JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Klinik olarak, menopozal kadınlarda östrojen eksikliği lipid bozulması ve ateroskleroz insidansını ağırlaştırabilir. ApoE-/- farelerde çift dorsal-lateral kesi ile bilateral ovariektomi ile in vivo östrojen eksikliği modeli oluşturduk. Fare modeli menopoz sonrası kardiyovasküler disfonksiyon eksojen östrojen tedavileri tarama için geçerlidir.

Özet

Postmenopozal kadınlar premenopozal kadınlara göre kardiyovasküler hastalıklara yakalanma riski daha fazladır. Kadın fareler ovariectomized (OVX) weaning ekranda bozulmamış yumurtalık fonksiyonu ile kadın fareler ile karşılaştırıldığında aort aterosklerotik lezyonlar arttı. Ancak, ateroskleroz eğilimli durumu ile östrojen eksikliği fareler içeren laboratuvar modelleri eksiktir. Menopozal kadınlarda klinik östrojen eksikliği önceden var olan veya devam eden lipid bozulması ve ateroskleroz insidansını ağırlaştırabilir, çünkü bu açık çok önemlidir. Bu çalışmada apolipoprotein E (apoE)-/- farelerde çift dorsal-lateral kesi ile bilateral ovariektomi ile in vivo östrojen eksikliği olan bir fare modeli oluşturuldu. Daha sonra 17β-estradiol ve psödoprotodiosin (PPD) (bir fitoöstrojen) peroral fındık yayılması yoluyla uygulanan etkilerini karşılaştırın. PPD'nin OVX apoE-/- farelerde nihai vücut ağırlığını ve plazma TG'yi azaltmada bir miktar etki yemesine rağmen, 17β-estradiol muadili ile karşılaştırılabilir anti-aterosklerotik ve kardiyak koruyucu kapasitelere sahip olduğunu görüyoruz. PPD anti-tümör özellikleri uygulamak için bildirilmiştir bir fitoöstrojen olduğunu. Bu nedenle, önerilen yöntem postmenopozal kadınlarda geleneksel hormon replasman tedavisi yerine peroral uygulama yoluyla fitoöstrojentarama için geçerlidir, potansiyel olarak zararlı tümörigenetik olduğu bildirilmiştir Kapasite. Fındık yayılımı yoluyla peroral uygulama noninvaziv, yaygın birçok hasta için geçerli hale. Bu makalede, apoE-/- farelerde çift dorsal-lateral kesi ve fındık yayılımı yoluyla peroral 17β-estradiol veya fitoöstrojen hormon replasmanı yoluyla ikili ovariektominin adım adım gösterilişi yer almaktadır. Ekokardiyografi ile plazma lipid ve kardiyovasküler fonksiyon analizleri takip eder.

Giriş

Epidemiyolojik ve klinik çalışmalar postmenopozal kadınların premenopozal kadınlara göre kardiyovasküler hastalık riski çok daha fazla olduğunu göstermiştir1,2. Hormon replasman tedavisi (HRT) kardiyovasküler hastalık göreceli riskini azaltabilir 0.37-0.793. Diğer komplikasyonlar ın yanı sıra, kardiyovasküler hastalıkların neden olduğu ateroskleroz dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir4. Ancak, ateroskleroz eğilimli durum sunan östrojen eksikliği fareler içeren laboratuvar modelleri eksiktir. Bu protokol menopoz sonrası kardiyovasküler disfonksiyon eksojen östrojen tedavileri tarama için bir in vivo östrojen eksikliği fare modeli sağlar.

Önceki çalışmalar da yüksek kolesterol diyet beslenen aterosklerotik kemirgenler OVX uygulaması aterosklerozmuzdarippostmenopozal kadınlar taklit edebilirsiniz göstermektedir5 ,6,7,8. Menopozal kadınlarda aterosklerotik durumu andıran tekrarlanabilir ve uygun bir hayvan modeli eksojen östrojen araştırmalarının temelidir. Burada ateroskleroz-prone apolipoprotein E nakavt (apoE-/-)farelerdebilateral ovariektominin çift dorsal-lateral kesisi uygulanmıştır. Orta karın veya dorsal insizyon ile karşılaştırıldığında, çift dorsal-lateral insizyon şiddetli karın boşluğu adezyon ve inflamasyon önleyebilirsiniz daha kolay, daha az zaman alıcı bir yöntemdir. Fındık yayılımı yoluyla peroral uygulama (Bkz. MalzemeTablosu) noninvaziv ve kullanışlıdır, uzun vadeli bir yönetim modu 11 olarak yaygın olarak uygulanabilir hale. Yavaş salınımlı pelet implantasyonu da popüler6. Ancak implantlar özellikle OVX'e maruz kalan farelerde enfeksiyon insidansını ağırlaştırabilir. Oral gavaj ve su idaresi gibi diğer noninvaziv yönetim modları da birçok dezavantajları vardır. Oral gavage genellikle fareleri strese sosif ve özofagus yaralanmasına neden olabilir. İçme suyu ile hormon verilmesi son derece yararlıdır; ancak, ekseksen östrojenler suda çözünmez olduğu gibi bir emülgatör olarak DMSO eklenmesi kaçınılmazdır. Burada, uzun süreli uygulama için fındık yayılmış yoluyla peroral 17β-estradiol veya fitoöstrojen hormon replasmanı seçti.

