Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Özet

Tirozin-nitrated proteinlerin proteomik profilleme 3-nitrotirozin modifikasyonunda düşük bolluk nedeniyle zorlu bir teknik olmuştur. Burada, nitropeptid zenginleştirme ve model olarak angiotensin II kullanarak profil oluşturma için yeni bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer in vitro veya in vivo sistemlerde uzatılabilir.

Özet

Protein nitrasyon, Tirozin kalıntılarının en önemli post-translasyonel değişikliklerinden (PTM) biridir ve ökaryotik hücrelerde reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve reaktif azot türlerinin (RNS) kimyasal eylemleri ile indüklenir. Proteinlerin nitrasyon sitelerinin kesin tanımlaması, inflamasyon, yaşlanma ve kanser gibi protein nitrasyon ile ilgili fizyolojik ve patolojik süreçleri anlamak için çok önemlidir. Nitrolanmış proteinler indüklenen koşullarda bile hücrelerde düşük bolluk olduğundan, protein nitrasyon sitelerinin profil oluşturma ve tanımlaması için hiçbir evrensel ve verimli yöntem geliştirilmiştir. Burada bir kimyasal azaltma reaksiyonu ve biotin etiketleme kullanarak nitropeptid zenginleştirme için bir protokol açıklayan, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi izledi. Bizim yöntemimizde, nitropeptid türevleri yüksek doğruluk ile tespit edilebilir. Yöntemimiz daha önce bildirilen yöntemlerle karşılaştırıldığında iki avantaj sergiler. İlk olarak, dimetil etiketleme, nicel sonuçlar oluşturmak için kullanılan nitropeptidler üzerinde primer Amin engellemek için kullanılır. İkincisi, NHS-biotin reaktif içeren bir disülfür bağ, daha fazla azaltılmış ve kütle spektrometresi üzerinde algılama sinyalini artırmak için alkylated zenginleştirme için kullanılır. Bu protokol, geçerli kağıda peptid angiotensin II modeline başarıyla uygulandı.

Giriş

Proteinleri 3-nitrotirozin oluşturmak için Tirozin kalıntılarının nitrasyon birçok biyolojik süreçleri düzenler. Tirozin ve 3-nitrotirozin arasındaki farklı kimyasal özellikler nedeniyle, nitoy proteini,^1,2sinyalizasyon etkinliğini tedirgin olabilir. Bu nedenle, proteinlerin nitrasyon sitelerini verimli bir şekilde zenginleştirebilir ve tanımlayacak yöntemler geliştirmek önemlidir. 3-nitrotirozin, fosforilasyon ve asetilasyon gibi diğer PTM formlarına kıyasla proteinlerde düşük bir bolluk modifikasyonu olduğu için, endojen nitrasyon sitelerini doğrudan hücre hatlarından veya doku örneklerinden tespit etmek zordur. Bununla birlikte, nitrotpeptit parçalanma modelini karakterize etmek için kütle spektrometresi (MS) kullanma metodolojisi geliştirilmiştir (örneğin, Zhan & Desiderio³), yeni nitroproteomik yöntemlerin temelini oluşturur.

Şu anda, MS tarafından izlenen bir zenginleştirme adım nitropeptid profil^4,5için en güçlü stratejisidir. Zenginleştirme yöntemleri iki sınıfa sınıflandırılabilir. Bir sınıf, özel olarak 3-nitrotirozin tanıyabilir antikorlar dayanmaktadır, diğer sınıf bir amin grubu için bir nitro grup azaltır kimyasal türetme dayanır ise^4,5. Antikor tabanlı yöntem için, nitrotirozin benzeşimi sütun zenginleştirme için kullanılır, hangi elüe malzeme daha da çözülür ve yüksek çözünürlüklü MS ile analiz,^6,7. Kimyasal türetme tabanlı yöntem için, peptid veya lizin N-Terminus Amin grupları asetilasyon, göreli ve mutlak niceleme (iTRAQ) veya tandem kütle etiketleri (TMT) reaktifler için isobarik Etiketler tarafından ilk adımda engellenmelidir. Sonra, bir redüksiyoner aminotyrosine nitrotirozin azaltmak için kullanılan yeni oluşturulan amin grubu değiştirerek takip, hangi biotin ligasyon içerir, sülphydril peptid dönüşüm, veya etiketleme sistemleri diğer türleri⁸,^{9, 10,11}. Şimdiye kadar kurulan protokollerin çoğu, Endogenously nitrolanmış proteinler yerine in vitro Over-nitrolanmış proteinlere dayanmaktadır.

Bu çalışmada, nitrotirozin kimyasal türevisini değiştiren bir prosedür, MS algılama sırasında gelişmiş hassasiyet gösteren ve miktarlama amacı için uygun olan nitropeptid zenginleştirme ve tanımlaması için geliştirilmiştir. Bu yöntemi kullanılan biyolojik sistemlerde yapılan son çalışmamızda, miyeloid türevi bastırıcı hücrelerden (MDSCs) üretilen RNS tarafından Tyr394 de lenfosit-spesifik protein Tirozin kinaz (LCK) nitrasyon, önemli bir rol oynar tümör mikro bağışıklık bastırma¹². Bu nedenle, nitropeptid tanımlama yöntemimiz karmaşık biyolojik örneklere de uygulanabilir. Burada, biz model peptid angiotensin II kullanarak protokollerimizi tarif, hangi parçalanma deseni bilinen ve yaygın nitroproteomik çalışmalar kullanılır^8,9,10,11, örnek olarak.

Protokol

1. Anjiyotensin II nitrasyon

1. Nitrolanmış peptid oluşturmak için, 390 μL PBS çözeltisi (10 mm Nah₂Po₄, 150 mm NaCl, pH 7,4) içinde 10 μL angiotensin II (drvyıpf) ebeveyn çözeltisi (su içinde 2 mm), 50 μM son konsantrasyonda seyreltilmiştir.
2. 10 μL Peroksinitrit ekleyin (200 mm içinde 4,7% NaOH) Anjiyotensin II çözeltisi son konsantrasyon Peroksinitrit 5 mm yapmak.
   Not: Peroksinitrit dengesiz ve kolay asit formunda olduğunda çözmek için, böylece Peroksinitrit ebeveyn çözeltisi temel çözelti tutulur ve-80 °c saklanır.
3. 1 M HCl tarafından 7-8 için çözümün pH değerini ayarlayın. Nitrasyon reaksiyonu başlatmak için, 5 dakika boyunca 400 rpm 'de tüpü sallayın.
4. Salting için ticari olarak kullanılabilir bir ters faz SPE sütunu ( malzeme tablosunabakın) kullanın.
   1. Temizleme için 2 çözelti, su içinde% 5 metanol ve elüsyon için suda% 80 metanol hazırlamak.
   2. Ekleme 500 μL metanol, ardından 500 μL su tarafından ardından sütun ön koşula, 1 ml pipetör üzerine ucu ile sütunun üstüne koyun, akış hızlandırmak için pipetör basın.
   3. Yük 410 μL örnek adım 1,3 sütununda, akış yoluyla atın.
   4. 500 μL ile yıkandıktan sonra% 5 metanol,% 80 metanol 300 μL kullanın, daha sonra oda sıcaklığında varsayılan ayar olarak hız-VAC ile tamamen kurutulur.
      Not: desalting reaksiyonlar için çok önemlidir, çünkü bir önceki adımda sol solvent sonraki adımlarda olumsuz bir etkiye sahip olabilir.

2. dimetil etiketleme ile primer aminlerin alkilasyonu

1. 100 μL 100 mM triethylammonium bikarbonat (TEAB) çözeltisi içinde toz Nitro-Anjiyotensin II yeniden oluşturur.
   Not: çözümün pH değeri 7 ile 9 arasında olmalıdır ve çözüme birincil Amin eklendiğinden emin olun.
2. Çözüme 4 μL% 4 formaldehit ekleyin, kısaca karıştırın.
   DIKKAT: formaldehit buharı toksik; bir duman kaputu deneyler yapmak.
3. 4 μL 0,6 M NaBH₃CN eklemek için çözüm, oda sıcaklığında 1 saat için 400 rpm 'de tüp sallayın.
4. 16 μL% 1 amonyak çözeltisi ekleyerek etiketleme reaksiyonu hafifletmek, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inküye.
5. Çözeltinin asitlenmesi için 8 μL formik asit ekleyin ve 1,4 adımda açıklandığı gibi ters faz SPE sütununu kullanarak tuzlama gerçekleştirin.

3. aminotirozin nitrotirozin azaltılması

1. 500 μL PBS (10 mM NaH₂Po₄, 150 mm nacl, pH 7,4) içinde dimetil etiketli Nitro-ANJIYOTENSIN II yeniden oluşturur.
2. Solüsyona 10 μL 1 M sodyum dithionate ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inküye yapın. Azaltma reaksiyonunun ardından, çözümün sarı rengi açık hale gelir.
   Not: tartım 174,1 mg sodyum dithionate ve son hacmi 1 mL yapmak için suda çözülür. Bu çözüm-20 °C ' de bir haftadan daha uzun süre saklanabilir.
3. 1,4 adımda açıklandığı gibi Petrolün tuzsuzlaşması için ters faz SPE sütun kullanın.

4. biotinylation, zenginleştirme, ve algılama

1. 500 μL PBS (10 mM NaH₂Po₄, 150 mm nacl, pH 7,4) içinde dimetil etiketli amino ANJIYOTENSIN II yeniden oluşturur.
2. 5 μL 40 nM NHS-S-S-biotin ekleyin, DMSO içinde çözünür, çözüm için, oda sıcaklığında 2 h inkübasyon sonra, reaksiyonu gidermek için 1 μL% 5 hidroxylamine kullanın.
3. Bu arada, doğrultma streptavidin agaroz boncuk ekleyerek 500 μL PBS (10 mm Nah₂Po₄, 150 mm NaCl, pH 7,4), santrifük olarak 580 x g 5 dakika oda sıcaklığında ve supernatant atarak. Dengelemesinden 3 kez gerçekleştirin.
4. 100 ekleme μL streptavidin agaroz boncuk reaksiyon sistemine, oda sıcaklığında bir döner Shaker üzerinde 1 saat inkük. PBS ile 4 kez yıkayın (10 mM NaH₂Po₄, 150 mm nacl, pH 7,4). Her yıkama adımı için, boncuklar için PBS 500 μL ekleyin, iyi karıştırın, sonra oda sıcaklığında 5 dakika için 580 x g Santrifüjü ve supernatant atın.
5. 400 μL 10 mm ditiyotreitol (DTT) kullanın, 45 dk için 50 °c ' de agaroz boncuklar ile inkük etmek için, oda sıcaklığında 5 dakika için 580 x g aşağı spin ve boncuk atmak, 20 μl eklemek 0,5 M idoacetamid (IAM) karanlık 20 dakika için süpernatant için.
   Not: DTT biotin ve peptid bağlantı arasındaki disülfit bağ kırmak için kullanılır, ikincisi boncuk serbest bırakılır ve IAM tarafından alkylated.
6. 1,4 adımda gösterilen Petrolün tuzsuzlaşması için ters faz SPE sütun kullanın.
7. 20 μL% 0,1 formik asit (FA) içinde kuru peptidler çözümlendikten sonra, her bölümün ürüne tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analiziyle sıvı kromatografi ile bağlıdır.
   1. Değiştirilen Ang II peptitleri 60 dk gradyan elüsyonu ile ayırın (0-8 dk, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 18% B; 35-50 min, 28% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min,% 2 B) bir akış hızında 0,300 μL/dak nano-HPLC sistemi ile doğrudan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile arabirim.
      Not: analitik sütun 75 μm ID, 150 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile doludur. Mobil faz A oluşur 0,1% formik asit, ve mobil faz B oluştu 100% Asetonitril ve 0,1% formik asit.
   2. Veri bağımlı edinme modunda kütle spektrometresi çalıştırın, tek bir tam tarama kütle spektrumunu ayarlayın (300-1800 m/z, 60 000 çözünürlük) ve ardından 20 veri bağımlı MS/MS taramaları% 28 normalleştirilmiş Çarpışma enerjisi.
   3. Kitle spektrum verilerini açın ve kimyasal reaksiyonunun başarıyla gerçekleştirildiğini onaylamak için her adımda ürünün zirvelerini belirleyin.

5. nitropeptid miktarının belirlenmesi

1. Adım 1,4 Nitro-Anjiyotensin II çözeltileri 3 setleri hazırlayın, her set 2 konsantrasyon Nitro-angiotensin II içeren: Set #1, 20 nmol Boru A ve 20 nmol tüp B, her 100 μL TEAB çözüm; Set #2, 10 nmol tüp C ve 20 nmol tüp D, her 100 μL TEAB çözüm; Set #3, 40 nmol tüp E ve 10 nmol tüp F, her 100 μL TEAB çözüm.
   Not: her bir setteki iki Nitro-Anjiyotensin II konsantrasyonları, sırasıyla formaldehit (ışık) ve formaldehit-D2 (ağır) ile reaksiyona girmeden dimetil etiketleme için kullanılır.
2. Her set için, sırasıyla hafif ve ağır olarak etiketlenecek örneğe 4 μL,% 4 formaldehit ve formaldehit-D2 ekleyin. Dimetil etiketleme bitirmek için 2,5 2,3 adımlarını izleyin.
3. Işık ve ağır etiketli örnekleri karıştırın.
4. Azaltma, biotinylation, zenginleştirme ve algılama için 3,1 ila 4,6 arasındaki adımları izleyin.

Sonuçlar

Bu yazıda nitropeptid profilleme için akış şeması Şekil 1' de gösterilir. Şekil 2, 3, 4 ve 5 anjiyotensin ii kütle spektrumlarını göster, Nitro-Anjiyotensin II, DIMETIL etiketli Nitro-Anjiyotensin II ve dimetil etiketli amino Anjiyotensin II, sırasıyla. Bileşik molekül ağırlığı her rakam mono-izotop zirvesinde m/z değerleri ile yansıtılabilir, angiotensin II kimyasal modifikasyonu belirt...

Tartışmalar

Burada protokol nitropeptid zenginleştirme ve profil açıklar. Model peptid olarak angiotensin II kullanarak, Şekil 1' de gösterilen prosedürü tasvir ettik. Nitro-Anjiyotensin II aldıktan sonra, peptit üzerinde primer Amin protokol içinde en önemli adımlardan biri olan daha fazla Amin konjugasyon, önlemek için engellenmelidir. Geçerli protokolde, dimetil etiketleme, primer aminleri iki nedenden dolayı engellemek için kullanılır: ilk olarak, nicel sonuçların satın alınma...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acclaim pepmap 100 C18 column	Thermo-Fisher	164534
1 M TEAB solution	Sigma-Aldrich	T7408
50% hydroxylamine	Thermo-Fisher	90115
Acetonitrile	Thermo-Fisher	A955	MS Grade
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43819
formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Molecular Biology Grade
formaldehyde-D2	Toronto Research Chemicals	F691353
formic acid	Sigma-Aldrich	695076	ACS reagent
Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo
isoacetamide	Sigma-Aldrich	I1149
Methanol	Thermo-Fisher	A456	MS Grade
NHS-S-S-bition	Thermo-Fisher	21441
Oasis HLB column (10 mg)	Waters	186000383
peroxynitrite	Merck-Millipore	516620
sodium cyanoborohydrite	Sigma-Aldrich	42077	PhamaGrade
sodium dithionate	Sigma-Aldrich	157953	Technical Grade
Streptavidin Sepharose	GE Healcare	GE17-5113-01
Ultimate 3000 nanoLC	Thermo