucu, lysate saklayın.
  8. Tek adımlı RT-qPCR reaksiyon hazırlanması: tek adımlı tepki mix ve diğer reaksiyon bileşenleri ile 4 ° c çözme O zaman kısaca çözümleri borular alt toplamak ve ışık olmadan buzda yerleştirmek için spin aşağı. Mix ve yavaşça döndürün.
  9. Hücrenin lysate 1 µL PCR wells marker gen ileri astar 1 µL dahil olmak üzere RT-qPCR reaksiyon karışımı ile eklemek (300 nM) ve ters astar (300 nM), ters transkriptaz (10 U/µL) 0,125 µL ve 5 µL tek adımlı tepki mix (2 x).
  10. Wells optik şeffaf film ve yavaşça girdap ile mühür ve reaksiyon bileşenleri karıştırmak.
  11. 96-şey PCR plaka bir gerçek zamanlı PCR araç üzerinde yerleştirin.
  12. Ardından polimeraz inactivation ve DNA denatürasyon 95 ° C'de 1 dk 50 ° C'de 10 dakika için ters transkripsiyon tepki çalıştırmak
  13. RT-PCR ile PCR reaksiyon 40 devir gerçekleştirmek: denatürasyon 15 95 ° C, tavlama/uzantı ve plaka floresan için 20 okuma s s 60 ° C ve 2-5 s/adım 0.5 ° C artışlarla üzerinden 65-95 ° c eritebilir eğrisi analizi.
  14. Upregulated, downregulated ve HOXA9 gen ifade düzeylerine göre hiçbir değişiklik grupları kıyasla denetim için ayrı ayrı ayarlayın. β-aktin gen bir temizlik gen denetimi olarak kullanın.

8. entegre sgRNAs olumlu klonlar Genotipleme ve Sanger sıralaması ile doğrulanması

  1. Azalma HOXA9 ifade klonlar Sanger aracılığıyla doğrulamak sıralama ve PCR 50-100 ng MOLM13 genom DNA, 5 µL polimeraz tepki arabellek (10 x), 1 µL ileri astar (10 µM) ile gerçekleştirmek (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) ve 1 µL ters astar (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), 1 adet polimeraz (5 U /µL). İlk denatürasyon 94 ° c ile PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için 30 s ve sonra daha fazla denatürasyon 20 94 ° C'de 20 56 ° C'de tavlama s, s, uzantısı 20 68 ° C'de s (Toplam 30 döngüleri), 10 dk 68 ° C'de son uzantısı ve 4 ° C'de tutma
  2. Hulâsa ve PCR arıtma kiti ile PCR ürünleri (boyutu 285 bp) arındırmak.
  3. 2 µL T4 ligasyonu arabelleği (10 x), 50 ng T vektör DNA ile T vektör içine arıtılmış PCR ürünleri ligate (50 ng/µL), 25 saf ng PCR DNA (285 bp), 1 µL T4 ligaz (3 adet/µL) yer ligasyonu mix ve bir kuluçka 16 ° C'de içine gecede.
  4. Tüp ligasyonu mix DH5α yetkili hücreye transfer LB Ampisilin antibiyotik agar tabağa büyümek ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
  5. LB plaka tek klonlar almak ve onları Genotipleme ve Sanger tarafından doğrulayın sıralama.

9. sgRNAs Induced Indel mutasyon nükleaz sindirim tahlil tespiti

  1. SgRNA entegre tek klon Indel oranları nükleaz test tahlil tarafından indüklenen algılamak.
  2. Ayrı ayrı 50-100 ng Indel mutant (test) ve vahşi-tipi (WT, başvuru) DNA PCR şablon olarak PCR amplicons hazırlamak 5 µL polimeraz tepki tampon (10 x), 1 µL dNTP (10mM), 1 adet polimeraz (5 U/µL), 1 µL ileri astar (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') ve 1 µ L ters astar (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). PCR reaksiyon ilk denatürasyon 30 s için 98 ° C'de ve sonra denatürasyon 20 98 ° C'de gerçekleştirildi 20 56 ° C'de tavlama s, s, 30 s (Toplam 30 döngüleri) için 72 ° C'de uzantısı ve 10 dk 72 ° C'de son uzantısı ve 4 ° C'de tutan
  3. 200 ile heteroduplex karışımı grubu "başvuru" (20 ng/µL) ve 200 ng ng "test" (20 ng/µL) PCR amplicons 0.2 mL PCR tüp ve homoduplex karışımı grubu ile sadece 400 ng "referans" PCR amplicons kontrol olarak.
  4. Ayrı ayrı heteroduplex ve homoduplex karışımı bir 1 L ölçek 800 mL su ile dolu ve sonra serin aşağı yavaş yavaş tavlama ve heteroduplex veya homoduplexes oluşturmak için oda sıcaklığında 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya.
  5. Ayrı ayrı Özet 400 ng tavlanmış heteroduplex ve homoduplex karışımdan 1 µL Indel mutasyon algılama nükleaz (2.5 U/µL) ve 2 µL nükleaz tepki arabellek (10 x) 42 ° c 60 dk için.
  6. Özel Jel Elektroforez ile sindirilir örnekleri analiz, heteroduplex karışımı DNA küçük parçaları (70-250 bp) ve homoduplex DNA'sı içine kesmek gerekir (320 bp) değil kesilmelidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