Son zamanlarda, postmenopozal kadınların kardiyovasküler sistem üzerinde HRT yararlı etkisi kadın sağlığı girişimi (WHI) çalışmalarda itiraz edilmiştir12. Bir yandan, eksojen östrojen tek başına kardiyovasküler sistem üzerinde yararlı bir etki uygular; Öte yandan, bu kardiyovasküler olayların riskini artırmak için metohidroksiprogesteron asetat ile birleştirebilir. Daha ciddi, HRT meme ve rahim tümörü ilerlemesine yol açabilir, ve bu etki belirgin kullanımı sınırlı olmuştur13,14. Daha fazla ilgi tümör hücrelerinde mitotik aktivite olmayan eksojen östrojenlerin kardiyovasküler-koruyucu etkileri üzerinde duruldu15,16,17. Insanlar ve hayvanlarda birden fazla çalışma, östrojenbenzer yapıları ile fitoöstrojenler kardiyovasküler koruma yararlı bir rol oynayabilir düşündürmektedir15,18.

Bu nedenle, bu çalışmanın amacı (i) apoE-/- farelerde çift dorsal-lateral kesi ile bilateral ovariektomi ile in vivo östrojen eksikliği fare modeli oluşturmak ve (ii) peroral kardiyovasküler koruyucu etkilerini karşılaştırmak için fındık yayılımı yoluyla 17β-estradiol ve psödoprotodiosin (PPD) uygulanır. 17β-estradiol kadın cinsel hormonlar6,11,19ait eksojen östrojen bir türüdür. PPD, Dioscorea bitkilerden bir steroid saponin ve fitoöstrojen, daha önce anti-tümör özellikleri uygulamak bildirilmiştir20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan bakımı ve deneysel protokoller Çin Tıp Bilimleri Akademisi ve Pekin Birliği Tıp Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (İzin No.: SYXK (Pekin) 2013-0023). ApoE-/- farelerin kökeni C57BL/6J9,10'dur.

1. ApoE-/- Farelerde Çift Dorsal-lateral Kesi ile Bilateral Ovariektomi

  1. Evlendirmede (28 gün), avertin (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitoneally) ile dişi apoE-/- C57BL/6J fareler anestezik.
    NOT: 32 apoE-/- fare rastgele 4 gruba ayrıldı: SHAM, OVX, OVX/E2 ve OVX/PPD grubu (grup başına n = 8).
  2. Bir ısıtma yastığı üzerinde eğilimli pozisyonda hayvan yerleştirin. Anestezi sırasında göz koruması için göz yağlayıcı uygulayın.
  3. Vücut ısısını 36 ± 0,5 °C'de koruyun. Analjezik karprofenin 5 mg/kg vücut ağırlığını farenin boynunun lateral yönüne subkutan olarak uygulayın.
  4. Iliak tepeden 3 x 5 cm2 fare alanını sefalik olarak tıraş edin. 3 x 5 cm2 diyafram cerrahi levha ile hayvan kaplama önce, iyot ve daha sonra% 70 etanol ile iyice tıraş alanı temizleyin. Deney sırasında steril aletler ve eldivenler kullanın.
  5. Orta hatta 1 cm lateral ve costal kaburga 1 cm lateral yapmak için makas ve forceps kullanın.
  6. Deri altı dokuyu forceps kullanarak kesip inceleyin.
  7. Karın boşluğundaki beyaz yağ dokusunu tanımlamak için diseksiyon gözlüklerini (Bkz. MalzemeTablosu) kullanın.
  8. Karın boşluğuna ulaşılıncaya kadar fasya dan 0.5-1 cm'lik bir kesi yapmak için mikrosksorve mikrokoseps kullanın.
    NOT: Sahte işletilen grup için, yaraları doğrudan kapatın. Tekfilament sütür kullanarak kas tabakasını ve deriyi ayrı ayrı dikin.
  9. Karın boşluğundaki beyaz yağ dokusu görülebildiği zaman, mikroforceps kullanarak yağ dokusu kapmak ve yavaşça dışarı çekin. Karın boşluğunda yağ dokusu ile sarılmış pembe dut şeklinde bir yumurtalık görülebilir.
  10. 0,5-1 cm proksimal damar ılıman ve rahim boynuzu bir monofilament dikiş kullanarak. Mikroskalatör kullanarak yumurtalık çıkarın ve karın boşluğuna geri kalan doku yerleştirin.
    NOT: OVX operasyonunun başlıca yan semptomları, OVX ile çalışan farelerde yüksek mortaliteye yol açan üreteral ligasyondur. Bu bir diseksiyon gözlüğü kullanarak dokuların belirlenmesi ile önlenebilir.
  11. Yaraları kapatın. Tekfilament sütür kullanarak kas tabakasını ve deriyi ayrı ayrı dikin.
  12. Başka bir kesi yapmak için makas ve forceps kullanın 1 orta hatta lateral cm ve diğer tarafta costal kaburga 1 cm lateral. Yukarıdaki yordamı tekrarlayın (1,5 ila 1,11).
  13. Hayvan anesteziden uyansın. Ayrı ayrı ameliyattan sonraki ilk gün fare tutun.
  14. Kurtarma aşamasında kafesi sık sık temizleyin veya değiştirin.
  15. Ameliyattan yaklaşık 24 saat sonra, analjezik karprofenin vücut ağırlığını 5 mg/kg vücut ağırlığına subkutan olarak uygulayın.

2. Fındık Yayılımı ile 17β-estradiol veya PPD Peroral İdaresi

  1. Susam yağı içinde 17β-estradiol veya PPD'yi iyice eritin ve susam yağını fındık serpmesiyle karıştırın (Bkz. MalzemelerTablosu). Her 30 g fare için günlük bir porsiyon 17β-estradiol veya PPD 15 μg 3 μg, 4 l susam yağı ve fındık yayılmış 60 mg içerir. Her 30 g fare için bir plasebo hazırlamak 4 susam yağı ve fındık yayılmış 60 mg içerir.
    NOT: 17β-estradiol veya PPD'nin günlük yönetim kısmıönceki çalışmalar6,11 ve ön deneylere dayanıyordu.
  2. OVX sonra bir hafta, 12 hafta boyunca yüksek kolesterol diyet (%1.25 kolesterol, 0% cholate) ile fareler beslemek. Bu çalışmada kullanıldığı gibi tipik bir deneysel tedavi şeması Şekil1'de gösterilmiştir.
  3. 4. haftada yayılan fındığın peroral uygulamasından 5 gün önce, fareleri yaklaşık 30 mg fındık içeren plaseboyu 5 gün boyunca 2-5 fareye yaymaları için eğitin. İlk 3 gün boyunca fareleri ev kafeslerinde gruplar halinde eğitin. Eğitim dördüncü ve beşinci gün ayrı kafeslerde fareler yerleştirin ve deneysel durum benzemek için günlük kısmı hizmet vermektedir.
  4. Son 9 hafta boyunca fareleri ayrı kafeslere yerleştirin ve her beslenme vesilesi için günlük fındık yayılımı porsiyonu servis edin.
    NOT: Ovx/E2 ve OVX/PPD grubunda fındık serpme yoluyla sırasıyla 17β-estradiol (0.1 mg·kg-1) veya PPD (0.5 mg·kg-1)içeren günlük porsiyon hizmet; SHAM ve OVX grubunda hormonsuz fındık serpme içeren günlük bir porsiyon hizmet vermektedir.

3. Mikroultrason Sistemi Kullanarak İntima-Media Kalınlığı ve Kardiyak Disfonksiyonun Belirlenmesi

  1. Ultrasonografik biyomikroskopi
    1. Fesihbir gün önce, intima-media kalınlığı ve kardiyak disfonksiyon bir mikroultrason sistemi kullanarak incelemek (Malzemeler Tablosubakınız) daha önce açıklandığı gibi21.
    2. Muayeneden önce, her fareye anestezi (grup başına n = 8 fare) olarak 200 mg/kg intraperitoneal avertin (tribromoetanol) enjeksiyonu verin.
    3. Her farenin boyun kıllarını dikkatlice tıraş edin. En iyi görüntü kalitesini sağlamak için sıcak ultrason iletim jelini serbestçe uygulayın.
    4. 12,7 mm odakve 40 μm çözünürlükte 30 MHz'lik tbmköz kafa ile aort kökünün ve yükselen aortun temel ultrasonografik görüntülerini elde edin.
    5. İzleme için kurşun II konfigürasyonu ile elektrokardiyografi kullanın.
    6. Systole bir düzlemde yükselen aort, aort kemerve brakiyosefalik arter dalı sağ parasternal uzun eksenli görüntüleri yakalayın (Şekil3).
  2. İntima-media ve maksimal plak kalınlığı ölçümleri
    1. Net görüntüler elde etmek için transdüser ve arteriyel bölge arasındaki mesafeyi kolayca ayarlayın.
    2. Görüntü analiz sisteminde çevrimdışı inceleme için 10'lar cine döngüyü dijital olarak saklayın.
    3. Daha fazla ölçüm için el ile en uygun dondurma çerçevesi ultrasonografik görüntü seçin. Yükselen aort küçük eğrilik görüntüleri kontrol edin. Artan aortta plak görülebiliyorsa, maksimal plak kalınlığını ölçün. Artan aorttaki plak görülemiyorsa, maksimal IMT'yi ölçün.
    4. IMT'yi ölçün (vasküler luminal-intimal arabirimi ile medial-adventif arabirim arasındaki mesafe). Maksimum plak kalınlığını ölçün (vasküler lümen ve adventif tabaka sınırı arasındaki en kalın mesafe).
    5. Üç lezyon sitesinden ortalama veri (Şekil3).
  3. Ekokardiyografi ile kardiyak disfonksiyon tayini
    NOT:     Daha önce açıklandığı gibi, bir mikroultrason sistemi kullanarak ekokardiyografi yoluyla kardiyak fonksiyon inceleyin22.
    1. Kalp doğru bir ultrason ışını doğrudan, papiller kasların yakın.
    2. İki boyutlu elektrokardiyogram tabanlı kilohertz görselleştirme elde edin.
    3. Sol ventrikülün in vivo transtorasik ekokardiyografisini 30 MHz'lik bir tazyik kafası kullanarak gerçekleştirin.
    4. M-mod izlemelerinden kardiyak fonksiyonla ilişkili parametreleri dijital olarak ölçün.
    5. Üç ila beş kardiyak döngüdenortalama veri (Tablo 1).
  4. İç ve intergözlemci değişkenliği
    1. Gözlemci değişkenliğinin doğrulanması için, verileri iki farklı durumda bir operatör tarafından analiz edin.
    2. Gözlemciler arası değişkenliğin değerlendirilmesi için, verileri farklı bir işleç tarafından analiz edin.

4. Haftalık Vücut Ağırlığı Ölçümü ve Plazma Toplam Kolesterol (TC) ve Trigliserid (TG) Tayini

  1. Haftalık vücut ağırlığı ölçümü
    1. Hafta -1'den 12 haftaya kadar haftada bir vücut ağırlıklarını ölçün.
      NOT: grup başına n = 8 fare.
  2. Plazma hazırlığı
    1. İntrakardiyak delinme yoluyla kan örnekleri toplamadan önce şırınga ve tüpler hazırlayın. EDTA'yı antikoagülan olarak kullanın. Her 2 mL şırıngaya 10 μL 0,5 M EDTA ekleyin ve her 1,5 mL tüpe 0,5 M EDTA 8 l ekleyin.
    2. 12. haftada, bir gecede hızlı bir şekilde fareleri avertin (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitoneally) ile anestezik.
      NOT: grup başına n = 3 fare.
    3. % 70 etanol ile ventral göğüs bölgesihazırlayın.
    4. Göğüs boşluğu açmak ve atan kalp maruz kalana kadar kaburga kesmek için makas ve forceps kullanın.
    5. 25 G iğneyi sağ ventriküle takın. Kan şırınganın içine akmaya başlayana kadar yavaşça aspire edin.
      NOT: Steril durumda 25 G iğneile tek kullanımlık şırıngalar kullanıyoruz (Bkz. MalzemeTablosu).
    6. Sabit, eşit basınçla aspire etmeye devam edin. Kan görülmezse, iğneyi yeniden konumlandırın ve aspirasyonu tekrarlayın.
    7. Gerekli kan hacmitoplamadan önce fareler derinden anestezi tutun. Normalde 1 mL'ye kadar kan toplanabilir. Bu derin anestezik durum altında servikal çıkığı ile fareler ötenazi.
    8. Pipet kan örnekleri 1,5 mL tüpler içine ve iyice kan içine EDTA karıştırma sağlamak için kan ters. O zaman kan örneklerini hemen buza yerleştirin.
    9. 30 dk içinde 4 °C'de 400 x g'de 20 dk santrifüj numuneleri.
    10. Supernatant dikkatle toplayın. Aliquot ve depolamak plazma örnekleri -80 °C.
  3. TC veya TG içerik ölçümü için standart eğriler oluşturma
    1. TC standart eğrisi için, kolesterol standartlarının çeşitli konsantrasyonlarını hazırlayın: 0 mmol/L, 0.52 mmol/L, 1.03 mmol/L, 2.07 mmol/L, 4.14 mmol/L, 6.20 mmol/L, 8.27 mmol/L ve 10.34 mmol/L. Ölçü O.D. her kolesterol standardı için. Her kolesterol standardı için ortalama o.D. ayarlayın. Dikey (Y) eksen değeri olarak, konsantrasyonu yatay (X) eksen değeri olarak ayarlayın. İstatistiksel bir yazılım kullanarak standart bir eğri oluşturun.
    2. TG standart eğrisi için, tg standartlarının çeşitli konsantrasyonlarını hazırlayın: 0 mmol/L, 0,45 mmol/L, 0,90 mmol/L, 1,81 mmol/L, 3,62 mmol/L, 5,42 mmol/L, 7,23 mmol/L ve 9,04 mmol/L. Ölçü O.D. her TG standardı için. Her TG standardı için ortalama o.D.'yi dikey (Y) eksen değeri olarak ayarlayın; konsantrasyonu yatay (X) eksen değeri olarak ayarlayın. İstatistiksel bir yazılım kullanarak standart bir eğri oluşturun.
      NOT: Bu çalışmada standart eğri yapımı için dört parametreli Lojistik eğri montajı (4-pl) kullanılmıştır. Plazma örneklerini ölçmeden önce standart eğriyi kontrol edin ve r 2'nin 0,995'ten büyük olduğundan emin olun.
  4. TC içerik ölçümü
    1. TC sayma kitinden renk reaktifi şişesini (25 mL) "TC Çalışma Çözümü" olarak etiketlendirin.
    2. Soğumuş numuneleri kısa bir süre girdap. Seyreltmeleri hazırlayın: 80 μL distile suda 20 μL plazma. Kısaca girdap seyreltmeleri.
    3. 96 kuyulu bir plakanın uygun kuyularına 2,5 l kolesterol standardı (5,17 mmol/L) veya seyreltilmiş plazma veya 2,5 μL distile su (boş) ekleyin. Triplikasyon önerilir.
    4. Tüm kuyulara, renk reaktifinin 250°L'sini ekleyin.
    5. 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
    6. Mikroplaka okuyucuyu açın ve 10 dk ısınmaya izin verin.
    7. Plakayı(lar) kuvözden çıkarın ve 510 nm'de mikroplaka okuyucuyu okuyun. Mikrotiter kuyularında veya plakanın alt kısmında sırasıyla kabarcık veya toz bulunmadığından emin olun.
    8. TC konsantrasyonu aşağıdaki gibi hesaplayın:
      TC cont. = kolesterol standartları cont. × (plazma örneği O.D.-boş O.D)/(kolesterol standartları O.D.-boş O.D)
  5. TG içerik ölçümü
    1. TG tsay kitinden renk reaktifi şişesini (25 mL) "TG Çalışma Çözümü" olarak etiketleyin.
    2. Soğumuş numuneleri kısa bir süre girdap.
    3. 96 kuyulu bir plakanın uygun kuyularına 2,5 l TG (2,26 mmol/L) veya seyreltilmiş plazma veya 2,5 μL distile su (boş) ekleyin. Triplikasyon önerilir.
    4. Tüm kuyulara, renk reaktifinin 250°L'sini ekleyin.
    5. 37 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
    6. Mikroplaka okuyucuyu açın ve 10 dk ısınmaya izin verin.
    7. Plakayı(lar) kuvözden çıkarın ve 510 nm'de mikroplaka okuyucuyu okuyun.
      NOT: Mikrotiter kuyularda veya plakanın alt kısmında kabarcık veya toz bulunmadığından emin olun.
    8. TG konsantrasyonu aşağıdaki gibi hesaplayın:
      TG cont. = TG standartları, × (plazma numunesi O.D.-boş O.D)/(TG standartları O.D.-boş O.D)

5. En Atortik Aterosklerotik Lezyonların Yüz Analizi

  1. Aort izolasyonu ve eksizyonu
    1. 12. haftada, bir gecede hızlı bir şekilde fareleri avertin (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitoneally) ile anestezik. Bu derin anestezik durum altında servikal çıkığı ile fareler ötenazi.
      NOT: Grup başına 3 fare kullandık.
    2. % 70 etanol ile ventral göğüs bölgesihazırlayın. Göğüs boşluğu açmak ve atan kalp maruz kalana kadar kaburga kesmek için makas ve forceps kullanın.
    3. 50 mL'lik bir şırıngayı pH 7.4'te fosfat tamponlu tuzlu ile doldurun (bkz. MalzemelerTablosu). Sol ventriküliçine 25 G iğne yerleştirin ve perfüzyondan yüksek basınç tan kaçınmak için sağ atriyumu kesin.
    4. Yerinde perfüzyonu 0.05-0.08 mL/dk.
    5. Makas ve forceps ile torasik kavite kaburga ve akciğerleri çıkarın. Sonra, karın boşluğu açın ve aort daha iyi bir görünüm için içinde organları çıkarın.
    6. Mikroforceps ile kalp tutarak ve iliak bifurkasyon kadar mikroscisssors ile omurga dorsally aortu ayırarak aort çıkarın.
      NOT: Böbrek atriyal dalları yakınında diseksiyon yaparken, aort hasarı önlemek için mikroskalaz kullanarak derinden kesilmiş.
    7. Kalp ve aortu %4 paraformaldehitte 48 saat eve sabitle. Aortu tuzlu sularda oda sıcaklığında veya 2-8 °C'de birkaç saat saklayın.
      NOT: Bu işlem temizliği kolaylaştıracaktır.
  2. Aort hazırlanması
    1. Kalbi çıkar. Stereomikroskop altında mikrokops ve mikrosisepsörler kullanarak aortlardan adventif dokuları dikkatlice çıkarın. Temizlik sırasında doku nemli tutmak için tuzlu kullanın.
      NOT: Gözyaşı veya aort nick ve bazı önemli dalları dikkatli olun, innominate arter gibi, ortak karotis arter sol, ve sol subklavian arter.
    2. Innominate 1 mm bırakın ve ortak karotis arterler sol ve tüm sol subklavian arter kesti.
    3. Kesin innominate arter yoluyla dış eğrilik açık, sonra sol ortak karotis arter, ve sonra sol subklavian arter.
    4. Karın kısmının altına yükselen kısmın iç eğriliği boyunca açık kesin.
    5. Siyah plastik bir levha üzerine aort düz pin ve kurumasını aort tutmak için tuzlu uygulayın.
  3. Aort intimal bölgenin görüntüsü
    1. Stereo mikroskopile yüz aortlarının fotoğraflarını çekin. Ölçümleri kalibre etmek için görüntülere bir milimetre ölçekli cetvel ekleyin.
    2. Kemer ve torasik bölgeleri aynı görüntüye, karın bölgesini ise başka bir görüntüye dahil edin. Görüntüleri JPEG veya TIFF olarak kaydedin.
      NOT: Kemer bölgesi miyokardin kesiştiği yerden sol subklavian arterden 3 mm distal, torasik bölge sol subklavian arterden son interkostal artere 3 mm distal ve abdominal bölge iliyak'a giden son interkostal arterdir. Çatallanma.
  4. Aterosklerotik lezyon-en yüz yönteminin nicelleştirilmesi
    1. Kalibrasyon
      1. Görüntüyü görüntü analiz yazılımıyla açın (Bkz. MalzemeTablosu), Mekansal Kalibrasyon'a gidin ve talimatları izleyin.
      2. Cetveli çizgiüzerinde konumlandırarak referans birimlerini mm olarak değiştirin.
    2. Ölçüm
      1. Her görüntü için doğru kalibrasyon ayarlayın.
      2. Cetvelüzerinde 3 mm ölçün.
      3. Kemer ve torasik bölge ölçümü: Miyokardkavşağından sol subklavian arterden 3 mm distal ve sol subklavian arterden sol subklavian artere 3 mm distal torasik bölgeye kadar kemer bölgesini son interkostal artere kadar anahat. Kemer ve torasik bölgede lezyonların izini sürmek ve mikroskoptan aorta bakmak.
      4. Abdominal bölge ölçümü: Torasik bölgenin sonundan iliak bifurkasyona kadar karın bölgesini anahat. Abdominal bölgede lezyonların izini sürmek ve mikroskopla aorta bakın.
      5. Aort iç yüzeyine göre lezyon alanını hesaplayın.
      6. Çalışma gruplarını kör eden ikinci bir gözlemci aracılığıyla niceliği doğrulayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu çalışmada kullanıldığı gibi tipik bir deneysel tedavi şeması Şekil1'de gösterilmiştir. Evlendirme de (28 gün), dişi apoE-/- C57BL/6J fareler ile anestezi edildi (tribromoetanol; 200 mg/kg; intraperitoneally). Fareler 1 cm'lik dorsal kesi ile iki taraflı OVX veya sham ile işletildi. Bir hafta bilateral OVX sonra, fareler 12 hafta boyunca yüksek kolesterol diyet (%1.25 kolesterol, 0% cholate) beslendi. 17β-Estradiol (0.1 mg·kg

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan metodoloji, menopozlu kadınlarda görülen lipid bozulması ve ateroskleroza benzeyen bir fare modelidir. Postmenopozal kadınlarda östrojen eksikliğinin, giderek karmaşık ve yaygın aterosklertik lezyonlarla önceden var olan veya devam eden hiperkolesterolemi insidansını kötüleştirebileceği iyi belgelenmiştir1. Klinikte ateroskleroza yatkın lık durumunu taklit etmek için, apoE eksikliği olan fareler, atherogenez 23,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81202526 J.X.), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81302769 - B.S.), Pekin Belediye Doğa Bilimleri Vakfı (47144226- B.S.), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (20110490325 j.x.), ve Doktora Programları Vakfı Çin Eğitim Bakanlığı (2012110612031 için B.S.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
17β-estradiol, >98%Sigma-AldrichE8875-250MGEstrogen
Disposable syringes (with 25 G needles)Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd0.5*19TWLBCardiac bleeding
High-cholesterol mouse dietHuafukang Bio-TechnologyN/A1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging SystemVisualSonicsVevo®770Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanolSigma-Aldrich152463-250MLPreparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mmKanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mmShanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LtdR413Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella)FerreroN/AMedium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifierDohegan Optical Company Inc.N/AAssistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4SIGMAP3813Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate ReaderTecanInfinite M1000Plasma TC and TG determination
PseudoprotodioscinShanghai Winherb Medical S & T DevelopmentW-0427CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mLPfizer Pharma GmbH462986Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oilSigma-AldrichS3547-1LDissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-GelMenarini, Solco Basle Ltd.Eye protection during anesthesia
Stereo microscopeMCALONMCL-6STVImage of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifugeSIGMA1-14KPreparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm)Kanghua Medical Equipment Co., LtdSurgical tools
TribromoethanolSigma-AldrichT48402-5GPreparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kitInstitute of Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA110-1Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kitInstitute of Nanjing Jiancheng Biology EngineeringA111-1Plasma TC determination

Referanslar

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  2. Packard, B. L. Cardiovascular health and disease in women. The New England Journal of Medicine. 329 (4), 247-256 (1993).
  3. Samaan, S. A., Crawford, M. H. Estrogen and cardiovascular function after menopause. Journal of the American College of Cardiology. 26 (6), 1403-1410 (1995).
  4. Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420 (6917), 868-874 (2002).
  5. Tremollieres, F. A., et al. Effect of hormone replacement therapy on age-related increase in carotid artery intima-media thickness in postmenopausal women. Atherosclerosis. 153 (1), 81-88 (2000).
  6. Bourassa, P. A., Milos, P. M., Gaynor, B. J., Breslow, J. L., Aiello, R. J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (3), 10022-10027 (1996).
  7. Squadrito, F., et al. Genistein supplementation and estrogen replacement therapy improve endothelial dysfunction induced by ovariectomy in rats. Cardiovascular Research. 45 (2), 454-462 (2000).
  8. Wang, D., et al. Endothelial dysfunction and enhanced contractility in microvessels from ovariectomized rats: roles of oxidative stress and perivascular adipose tissue. Hypertension. 63 (5), 1063-1069 (2014).
  9. Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. Spontaneous Hypercholesterolemia and Arterial Lesions in Mice Lacking Apolipoprotein E. Science. 258 (5081), 468-471 (1992).
  10. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-Deficient Mice Develop Lesions of All Phases of Atherosclerosis Throughout the Arterial Tree. Arteriosclerosis and Thrombosis. 14 (1), 133-140 (1994).
  11. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. Journal of Visualized Experiments. 64 (e4013), 1-4 (2012).
  12. Rossouw, J. E., et al. Risks and benefits of estrogen plus progestin in healthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial. The Journal of the American Medical Association. 288 (3), 321-333 (2002).
  13. Kumle, M. Declining breast cancer incidence and decreased HRT use. Lancet. 372 (9639), 608-610 (2008).
  14. Jager, W., et al. A randomized comparison of triptorelin and tamoxifen as treatment of progressive ovarian cancer. Anticancer Research. 15 (6B), 2639-2642 (1995).
  15. Bhathena, S. J., Velasquez, M. T. Beneficial role of dietary phytoestrogens in obesity and diabetes. The American Journal of Clinical Nutrition. 76 (6), 1191-1201 (2002).
  16. Wang, L., Qiu, X. M., Hao, Q., Li, D. J. Anti-inflammatory effects of a Chinese herbal medicine in atherosclerosis via estrogen receptor beta mediating nitric oxide production and NF-kappaB suppression in endothelial cells. Cell Death and Disease. 4 (e551), 1-13 (2013).
  17. Xiao, J., Wang, N. L., Sun, B., Cai, G. P. Estrogen receptor mediates the effects of pseudoprotodiocsin on adipogenesis in 3T3-L1 cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 299 (1), C128-C138 (2010).
  18. Guivarc'h, E., et al. Predominant Role of Nuclear Versus Membrane Estrogen Receptor alpha in Arterial Protection: Implications for Estrogen Receptor alpha Modulation in Cardiovascular Prevention/Safety. Journal of the American Heart Association. 7 (13), 1-17 (2018).
  19. Osako, M. K., et al. Estrogen inhibits vascular calcification via vascular RANKL system: common mechanism of osteoporosis and vascular calcification. Circulation Research. 107 (4), 466-475 (2010).
  20. Ivanova, A., et al. Screening of some saponins and phenolic components of Tribulus terrestris and Smilax excelsa as MDR modulators. In vivo. 23 (4), 545-550 (2009).
  21. Xiao, J., Zhu, T., Yin, Y. Z., Sun, B. Notoginsenoside R1, a unique constituent of Panax notoginseng, blinds proinflammatory monocytes to protect against cardiac hypertrophy in ApoE(-/-) mice. European Journal of Pharmacology. 833 (15), 441-450 (2018).
  22. Sun, B., Xiao, J., Sun, X. B., Wu, Y. Notoginsenoside R1 attenuates cardiac dysfunction in endotoxemic mice: an insight into oestrogen receptor activation and PI3K/Akt signalling. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1758-1770 (2013).
  23. Adams, M. R., et al. Inhibition of coronary artery atherosclerosis by 17-beta estradiol in ovariectomized monkeys. Lack of an effect of added progesterone. Arteriosclerosis. 10 (6), 1051-1057 (1990).
  24. Keaney, J. F. Jr, et al. 17 beta-estradiol preserves endothelial vasodilator function and limits low-density lipoprotein oxidation in hypercholesterolemic swine. Circulation. 89 (5), 2251-2259 (1994).
  25. Nakashima, Y., Plump, A. S., Raines, E. W., Breslow, J. L., Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 14 (1), 133-140 (1994).
  26. Saleh, T. M., Cribb, A. E., Connell, B. J. Estrogen-induced recovery of autonomic function after middle cerebral artery occlusion in male rats. American Journal of Physiology- Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 281 (5), R1531-R1539 (2001).
  27. Bingham, D., Macrae, I. M., Carswell, H. V. Detrimental effects of 17beta-oestradiol after permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (3), 414-420 (2005).
  28. Pignoli, P., Tremoli, E., Poli, A., Oreste, P., Paoletti, R. Intimal plus medial thickness of the arterial wall: a direct measurement with ultrasound imaging. Circulation. 74 (6), 1399-1406 (1986).
  29. Hodgin, J. B., Maeda, N. Minireview: estrogen and mouse models of atherosclerosis. Endocrinology. 143 (12), 4495-4501 (2002).
  30. Bush, T. L., et al. Cardiovascular mortality and noncontraceptive use of estrogen in women: results from the Lipid Research Clinics Program Follow-up Study. Circulation. 75 (6), 1102-1109 (1987).
  31. Marsh, M. M., Walker, V. R., Curtiss, L. K., Banka, C. L. Protection against atherosclerosis by estrogen is independent of plasma cholesterol levels in LDL receptor-deficient mice. Journal of Lipid Research. 40 (5), 893-900 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 150ovariektomiaterosklerozift dorsal lateral insizyonperoral uygulamaintima media kal nlekokardiyografi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır