JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Erratum Notice
  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Erratum
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Özet

Sunulan tanısal FL-DNA kiti kolorektal kanser lezyonlarının varlığı güvenilir olasılığını belirlemek için zaman kazandıran ve kullanıcı dostu bir yöntemdir.

Özet

Günümüzde dışkı DNA'sı çeşitli yöntemlerle izole edilip analiz edilebilir. Dışkıdaki uzun DNA parçaları, pre-neoplastik veya neoplastik kolorektal lezyonların varlığına karşı güvenilir bir olasılık sağlayan bir qPCR testi ile saptanabilir. Floresan uzun DNA (FL-DNA) olarak adlandırılan bu yöntem, primer önleme sistemi üzerinde bir gelişme olan hızlı, non-invaziv bir işlemdir. Bu yöntem, genomik DNA'nın belirli hedeflerinin nicel amplifikasyonu ile dışkı DNA bütünlüğünün değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Özellikle 200 bp'den uzun DNA parçalarının değerlendirilmesi, çok yüksek özgüllüğü olan kolorektal lezyonları olan hastaların saptanmasına olanak sağlar. Ancak, bu sistem ve mevcut tüm dışkı DNA testleri ele alınması gereken bazı genel sorunları (örneğin, testlerin yapılması gereken sıklığı ve her birey için her zaman noktasında toplanan dışkı örneklerinin en uygun sayıda) mevcut. Ancak, FL-DNA'nın en büyük avantajı, immünokimyasal tabanlı dışkı okült kan testi (iFOBT) olarak bilinen CRC tarama programında kullanılan bir testle birlikte kullanma imkanıdır. Gerçekten de, her iki test de aynı örnek üzerinde yapılabilir, maliyetleri azaltarak ve kolorektal lezyonların nihai varlığı daha iyi bir tahmin elde.

Giriş

Kolorektal kanser (CRC) hangi sağlıklı epitel yavaş yavaş adenomlar veya polipler, zamanla malign karsinomlar içine ilerleme gelişir çok aşamalı bir süreç türetilmiştir1,2. CRC'nin yüksek insidansı oranına rağmen, ölüm lerin yüzdesinde bir düşüş eğilimi gözlenmiştir3. Nitekim tarama programlarında benimsenen erken tanı araçları pre-neoplastik adenomların veya poliplerin erken saptanması ve çıkarılmasına yol açmıştır4. Ancak, farklı teknik sınırlar nedeniyle, bu yöntemlerin hiçbiri en uygun değildir. Nitekim, duyarlılık ve özgüllüğü artırmak için, birçok dışkı DNA testleri tek başına veya mevcut rutin tanı testleri ile birlikte önerilmiştir5,6.

Tipik olarak, sağlıklı mukoza dışkı akışı apoptotik kolonositler içine döker, hastalıklı mukoza non-apoptotik kolonositler eksfoliyates ise. 200 bp veya daha uzun parçaları non-apoptotic DNA karakterize. Bu DNA uzun DNA (L-DNA) olarak adlandırılır ve CRC erken tanısı için kullanılabilir bir biyomarker haline gelmiştir. L-DNA dışkı örneğinden izole edilebilir ve qPCR tarafından in vitro diagnostik FL-DNA kiti7,8,9,10,11,12kullanılarak ölçülebilir.

Test, 138 bp ile 339 bp arasında değişen FL-DNA parçalarının tespiti için iki testten oluşur. Her bir titre fl-DNA (FAM) yanı sıra ani DNA (HEX) amplifikasyon sağlar. Tüm parçaların en iyi şekilde amplifikasyonlanmasını sağlamak için test iki teste ayrılmıştır ("A" ve "B" olarak adlandırılır). A testi, APC geninin 14 ekon 14 bölgesinin iki bölgesini (NM_001127511) ve TP53 geninin (NM_001276760) ekson 7'sinin bir parçasını algılar. B testi, APC geninin 14(NM_001127511) ekson 14'ünün ve TP53 geninin 5 ve 8 ekonlarının iki bölgesinin (NM_001276760) bir parçasını algılar. Tahliller algılanan bölgeler arasında ayrım yapmaz. Ani DNA Oncorhynchus keta somon DNA karşılık gelir ve prosedür düzgün yapılmış ve yanlış negatif sonuçlar verebilir inhibitörleri olası varlığı için kontrol doğrulama sağlar. FL-DNA konsantrasyonu standart eğri yöntemi kullanılarak mutlak niceleme ile değerlendirilir ve ng/reaksiyon olarak ifade edilir.

FL-DNA yöntemi, immünokimyasal tabanlı dışkı okült kan testi (iFOBT) ile birlikte, şu anda CRC tarama programlarında kullanılan ve CRC ve / veya yüksek riskli adenom lezyonları daha iyi tahminler için izin veren non-invaziv ve ucuz dışkı DNA testi12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hastalar 2013 ve 2015 yılları arasında Meldola'daki (FC, İtalya) Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori'de (IRST) işe alındı. Kayıtlı hastalar IRST Etik Komitesi tarafından onaylanan IRSTB002 protokolüne girmiştir (25/10/2012, ver. 1). Tüm yöntemler ilgili yönerge ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Dışkıdan DNA çıkarma

  1. Dışkı örnekleri hazırlamak için bir kit kullanın (Bkz. MalzemeTablosu). Üreticinin talimatlarına göre çıkarma gerçekleştirerek dışkı malzemeseçin ve tedavi. Saflaştırılmış DNA'yı doğrudan yükseltin veya sonraki analizler için -20 °C'de saklayın.

2. Pozitif kontrol, standartlar, ani DNA ve klinik örneklerin hazırlanması

  1. Standartların ve numunelerin hazırlanması
    1. Pozitif kontrolü, standartları, ani DNA'yı ve tüm klinik örnekleri hazırlamak için, pozitif kontrol, standartlar ve ani DNA'nın bir aliquot'unu santrifüj edin, sonra doğru miktarda su ekleyerek her reaktifi askıya alın (aşağıya bakın). Sonra, dikkatlice pozitif kontrol girdap, standart, ve başak-DNA, sonra 10 s santrifüj. Kuru reaktiflerin tamamen yeniden askıya alınmasını sağlamak için sıvı reaktifleri kullanmadan önce 30 dakika oda sıcaklığında (RT) saklayın.
      1. Pozitif kontrol kuru formatta insan DNA'sudur. Her aliquot'u 750 μL su ile yeniden askıya alın.
      2. Başak-DNA somon(Oncorhynchus keta) DNA, dışkı çıkarılan DNA örneklerinde inhibitörleri olası varlığını doğrulamak için eksojen bir iç kontrol olarak kullanılır. Her aliquot'u 100°L su ile yeniden askıya alın.
    2. Standart eğriyi hazırlamak için, stok çözeltisinden başlayarak dört adet 1:5 seyreltme üretin. Standart noktalar 10 ng/reaksiyon, 2 ng/reaksiyon, 0.4 ng/reaksiyon ve 0.08 ng/reaksiyon olmalıdır.
  2. 1x spike-in DNA'nın hazırlanması
    1. Kullanmadan önce doğrudan ani DNA kontrolünü hazırlayın.
    2. 5 μL FL-DNa çivisini 20 μL steril suyla karıştırarak 1x ani DNA kontrolünü hazırlayın. 1x spike-in DNA kontrol örneklerinin sayısı analiz edilecek numune lerin sayısına ve pozitif kontrole göre hazırlanacaktır.
  3. Örneklerin hazırlanması
    1. Toplam hacmi 100 μL olan 25 μL 1x spike-in DNA ile numunelerin 75°L'sini (klinik numuneler veya pozitif kontrol) karıştırın.

3. QPCR Easy PGX kullanarak FL-DNA değerinin yükseltilmesi ve tayini

NOT: İnsan DNA'sını ve iç kontrolü hedefleyen spesifik astar ve probları içeren komple amplifikasyon karışımları FL-DNA Mix A ve FL-DNA Mix B. Standartları, pozitif ve negatif kontroller için 8 kuyu şeridinde lyophilised formatında sağlanmaktadır ve numuneler her iki liyofilize karışımla güçlendirilmelidir. Klinik numuneler sadece her iki lyophilized karışımları ile çoğaltılması gerekir.