CRISPR-Cas9 teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için bir güçlü araştırma araçtır. Bu düzenleme teknikleri geleneksel gen hızla değiştirme ve genom genelinde hem bireysel gen odaklı uygulamaları için yüksek faydalı vardır. Burada, ilk tek tek klonlanmış loci özgü CRISPR Cas9 dizilmiş sgRNA kitaplığı 1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA hedefleyen sgRNAs oluşan ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

SgRNA kütüphaneler genler ve ağ sgRNA zenginleştirme24,25,26 aracılığıyla belirli hücresel işlevleri düzenleyen tanımlamak için bir işlev tarama sistemi uygulanmış olan protein kodlayıcı gen ile ilgili ,27,28. SgRNA kütüphaneler gene özgü işlevsel ekranları distal ve proksimal elemanları, BCL11A, Tdgf1a ve ilaç dire...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması var.

Teşekkürler

Yazarlar ayrıca el yazması düzenleme için Nicholas Cesari teşekkür ederiz. İş Ulusal Sağlık Enstitüsü (S.H., R01DK110108, R01CA204044) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 3000 reagentThermo Fisher ScientificL3000-008
Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
PuromycinThermo Fisher ScientificA1113802
Stbl3 cells Life Technologies C737303
HEK293TATCCCRL-3216
MOLM-13DSMZACC 554
lentiCRISPRv2Addgene52961
pMD2.GAddgene12259
psPAX2Addgene12260
pGEM®-T Easy Vector Systems PromegaA137A
T4 ligase New England Biolabs M0202S
QIAquick Gel Extract kitQIAGEN28706
QIAuick PCR purification kitQIAGEN28106
SingleShot™ SYBR® Green One-Step KitBio-Rad Laboratories1725095
QIAGEN Plasmid Maxi KitQIAGEN12163
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Thermo Fisher Scientific 11965084
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific11875093
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific10-082-147
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Life Technologies 10378016
Lenti-X Concentrator Clontech631232
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
PolybreneSanta Cruz Biotechnologysc-134220
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific 25-507
TAE buffer Thermo Fisher Scientific FERB49
Surveyor® Mutation Detection KitsIntegrated DNA Technologies706020
Biorad Universal Hood II Gel Doc SystemBio-Rad170-8126
Centrifuge 5424 REppendorf5404000138
Digital Dry Baths/Block HeatersThermo Fisher Scientific88870002
TSX Series Ultra-Low FreezersThermo Fisher ScientificTSX40086V
Forma™ Steri-Cult™ CO2 IncubatorsThermo Fisher Scientific3308
Herasafe™ KS, Class II Biological Safety CabinetThermo Fisher Scientific51022484
Sorvall™ Legend™ XT/XF Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75004506
Fisherbrand™ Isotemp™ Water BathsThermo Fisher ScientificFSGPD02
Thermo Scientific™ Locator™ Plus Rack and Box SystemsThermo Fisher Scientific13-762-353
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855195
MiniAmp™ Thermal CyclerApplied Biosystems technologyA37834
Thermo Scientific™ Owl™ EC300XL2 Compact Power SupplyThermo Fisher Scientific7217581
Thermo Scientific™ Owl™ EasyCast™ B1 Mini Gel Electrophoresis SystemsThermo Fisher Scientific09-528-178
VWR® Tube Rotator and RotisseriesVWR International10136-084
VWR® Incubating Mini ShakerVWR International12620-942
Analytical Balance MS104TS/00METTLER TOLEDO30133522
DS-11 FX and DS-11 FX+ SpectrophotometerDeNovix Inc.DS-11 FX

Referanslar

  1. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  2. Cuddapah, S., et al. Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains. Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).
  3. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  4. Tang, Z., et al. CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription. Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).
  5. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).
  6. Dowen, J. M., et al. Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes. Cell. 159 (2), 374-387 (2014).
  7. Phillips-Cremins, J. E., et al. Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment. Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).
  8. Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).
  9. Narendra, V., et al. CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation. Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).
  10. Deng, C., et al. HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development. Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).
  11. Patel, B., et al. Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).
  12. Luo, H., et al. CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia. Blood. 132 (8), 837-848 (2018).
  13. Dou, D. R., et al. Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development. Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).
  14. Lawrence, H. J., et al. Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells. Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).
  15. Deng, C., et al. USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription. PLOS Genetics. 9 (6), e1003524(2013).
  16. Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis. Blood. 120 (3), 519-527 (2012).
  17. Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia. Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).
  18. Rice, K. L., Licht, J. D. HOX deregulation in acute myeloid leukemia. Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).
  19. Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells. Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).
  20. Zhu, S., et al. Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).
  21. Kurata, J. S., Lin, R. J. MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs. RNA. 24 (7), 966-981 (2018).
  22. Collins, C. T., Hess, J. L. Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets. Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).
  23. Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice. The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).
  24. Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library. Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).
  25. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  26. Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
  27. Zhou, J., et al. Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting. The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).
  28. Sanjana, N. E., et al. High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome. Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).
  29. Rajagopal, N., et al. High-throughput mapping of regulatory DNA. Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).
  30. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).
  31. Rezaei, N., et al. FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics. Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).
  32. Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions. Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).
  33. Wilken, M. S., et al. DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).
  34. Narlikar, L., Ovcharenko, I. Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).
  35. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 145CRISPR Cas9sgRNA K t phane taramaCTCF s n rHOX locitek ad ml RT qPCRIndel mutasyon alg lamaakut Myeloid l semi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır