Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme

Özet

Bu protokolün amacı, embriyo ödün vermeden gastrasyon sırasında deniz anemone nematostella vectensis genotip etmektir.

Özet

Burada açıklanan, hayvan hayatından ödün vermeden anthozoan Genus nematostella vectensis gastrula sahne embriyo genotip için PCR tabanlı bir protokoldür. İn vitro fertilizasyon ve de-jellying takipte, zygotların erken-orta gastrula aşamasına ulaşmak için oda sıcaklığında 24 saat gelişmesine izin verilir. Gastrula embriyoları daha sonra deniz suyu içeren bir petri çanak agaroz jel yatağa yerleştirilir. Diseksiyon mikroskop altında, bir tungsten iğne cerrahi olarak her embriyonun bir aboral doku parçası ayırmak için kullanılır. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra iyileşmeye ve gelişmeye devam etmesine izin verilir. Genomik DNA izole doku parçasından çıkarılır ve Locus özel PCR için bir şablon olarak kullanılır. Genotip, PCR ürünlerinin boyutuna göre veya ALLELE özel PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda tespit edilebilir. Cerrahi sonrası embriyolar daha sonra genottipe göre sıralanır. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4 – 5 h gerektirir. Bu yöntem embriyoların genetik olarak heterojen bir nüfusundan nakavt mutantları tanımlamak için kullanılabilir ve gelişim sırasında fenotiplerin analizlerini sağlar.

Giriş

Cnidarians denizanası, mercanlar ve deniz anemonlar içeren hayvanların çeşitli bir grup temsil eder. Bunlar, ekstrasellüler matris (mesoglea) ile ayrılan ektoderm ve endoderm 'den oluşan diploblastlar. Cnidaria, Drosophila ve mus gibi geleneksel hayvan modellerinin¹' e ait olduğu Bilateria için bir kardeş grubudur. Ayrıca, Cnidaria-Bilateria sapma pre-Cambrian döneminde oluştuğu düşünülmektedir². Bu nedenle, cnidarians ve bilatyalılar karşılaştırmalı çalışmalar en son ortak atalarının biyoloji içine anlayış kazanmak için önemlidir. Son zamanlarda, karşılaştırmalı genomikler, cnidarians ve bilatozların notch ve bhlh gibi birçok gelişimsel araç genlerini paylaşımının, ortak atalarının zaten bu genler olduğunu ima ettiğini açıkladı³. Ancak, Cnidaria ve Bilateria 'nın son ortak atalarında bu gelişimsel araç genlerinin rolü göreceli olarak daha az iyi anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için, cnidarians içinde bu derinden uyumlu genlerin nasıl işledik çalışması önemlidir.

Gelişen Genus genetik modellerinden biri anthozoan nematostella vectensis 'dir. Genomu³sıralanmıştır ve morpholino-aracılı gen taklası, meganuclease-aracılı Transgenesis ve Crispr-Cas9-aracılı gen tokmağı ve knockouts dahil olmak üzere çeşitli genetik araçlar, şimdi bu hayvanın kullanımı için kullanılabilir. Buna ek olarak, Nematostella gelişimi nispeten iyi anlaşılır. Embriyogenyon sırasında, gastrasyon invaginasyon tarafından oluşur⁴, ve embriyo serbest yüzme Planula larva içine gelişir. Planula daha sonra bir ağız ve circumoral dokunacles ile bir sapsız polip dönüşür. Polip sonra büyür ve cinsel olgunluğa ulaşır.

Crispr-Cas9-aracılı hedeflenen Mutagenezi artık rutin olarak nematostella vectensis⁵,^6,7,8,9' da gen fonksiyonunu incelemek için kullanılmıştır. Nematostella'da nakavt mutantlar oluşturmak için, Locus 'a özgü tek kılavuzluk Rnas ve endonükleaz Cas9 proteini içeren bir kokteyl, ilk olarak gösteren F0 kurucusu hayvanları üretmek için döllenmez veya döllenmiş yumurtalara enjekte edilir Mozaik. F0 hayvanlar daha sonra cinsel olgunluğa yükseltilmiş ve bir F1 nüfus üretmek için birbirleri ile geçti, bir alt kümesi hangi nakavt mutantlar⁶olabilir. Alternatif olarak, cinsel olgun F0 hayvanlar F1 heterozigot hayvanlar oluşturmak için vahşi tip hayvanlar ile geçilebilir ve faiz Locus içinde bir nakavt allel taşımak F1 heterozigotlar daha sonra F2 yavru üretmek için birbirleri ile kesişebilir, bir çeyrek Hangi nakavt mutantlar⁵bekleniyor. Her iki yaklaşım da genetik heterojen bir nüfusun nakavt mutantları tanımlamak için bir yöntem gerektirir. Polyp tentacles Genotipleme için genomik DNA ayıklamak için kullanılabilir^6,7. Bununla birlikte, ilgi geninin gelişimsel fonksiyonunun incelendiği ve mutant embriyoların polip aşamasına ulaşamayacağı durumlarda (yani, mutasyona bağlı larva saflığı nedeniyle), nakavt mutantların ontojende erken tespit edilmesi gerekir. Burada açıklandığı gibi, hayvan ödün vermeden gastrula aşamasında genotip bireysel hayvanlar için PCR tabanlı bir protokoldür, bu embriyo genetiği heterojen bir nüfusun nakavt mutantların tanımlanması sağlar. Tüm Genotipleme sürecinin süresi, taramalı embriyo sayısına bağlıdır, ancak minimal 4-5 h gerektirir.

Protokol

1. yumurtlama indüksiyon, in vitro fertilizasyon, ve de-jellying

1. 16 °C ' de karanlığın içinde bin başına 12 parça (PPT) tuzluluk ile deniz suyunda Nematostella vectensis koruyun, günlük Artemia besleme.
2. Yumurtlama İndüksiyon öncesi gün, bir sıcaklık ve ışık kontrollü kuluçla hayvan yerleştirin. Böylece hayvanların 25 °C ' de 8 h ışığa maruz kalabilmesi için kuluçk programını programlamak. Opsiyonel: yumurtlama geliştirmek için küçük bir parça (< 1 mm³) istiridye, bireysel hayvanlar için kuluçtar içine yerleştirmeden önce beslemek.
3. Hayvanlarını, 16 °C ' de 1 saat boyunca kuluçsa bırakın.
4. Hayvanlarını kuluçla çıkarın ve yumurtlama izin vermek için oda sıcaklığında (RT) ışık ile bir tezgah üzerinde bırakın. Yumurtlama genellikle sonraki 1,5 – 2 saat içinde gerçekleşir.
5. Erkek ve dişiler ayrı konteynerlerde ise, dişi kabından yumurta paketlerini sperm içeren bir erkek konteynırı kullanarak, uçları açılması büyütmek için kesilen bir transfer pipeti kullanılarak, yumurtaların mekanik stres sırasında zarar görmediğinden Transfer. Yumurta en az 15 dakika için erkek kap içinde bırakarak döllenmiş izin verin.
6. De-Jelly deniz suyunda yumurta paketleri 3% sistein içeren (pH 7,4) bir petri çanak veya 15 mL tüp. Yavaşça 12 dakika boyunca bir shaker üzerinde sarsıcı.
7. Kümeleri kırmak için plastik bir pipet kullanın ve tamamen de-jellied kadar başka bir 2-3 dk için karıştırmaya devam.
8. En az 5x için taze deniz suyu ile medyayı değiştirerek sistein çıkarın.
9. 16 °C veya RT bir cam Petri çanak üzerinde döllenmiş yumurta tutun.

2. bir gastrula embriyo bir aboral doku cerrahi kaldırılması

1. 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 ve 1 mg/mL proteinaz K ile oluşan bir DNA ekstraksiyon tamponu hazırlayın. embriyo başına 20 mL ekstraksiyon tamponu kullanın. İyi vortekslenir tarafından mix ve PCR tüpler içine arabellek kısım.
2. Deniz suyunda% 1 agaroz eritin ve alt kapak için bir petri çanak içine dökün. Jel yatak yapmak için bir tezgah üzerinde cool. Petri çanak jel yatak kapsayacak şekilde taze deniz suyu dökün.
3. 24 saat sonrası fertilizasyon (HPF) embriyoları (erken-orta gastrula aşaması), agaroz jel yatağı içeren Petri tabağına aktarın.
4. Bir iğne tutucu içine bir tungsten iğne takın ve alkol iğne ucu daldırma ile sterilize (70% veya daha yüksek) ve alkol yakmak için alev yerleştirerek.
5. Bir diseksiyon mikroskop altında (20X 40X büyütme), bir embriyo boyutu hakkında yüzey agaroz bir parça kaldırarak agaroz yatakta bir depresyon yapmak için tungsten iğne kullanın ve onun lateral ile depresyon üzerine embriyo yerleştirin Mikrocerrahi için embriyonun hareketini kısıtlamak amacıyla aşağı bakacak şekilde.
6. Oral blastoporal açılış karşısında bulunan aboral doku bir parçası cerrahi olarak tüketim tungsten iğne kullanın. Oral-aboral eksen boyunca embriyonik doku dörtte biri için bir aboral bir-üçte genellikle yeterlidir.
7. İzole aboral dokusu (< 2 mL) 20 mL 'Lik DNA ekstraksiyon tamponu içeren bir PCR tüpüne aktarmak için P20 pipet kullanın.
8. Ameliyat sonrası embriyo, 24 veya 96-kuyu plakasında en az 500 mL 'Lik taze deniz suyu içeren bir kuyu içine aktarın.
9. Gerektikçe embriyo sayısı için 2.4 – 2.8 arasındaki adımları yineleyin.
10. Cerrahi sonrası embriyoları içeren kuyu plakasını 16 °C veya RT 'de Genotipleme tamamlanıncaya kadar bir kuluçta yerleştirin.

3. genomik DNA ekstraksiyon ve genotipleme PCR

1. DNA ekstraksiyon tamponu ve izole embriyonik dokulara mini Santrifüjü kullanarak (örn. 2.680 x g , 10 s için), PCR tüplerini kısaca döndürün.
2. Tek embriyodan genomik DNA 'yı ayıklamak için 55 °C ' de PCR tüplerini 3 h. 30 sn. Vortex için her 30 dakikada bir hücre kümeleri dağıldığından emin olmak ve hücre liziz geliştirmek.
3. 95 °c ' de PCR tüplerini 5 dakika boyunca devre dışı proteinaz K olarak kulbin.
4. GDNA özleri 4 °C veya buzda tutun ve hemen PCR 'ye geçin.
   Not: protokol,-20 °C ' lik dondurucuda gDNA özleri yerleştirerek burada duraklatılabilir.
5. İlgi genomik Locus yükseltmek için bir şablon olarak çıkarılan gDNA kullanarak bir PCR reaksiyon ayarlayın.
   1. Eğer faiz Locus farklı allonların boyutu fark agaroz jel elektroforez tarafından tespit edilebilir böylece büyüklüğü farklıdır, tüm Locus yükseltmek için tek bir set astar tasarımı.
   2. Alternatif olarak, yalnızca belirli bir ALLELE varlığında PCR ürünleri üreten ALLELE özgü astar kullanın; Örneğin, ekleme/silme mutasyonları içeren bir bölgeye bağlanan astar tasarlayarak.
   3. Tipik bir 20 mL PCR reaksiyon karışımı aşağıdaki gibi kullanın: 5 mL gDNA özler, 8 mL çekirdeksiz su, 4 mL PCR tampon, 0,2 mL mm dNTPs, 0,6 mL DMSO, 1 mL 10 mM ileri astar, 1 mL 10 mM ters astar ve 0,2 mL DNA polimeraz (bkz. malzeme tablosu).
      Not: çoklu astar, PCR reaksiyonunda kullanılabilir. Örneğin, bir evrensel ileri astar ve iki ALLELE özel ters astarlar kombine edilebilir, sürece iki ters astar farklı boyutlarda PCR ürünleri üretmek için tasarlanmıştır, böylece varlığı/yokluğunda iki alelleri belirsizliğe sahip olabilir Jel Elektroforez tarafından belirlenir (bkz. temsili sonuçlar bölümü).
6. PCR ürünlerinin boyutunu ve varlığını/yokluğunda belirlemek için agaroz jel elektroforezi çalıştırın. PCR ürünlerinin beklenen boyutuna bağlı olarak agaroz jel elektroforezinin (örn. agaroz jel yüzdesi, V/cm ve süre) durumunu ayarlayın.
7. Her ameliyat sonrası embriyo için bir genotip atamak için PCR ürünlerinin boyutu ve varlığı/yokluğunda ilgili PCR sonuçlarını kullanın. Örneğin, farklı boyutlarda PCR ürünleri üretmek için başka bir Allen bekleniyorsanız, her embriyo için genotip atamak için boyut bilgilerini kullanın. ALLELE özel astar kullanıldığında, PCR ürünlerinin varlığı/yokluğunda veri her embriyo bir genotip atamak için kullanılmalıdır.
8. Embriyoları genottipe göre sıralayın.

Sonuçlar

Nematostella genomunun, Nörofobide glwamıde için bir preürot proteini kodlayan tek bir Locası vardır. Bu Locus 'ta üç Knockout mutant alelleri (GLW^-a, GLW^-bve GLW^-c) daha önce⁵bildirildi. Glwamide Locus (Genotype: +/GLW^-c) ile vahşi tip allel (+) ve nakavt allel GLW^-ctaşıyan dört heterozigot erkek, vahşi tip allel ve farklı nakavt taşıyan bir heteroz...

Tartışmalar

Burada tanımlanan bir PCR tabanlı protokol genotip tek bir deniz anemone embriyo hayvan ödün vermeden. Yumurtlama ve de-jellying takiben, döllenmiş yumurtaların gastrulae içine gelişmesine izin verilir. Her gastrula embriyo aboral bölge cerrahi olarak kaldırılır ve izole aboral doku sonraki genomik DNA ekstraksiyon için kullanılır, kalan cerrahi sonrası embriyolar iyileşmek ve gelişmeye devam ederken. GDNA ekstraları daha sonra her embriyonun genotipini belirlemek için bir PCR tahlil için kullanıl?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Peltier Refrigerated Incubator	Shellab	SRI6PF	Used for spawning induction
Instant ocean sea salt	Instant ocean	138510
Brine shrimp cysts	Aquatic Eco-Systems, Inc.	BS90
L-Cysteine Hydrochloride	Sigma Aldrich	C7352
Standard Orbital Shaker, Model 3500	VWR	89032-092
TRIS-HCl, 1M, pH8.0	QUALITY BIOLOGICAL	351-007-01
Potassium chloride	VWR	BDH9258
EDTA, 0.5M pH8	VWR	BDH7830-1
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Nonidet-P40 Substitute	US Biological	N3500
Proteinase K solution (20 mg/mL), RNA grade	ThermoFisher	25530049
Agarose	VWR	710
Micro Dissecting needle holder	Roboz	RS-6060
Tungsten dissecting needle	Roboz	RS-6063
PCR Eppendorf Mastercycler Thermal Cyclers	Eppendorf	E6336000024
Phusion High-Fidelity DNA polymerase	New England BioLabs	M0530L
dNTP mix	New England BioLabs	N0447L
GLWamide universal forward primer			5’- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3’
Reverse primer specific to glw-a			5’-CCAGATGCCTGGTGATAC-3’
Reverse primer specific to glw-c			5’- CGGCCGGCGCATATATAG-3’