  1. QPCR cihazı ve işletim yazılımı için Malzeme Tablosuna bakın.
    1. Çalışma yazılımını açın ve plakayı ve termal profili ayarlayın:
      1. Plakayı Tablo 1'degösterildiği gibi ayarlayın.
        1. Sütun 1'deki sekiz pozisyonun yanı sıra kuyu türünü Standartolarak ayarlayın.
        2. NTColarak A2 ve B2 kuyuları için kuyu türünü ayarlayın.
        3. C2 ve D2 (pozitif denetimler) için kuyu türünü Bilinmiyorolarak ayarlayın.
        4. Diğer tüm konumlar için kuyu türünü Bilinmiyor olarak ayarlayın.
        5. Tüm 96 pozisyonları seçin ve Boyalar FAM ve HEXekleyin. Plakayı Eşitle'yitıklatın.
      2. Termal profili Tablo 2'yegöre ayarlayın.
    2. Tüpün altına içeriğini getirmek için 10 s için şeritler gerekli sayıda santrifüj.
    3. İçeriği korumaya dikkat ederken contaları şeritlerden yavaşça çıkarın ve ilgili şeritlere ekleyin: negatif kontrol: 20°L su; örnek: 20 μL DNA; standart eğri: Standart 1, 2, 3 veya 4'ün 20°L'si; pozitif kontrol: 20 μL pozitif kontrol.
    4. 8 şeritli düz optik kapakları ve girdapları kullanarak tüm şeritleri birkaç saniye boyunca dikkatlice kapatın.
    5. 10 s için şeritler santrifüj ve alet içine yükleyin. O zaman koşmaya başla.

4. Veri analizi

NOT: Veri analizi yazılıma bağlı olarak otomatik olarak veya el ile gerçekleştirilebilir (Bkz. Malzeme Tablosu).

  1. Koşunun sonunda, "FAM: FL-DNA-A" ve "HEX: IC"için A, C, E, G sütunlarını ve "FAM: FL-DNA-B" ve "HEX: IC"sütunlarını seçin.
  2. Standart Miktar Başlangıç Tutarıiçin aşağıdakileri ayarlayın: A1 ve B1 kuyuları için 10 ng/reaksiyon, C1 ve D1 için 2 ng/reaksiyon, E1 ve F1 için 0,4 ng/reaksiyon ve G1 ve H1 için 0,08 ng/reaksiyon.
  3. Eşik Floresan değerlerini hem FAM (FL-DNA A ve FL-DNA B) hem de HEX (IC) kanalları için 150'ye ayarlayın.
  4. Kutuda Sonuç Tablosu, Sütun Seçenekleri' ni tıklatın | Tümünü Seçin | Tamam kendi Cq (』R) ve 』R son değerleri ile her iki kanalda sonuçları elde etmek için.
    NOT: Bu değerler Gerçek Zamanlı PCR enstrüman yazılımı tarafından sağlanmaktadır. ΔR son floresan değeri son amplifikasyon döngüsüne normale karşılık gelir.
  5. Sonuç Tablosu kutusunda, bağlam menüsünü açmak için tabloya sağ tıklayın ve ham verileri dışa aktarmak için Excel'e Gönder'i tıklatın.
  6. Standart eğrinin uygunluğunu doğrulamak için standartların değerlerini kontrol edin.
  7. Her FL-DNA karışımı için R2 ["R² (』R)" sütununa ve verimliliği ["Verimlilik (%)" sütun] değerleri. Kabul edilebilir bir aralıkta iseler, analize üreticinin talimatlarına göre devam etmek mümkündür (Tablo 3).
  8. FAM kanalının sonuçları beklenen aralıkta değilse, standart eğrinin bir noktasını atla ve çalıştırmayı yeniden analiz edin.
  9. "Cq yok" değerlerini sıfır olarak göz önünde bulundurarak negatif ve pozitif denetimlerin değerlerini aşağıdaki formülle belirleyin:
    figure-protocol-6357
    figure-protocol-6426
  10. Elde edilen değerleri Tablo 4'tebildirilenlerle karşılaştırın.
  11. Reaksiyon kontrolleri beklenen değerler aralığındaysa, örneklerin analizine devam edin.
    NOT: Elde edilen Cq değerlerinin bir artifadan (doğrusal floresan eğrisi) değil, gerçek bir amplifikasyon reaksiyonundan (sigmoidal floresan eğrisi) üretildiğini doğrulayın.
  12. Her FL-DNA karışımı için numunenin uygunluğunu analiz etmek için HEX kanalının Cq değerlerini karşılaştırın. Değer ≥16 ise, numunelerin analizine devam edin. Değer <16 ise veya Cq yoksa, büyük olasılıkla FL-DNA Spike'ın dağıtım hatasına bağlıdır. Bu nedenle, örnekleri analiz etmek mümkün değildir.
  13. Pozitif kontrolün "HEX" kanalındaki Cq değerlerinin ortalamasını aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayabilirsiniz:
    figure-protocol-7295
  14. Aşağıdaki formülü kullanarak örnek "HEX" kanalındaki Cq değerlerinin ortalamasını hesaplayabilirsiniz:
    figure-protocol-7478
  15. CqHEX değerlerini aşağıdaki formüle göre hesaplayın:
    figure-protocol-7611
  16. Örneklerin CqHEX değerlerini Tablo 5'tebildirilenlerle karşılaştırın.
  17. Her karışım için (Mix A ve Mix B), FAM kanalının Cq değerlerini Tablo 6'da bildirilenlerle karşılaştırın.
  18. Her uygun numunenin FL-DNA değerini belirlemek için aşağıdaki formülü kullanarak "Cq yok" değerlerini sıfır olarak göz önünde bulundurun:
    figure-protocol-8060
    figure-protocol-8129
    NOT: Rengucci ve ark.12 tarafından elde edilen Fagan nomogram sonuçlarına göre iFOBT ve FL-DNA değerlendirmelerinin bir fonksiyonudur (Tablo 7).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokolün iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. İş akışı, bu adım sonuçlarına göre iki denetim adımı ve farklı eylemler sağlar. İlk olarak, bir örnek uygun olmayan denetimler sunuyorsa, amplifikasyon tekrarlanmalıdır. İkinci olarak, amplifikasyon inhibe edilirse, örnek baştan yeniden işlenmeli veya değerli değil olarak sınıflandırılmalıdır.

Şekil 2 pozitif ve negatif örneklerle üretilen floresan eğrilerini göstermekte...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Önceki çalışmalar, manuel ve yarı otomatik yaklaşımlar la elde edilen dışkıDNA bütünlüğü analizi kolorektallezyonlarınerken teşhisi için alternatif bir araç temsil edebilir göstermiştir7 ,8,9,10,11,12. Kolorektal kanserin saptanması için yıllar içinde moleküler, noninvaziv tarama testleri geliştiril...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Maura Menghi, Diatech Pharmacogenetics srl şirketinin tam zamanlı çalışanıdır.

Teşekkürler

Yazarların hiçbir takdiri yok.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL and 2 mL polypropylene twist-lock tubes (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitor-free)Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Absolute Ethanol (quality of analytical degree)Reagent required for DNA extraction
Benchtop centrifuge Maximum speed of 20000 x g. Instrument required for DNA extraction
EasyPGX analysis software version 2.0.0Diatech PharmacogeneticsRT800-SWAnalysis software 
EasyPGX centrifuge/vortex 8-well stripsDiatech PharmacogeneticsRT803Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX qPCR instrument 96 Diatech PharmacogeneticsRT800-96Instrument recommended for the Real Time PCR assay
EasyPGX ready FL-DNADiatech PharmacogeneticsRT029Kit required for the Real Time PCR assay
Micropipettes (volumes from 1 to 1.000 µL)Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Powder-free disposable glovesConsumables required for DNA extraction and Real Time PCR
QIAamp Fast DNA StoolQiagen51604Kit recommended for the DNA extraction and purification from stool
Sterile filter tips DNase-, RNase-free (volumes from 1 to 1.000 µL)Consumables required for DNA extraction and Real Time PCR
Thermal block e.g. EasyPGX dry blockDiatech PharmacogeneticsRT801Instrument required for DNA extraction
Vortex e.g. EasyPGX centrifuge/vortex 1.5 ml Diatech PharmacogeneticsRT802Instrument required for DNA extraction

Referanslar

  1. Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
  2. Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
  3. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2019).
  4. Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
  5. Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
  6. Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
  7. Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
  8. Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
  9. Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
  10. Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
  11. De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
  12. Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.

The first affiliation was updated from:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)

to:

Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmaSay 160d k DNA b t nlkolorektal kanser lezyonlary ksek riskli kolorektal adenomlartan sal kolorektal kanser y ntemiqPCRFL DNAiFOBT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır