Konveksiyon ile Murine beyin içine antikorların teslimi-gelişmiş teslimat

Özet

Konveksiyon-geliştirilmiş teslimat (CED) büyük doku hacimleri doğrudan perfüzyon ile beyin içine terapötik etkili teslim sağlayan bir yöntemdir. Prosedür kateterler ve optimize enjeksiyon prosedürü kullanımı gerektirir. Bu protokol, bir antikor, bir fare beyninde CED için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Özet

Konveksiyon-geliştirilmiş teslimat (CED) bir kateter sistemi kullanarak büyük beyin hacimleri etkili perfüzyon sağlayan bir Nöroşirürji tekniktir. Böyle bir yaklaşım tarafından güvenli bir teslimat yöntemi sağlar-kan beyin bariyeri (BBB), böylece kötü BBB-geçirgenlik veya sistemik pozlama, örneğin, toksisite nedeniyle istenen değildir ile terapötik tedavi izin geçirerek. CED, kateter tasarımı, enjeksiyon Protokolü ve infusat özelliklerinin optimizasyonu gerektirir. Bu protokol ile, farelerin kaudat putamen içine bir antikor 20 μg kadar içeren bir çözüm Ced gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Bu adım kateterler hazırlanması açıklar, onları test ve bir açılı frezeleme enjeksiyon programı kullanarak farelerde Ced gerçekleştirme. Protokol, diğer infüzyon hacimleri için kolayca ayarlanabilir ve kemoterapötik, sitokinler, viral parçacıklar ve lipozomlar dahil olmak üzere çeşitli izleyiciler veya farmakolojik olarak aktif veya aktif olmayan maddeler enjekte etmek için kullanılabilir.

Giriş

Kan beyin bariyeri (BBB), merkezi sinir sistemini (CNS) kan dolaşımına ayıran yarı geçirgen bir kenarlık oluşturur. Tedavi ile CNS ulaşma ancak çeşitli hastalıklar bağlamında gerekli, beyin tümörleri gibi, Alzheimer hastalığı (AD) veya Parkinson hastalığı (PD) diğerleri arasında¹. Bu yeni tedavilerin gelişiminde önemli olur, özellikle test edilen ilaç kötü bbb geçirgenliği sergiler veya sistemik pozlama tehlikeli toksisite yol açabilir^1,2. Klinik olarak kullanılan antikorların bazıları bu özelliklerin her ikisini de görüntüler. Bu soruna bir çözüm doğrudan BBB arkasında terapi sunmak olacaktır.

Konveksiyon-geliştirilmiş teslimat (CED) büyük beyin hacimleri etkili perfüzyon sağlayan bir Nöroşirürji tekniktir. Bu cerrahi olarak hedef alanda bir veya daha fazla kateter yükleyerek elde edilir. İlaç uygulaması sırasında, kateter açılışında bir basınç degradesi oluşur ve bu da doku^3,4' te infusat dağılımının itici kuvveti haline gelir. Bu nedenle, perfüzyon aralığını belirleyen difüzyon katsayıları değil, infüzyon süresi^2,4,5. Bu, konvansiyonel, difüzyon bazlı intraserebral enjeksiyon yöntemleri^2,6ile karşılaştırıldığında çok daha büyük bir beyin hacmi üzerine infusat uniform teslim sağlar. Aynı zamanda, bu teslimat modalite doku hasarı daha düşük bir riski vardır². Buna göre, CED, CNS tümörlerinin tedavisi için konvansiyonel kemoterapötik maddelenin güvenli ve etkili bir şekilde yönetilmesi ve diğer CNS bozukluklarının çok sayıda immünomodülatör ajanların veya agonistik ve antagonistik antikorların teslimine olanak verebilir^{2 ,7,8,9}. Ced Şu anda Parkinson hastalığının terapilerinde, Alzheimer hastalığının yanı sıra yüksek dereceli glioma^2,7,8,10,11' de test edilmiştir.

Kateter tasarımı ve enjeksiyon rejimi Ced ^{10,12,13,14,15,16}sonucunu etkileyen en önemli faktörler arasındadır. Ayrıca, bu infusate spesifik Fizikokimyasal özellikleri gerektirir, partiküllerin orta boyutu da dahil olmak üzere, bir Anionik şarj, ve düşük doku benzeşimi ^10,17. Bu parametrelerin her biri,^2,10,17hedeflenecek beyin bölgesinin histolojik özelliklerine göre potansiyel olarak ayarlanmalıdır.

Burada farelerin kaudat putamen (striatum) içine bir antikor çözüm Ced gerçekleştirmek için metodoloji açıklanmaktadır. Ayrıca, protokol, bir laboratuar kurulumunda adım kateterlerinin hazırlanması, onları in vitro test ve CED gerçekleştirme içerir.

Literatürde mevcut olan birden fazla kateter tasarımı vardır, kanül şekline göre farklı, kullanılan malzemeler ve kateter açıklıkları sayısı^{12,15,18,19,20 ,21,22}. Künt bir metal iğnesinden 1 mm çıkıntılı, erimiş silika kapiller ile yapılan bir adım kateter kullanıyoruz. Bu kateter tasarımı kolayca bir araştırma laboratuarında imal edilebilir ve tekrarlanarak, vitro²³' te beyin parankiması gibi fiziksel parametrelerle agaroz blokları ile test edildiğinde iyi Ced sonuçları verir.

Dahası, 5 μL infusate in vivo sunmak için bir açılı frezeleme rejimi uygulıyoruz. Böyle bir protokolde, enjeksiyon hızı 0,2 μL/dak 'dan en fazla 0,8 μL/dak 'a yükseltilmiştir, böylece kateter boyunca infusate reflü olasılığını minimize ederek doku hasarı riski¹⁶' dır. Bu protokolü kullanarak, 11 dk 30 sn boyunca 5 μL PBS 'de 20 μg ' ye kadar antikor içeren fareler başarıyla yönetilmektedir.

Protokol, diğer infüzyon hacimleri için veya diğer çeşitli maddeleri enjekte etmek için kolayca ayarlanabilir, örneğin kemoterapötik, sitokinler, viral parçacıklar veya lipozomlar^{2,10,14,18 ,22}. Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) veya suni beyin omurilik sıvısı (aCSF) antikorların çözeltisine kıyasla büyük ölçüde farklı Fizikokimyasal özellikleri ile infusate kullanımı durumunda, ek doğrulama adımları önerilir. Kateter montajı, doğrulama ve CED için, normal bir stereotaktik çerçeveye monte edilmiş bir matkap ve enjeksiyon ünitesi ile stereotaktik bir robot kullanarak tüm adımları tarif ediyoruz. Bu prosedür Ayrıca, açıklanan cam mikroşırıngayı kullanabilen programlanabilir mikroinfüzyon pompasına bağlı manuel stereotaktik çerçeveyle de gerçekleştirilebilir.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler ZH246/15 lisans numarası altında Isviçre Cantonal veteriner ofisi tarafından onaylanmıştır.

1. Step kateterleri hazırlanması

1. Kateter adım için erimiş silika tüpünün hazırlanması
   1. 0,1 mm iç çapı ve 0,0325 mm tüpün duvar kalınlığı 30 mm uzunluğuna sahip olan erimiş silika kapiller keser.
   2. Çatlaklar için tüp incelemek ve tüp açıklıkları pürüzsüz bir yüzeye sahip sağlamak için bir mikroforge kullanarak biter ısı cilası.
2. Metal iğnesinde iç tüpün sabitlenme
   1. 10 μL şırınga üzerine 27 G iğne monte edin ve şırıngayı stereotaktik bir robota yerleştirin.
   2. Robotu kullanarak, şırıngayı sert bir yüzeye taşıyın ve iğne ucu ile dokunun. Bu pozisyon, kateter adımının uzunluğunu ayarlamak için bir referans yüzeyi olarak hizmet edecek çünkü yazılıma dikkat edilmelidir veya kaydedilmelidir.
   3. İğnenin içindeki erimiş silika kapiller yerleştirilmesi etkinleştirmek için iğne yükseltmek
   4. Erimiş silika kapiller iğnenin içinde, 20 mm kapiller iğne çıkıntılı olduğu gibi yerleştirin.
   5. Bir pipet kullanarak, 2 μL yüksek viskoziteye sahip siyanoakrilat yapıştırıcı kapiller üzerine, metal iğne başlayarak ve son 10 mm kapiller alt ucundaki, Şekil 2' de tasvir olarak yaymak.
   6. Stereotaktik robotu kullanarak, metal iğne ucu referans yüzeyi üzerinde 1 mm kadar iğne aşağı. Bu şekilde, erimiş silika kapiller metal iğnesinde düzeltilecektir ve metal iğnesi ucunu 1 mm adım oluşturur. Adım köreltme önlemek için metal iğne sonunda şekillendirme tutkal fazlalığını çıkarın.
   7. Yapıştırıcı için 15 dakika bekleyin ve stereaktik robottan kateter ile şırınga çıkarın. Bir mikroskop altında kateter ucunu kontrol ederek tüm aşırı tutkal kaldırıldı adımda onaylayın.
3. Adım kateteri agaroz bloğunu kullanarak test etme
   1. Geleneksel jel tepsisinde PBS 'de% 0,6 agaroz solüsyonu hazırlayın ve polimerize olana kadar bekleyin. Yaklaşık 20 mm x 20 mm bloklar içinde agaroz kes. Kullanım kadar, PBS batırılmış blokları tutmak.
   2. Step kateter şırıngasını el ile 10 μL 0,4%% filtre edilen tripan mavi çözeltisi ile doldurun.
   3. Stereotaktik robotu kullanarak, sabitleme prosedürü sırasında kateterin adımının sızdırmazlığını değerlendirmek için 0,2 μL/dk 'da 1 μL 'i dağıtın. Tripan mavi çözeltisi sadece kateter ucunda görünür olmalıdır. Kağıt dokusuyla silin.
   4. Agaroz bloğunu stereotaktik robota yerleştirin ve robotu kalibre edin, böylece kateterin ucu agaroz bloğunun yüzeyine göre başvurulabilir.
   5. CED için enjeksiyon parametrelerini programlamak.
      1. 5 μL enjeksiyon hacmi için aşağıdaki adımları kullanın: 0,2 μL/dak 'da 1 μL, sonra 0,5 μL/dak 'da 2 μL ve 0,8 μL/dak 'da 2 μL. son enjeksiyon hacmini, adımların her birinin süresini orantılı olarak değiştirerek belirli deneysel plana göre ayarlayın.
      2. Çözüm, murin kaudat putamen (striatum) içine enjekte etmek için, 3,5 mm derinliğinde kemiğinin bir pozisyonda 1 mm frontal ve 1,5 – 2 mm lateral böyle enjeksiyon gerçekleştirin.
      3. Enjeksiyonu yaptıktan sonra, kateteri 2 dakika boyunca yerine bırakın ve sonra kateter çıkarılması sırasında beynin sıvısının doğru dağılımını sağlamak ve enjeksiyon sisteminin mühürlenmesi için 1 mm/dak geri çekin.
         Not: Kullanılan özel stereotaktik robota bağlı olarak tüm parametreler tek bir komut dosyası halinde programlanabilir. Örnek bir komut dosyası, Tamamlayıcı malzemeolarak kullanılabilir..
   6. Ced prosedürünü başlatın ve agaroz bloğuna 5 μL tripan mavi çözüm enjekte etmek.
   7. Tripan mavi bulutun şeklini agaroz 'de ve kateter sistemi boyunca potansiyel sızıntıyı değerlendirin. Tripan mavisi, kateter ucunun çevresindeki merkezi ve en az 1 mm çapını içeren elipsoid veya yuvarlak bir bulut oluşturmalıdır. Metal iğne ucunun üzerinde büyük bir geri akış görünür olmalıdır.
   8. Kateterin agaroz ile tıkanmasını değerlendirmek için yeni bir agaroz bloğu yerleştirin ve 0,2 μL/dak 'da 1 μL 'ye ikinci bir enjeksiyon başlatın. Tripan mavi tekrar enjeksiyon başlamadan hemen sonra kateter ucunda bir bulut oluşturmak başlamalıdır.
   9. Şırıngadaki kalan hacminin 3 μL 'ye karşılık olup olmadığını değerlendirin. Herhangi bir varyasyon kateter montaj veya şırınga pistonlu bir sıvı sızıntısı doğru işaret edebilir.
   10. Tüm test enjeksiyonları başarılı olursa, kateter iyi mühürlü, düz ve hiçbir tripan mavi çözüm kateter ucunu daha diğer noktalardan gözlenen, deiyonize H₂o (DH₂o) ile kateter yıkayın tripan mavi hiçbir izleri görünür kadar ve sonra aşağıdaki gibi on kez yıkayın: 70% etanol ve 100% etanol tekrar% 70 etanol ve temiz deiyonize su ile yıkama izledi.
   11. Kateteri kuru koşullarda saklayın.

2. konveksiyon-antikor çözeltisi Murine beyin içine geliştirilmiş teslim

Not: Yerel hayvan refahı yönetmeliklerine bağlı olarak, bu prosedür için çeşitli anestezik, analjezikler ve antibiyotik türleri uygulanabilir. Bu protokol enjeksiyon anestezi kullanımını açıklar. Isoflurane gibi inhalasyon anestezisleri de stereotaktik çerçevede bir burun maskesi monte ederek kullanılabilir. Buna ek olarak, enfeksiyon profilaksi için içme suyuna antibiyotik eklemenizi öneririz.

1. Cerrahi kurulum
   1. Anestezik ve panzehir çözümlerini hazırlayın. Fareler, steril DH₂O 'da seyreltilmiş fentanil (0,05 mg/kg), midazolam (5 mg/kg) ve Medetomidin (0,5 mg/kg) içeren üç bileşenli anestezi kullanılarak güvenle anesteziye alınabilir. İki aşamalı uyanma prosedürünü, bir tane Flumazenil (0,5 mg/kg) ve buprenorfik (0,1 mg/kg) steril dH₂O (ilk panzehiri çözeltisi) içeren Iki panzehir solüsyonu kullanarak gerçekleştiriyoruz. Ikinci bir atipamezol içerir (2,5 mg/kg) steril dH₂O (ikinci panzehir solüsyonu).
   2. Steril dH₂O ile seyreltilmiş Karprofen (5,667 mg/kg) içeren analjezi çözeltisi hazırlayın.
   3. Stereotaktik çerçeveyi, Isıtma yastığı ve stereotaktik robotun unsurlarını temizleyin. Robotun tüm parçalarının hasar riski olmadan temizlendiğini unutmayın. Temizlik ve kullanım için hazırlık hakkında ayrıntılı bilgi için robotun kılavuzuna bakın.
   4. Enjektörü Step kateter ile birleştirin ve dH₂o,% 70 etanol ve% 100 etanol ile birden çok kez temizleyin, ardından% 70 etanol ve DH₂o ile tekrar yıkama yapın. Son olarak, intrakranial enjeksiyon için çözümün hazırlanması için kullanılacak PBS veya diğer tamponlar ile şırınga Flush, örneğin yapay beyin omurilik sıvısı. Şırınga piston tüm prosedür sırasında sorunsuz ve serbestçe hareket etmelidir.
   5. Stereotaktik robot yazılımını stereotaktik çerçeveyle kalibre edin.
   6. Robot kolların serbestçe hareket etmesini ve enjeksiyon pompasının düzgün bir şekilde bağlandığını ve CED prosedürünü herhangi bir rahatsızlıksız gerçekleştirebilmesini sağlayarak stereotaktik robot yazılımını sınayın. Bu, robot hareketini test etme, enjeksiyonu çekiş, 2 dk bekleme adımını ve kateter retraksiyon hızını kontrol etmek içerir. Tüm parametreler, 1.3.5 noktasında açıklanan önceden programlanmış CED prosedürünü sığdırmalıdır.
   7. Matkap üzerine matkap biti takın. Kullanmadan önce matkap bitlerini sterilize etmeniz önerilir.
   8. PBS veya aCSF gibi diğer tampon çözümlerini kullanarak antikor çözümünü hazırlayın. 5 μL 'de 1 ila 20 μg antikor tek bir CED prosedüre enjekte edilebilir. Deney yapmadan önce diğer birimler ve protein miktarları test edilmelidir. Yüksek viskozite çözeltileri kullanarak kateter tıkanmasını neden olabileceğini unutmayın.
   9. Enjektörü seyreltilmiş antikor ile manuel olarak yükleyin.
2. Striatum içine CED tarafından antikor enjeksiyon
   1. Fareyi tartın ve üç bileşenli anestezi çözümünü vücut ağırlığına göre peritona enjekte et. Enjeksiyon süresini not edin. Fareyi bir ısıtma yastığı ile ısıtılan ayrı bir kafeye aktarın.
   2. Sedasyon başladığında belirlemek için fareyi gözlemlemek. En kısa sürede fare hareket durur, ameliyat sırasında kurutulması kornea korumak için gözlerde oftalmik merhem uygulayın. Tam sedasyon genellikle üç bileşenli anestezi çözeltisi enjeksiyonu 10 – 15 dakika başlar.
   3. Hayvan tam anestezi sağlamak için tutam-refleks testi kullanarak ağrı reaksiyonları kontrol edin.
   4. Bir saç düzeltici kullanarak başını tıraş.
   5. İyot çözeltisi içinde ıslatılmış pamuk bezlerden ile cilt dezenfekte. Dairesel harekette cildi üç kez fırçalayın.
   6. Bir neşter kullanarak, kafatası orta çizgi boyunca göz seviyesinde bitirme 10 mm Cilt kesi yapın.
   7. Burun kelepçe ve kulak çubukları kullanarak stereotaktik çerçevede fareyi düzeltin. Kafatası yüzeyinin yatay ve sıkıca sabitlendiğinden emin olun. Doğru anatomik navigasyon dışında bu da sondaj ve CED prosedürü sırasında kafatası eğme önlemek için çok önemlidir.
   8. Şırınga stereotaktik robota yerleştirin.
   9. Matkap bitini bir referans noktasında kateter ucunu ile senkronize edin. Bu matkap ve şırınga konumu arasındaki ilişki tam olarak yazılım belirlenir, bu nedenle enjeksiyonu beyin istenilen anatomik bölgede gerçekleştirilebilir önemlidir.
   10. Forseps kullanarak cildi geri çekin ve kafatası yüzeyinde kemiğinin yerelleştirmek.
   11. Matkap biti ucunu kullanarak yazılım referans kemiğinin.
   12. Matkap 1 mm frontal ve 2 mm lateral kemiğinin ve bir Burr delik matkap bir konuma taşıyın. Dura mater zarar değil dikkatli olun.
   13. Şırıngayı burr deliğinin üzerine taşıyın.
   14. Kateter içinde hava kabarcıkları kalmadığından emin olmak için şırıngadan 0.5 – 1 μL çıkarın.
   15. 1.3.5 noktasında açıklanan CED programını başlatın. Enjeksiyon noktadan sıvı geri akış izleri için kafatası yüzeyine dikkat edin. Hayvanın solunum hızını izleyin.
   16. CED programı sona erdiğinde ve kateter beyinden çekildikten sonra, CED sırasında kateter tıkanmasını kontrol etmek için enjeksiyon pompasını 0,2 μL/dak olarak başlatın. Hiçbir tıkanması meydana gelmemelidir, hemen kateter ucunun gelen enjeksiyon karışımı bir damlacık görmek gerekir.
   17. Kateteri yeniden kullanmadan veya saklamadan önce, kateter adımını mikroskop altında herhangi bir hasar belirtisi veya aşınması için görsel olarak inceleyin ve adım 1.3.10 gibi temizleyin.
3. Uyanma prosedürü
   1. Fareyi stereotaktik çerçeveden nazikçe çıkarın.
   2. Cerrahi siteyi steril tuz çözeltisi ile yıkayın.
   3. Forseps kullanarak, Burr Deliği kemik balmumu ile doldurun.
   4. İnce uçlu forseps ile cildi kapatın ve kesme üzerine 10 μL pipet ile cerrahi tutkal uygulayın. Polimerize etmek için tutkal için 15 – 30 s bekleyin.
   5. Subkutan Enjeksiyon ile analjezi çözümü uygulayın. Enjeksiyon süresini not edin.
   6. İlk panzehir çözümünü uygulayın. Enjeksiyon süresini not edin.
   7. Bir Isıtma Pad ile ayrı bir kafes için fareyi aktarmak ve ürkütücü refleksleri için hayvan izlemek.
   8. Eğer fare ilk panzehir çözeltisi uygulamadan 15 dakika sonra tam bilinç kazanmadı ise, subkutan enjeksiyonu ile ikinci panzehir çözümünü uygulayın.
   9. Kurtarma aşamasında hayvanları izleyin.
   10. Kontrol 1-2 h daha sonra yanı sıra post-operatif komplikasyonlar için ertesi gün. Gerekirse, analjezi yeniden uygulayın.
   11. Enfeksiyon profilaksi için, sülfadoxin ekleyin (son konsantrasyon 0,08% w/v) ve trimetoprim (son konsantrasyon 0,016% w/v) hayvanların erişim reklam Isteğe bağlı için hangi içme suyu için 1 hafta ameliyattan sonra.

Sonuçlar

Bu protokol, bir laboratuar ortamında CED prosedüründe kullanılmak üzere adım kateterleri (Şekil 1) hazırlamanıza olanak tanır. Sızıntı için kateterler kontrol etmek için, iğne yolu boyunca reflü ve tıkanması, bir agaroz blok içine, örneğin, tripan mavi çözüm, bir boya enjeksiyonları gerçekleştirme öneririz. Figure 3 , Ced kateter (Şekil 3a) kullanarak 0,5 μL/dakikada 1 μL enjekte ettikten sonra tripa...

Tartışmalar

Konveksiyon-gelişmiş teslimat, ya da beyin içine basınç aracılı ilaç infüzyon, ilk teklif edildi erken 1990³. Bu yaklaşım kontrollü bir şekilde kan beyin bariyerinin arkasında büyük beyin hacimleri perfüzyon vaat². Ancak, şimdiye kadar, sadece birkaç klinik denemeler bu yaklaşım kullanılarak yapılmıştır, kısmen çünkü bir klinik kurulum Ced Teknik olarak^24,25talep göstermiştir. Kateter...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 μL syringe	Hamilton	7635-01
27 G blunt end needle	Hamilton	7762-01
Agarose	Promega	V3121
Atipamezol	Janssen
Bone wax	Braun	1029754
Buprenorphine	Indivior Schweiz AG
Carprofen	Pfizer AG
Dental drill bits, steel, size ISO 009	Hager & Meisinger	1RF009
Ethanol 100%	Reuss-Chemie AG	179-VL03K-/1
Fentanyl	Helvepharm AG
FITC-Dextran, 2000 kDa	Sigma Aldrich	FD2000S
Flumazenil	Labatec Pharma AG
Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775-500ML
High viscosity cyanoacrylate glue	Migros
Iodine solution	Mundipharma
Medetomidin	Orion Pharma AG
Microforge	Narishige	MF-900
Midazolam	Roche Pharma AG
Ophthalmic ointment	Bausch + Lomb	Vitamin A Blache
PBS	ThermoFischer Scientific	10010023
Polyclonal goat anti-rat IgG (H+L) antibody coupled with Alexa Fluor 647	Jackson Immuno
Scalpels	Braun	BB518
Silica tubing internal diameter 0.1 mm, wall thickness of 0.0325 mm	Postnova	Z-FSS-100165
Stereotactic frame for mice	Stoelting	51615
Stereotactic robot	Neurostar	Drill and Injection Robot
Succrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
Topical tissue adhesive	Zoetis	GLUture
Trypan blue	ThermoFischer Scientific	15250061
Water	Bichsel	1000004