JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, İmmünohistokimya ve yüksek çözünürlüklü beyin bölgelerinin proteinleri için tarama ile birlikte yakın kızılötesi boyalar kullanan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Nörobilim, beyindeki hücrelerin çeşitli fonksiyonları nasıl Arabulmaya çalışışıdır. Hücresel fonksiyon hücre proteinlerinin bileşimi ve aktivitesi ile belirlendiği için nöronlar ve glia 'da protein ifadesinin ölçülmesi Nörobilim çalışması için önemlidir. Bu yazıda, immünosittokimya 'nın farklı beyin bölgelerinde yarı niceliksel bir protein ifadesi sağlamak için yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü taramayla nasıl birleştirildiğini açıklayacağız. Bu teknik aynı beyin bölgesinde tek veya çift protein ifadesi için kullanılabilir. Bu moda proteinleri ölçme deneysel manipülasyon ile protein ifadesinde göreceli bir değişiklik elde etmek için kullanılabilir, öğrenme ve bellek moleküler imza, moleküler yollardan aktivite, ve birden fazla beyin bölgelerinde nöral aktivite. Doğru proteinleri ve istatistiksel analizi kullanarak, beyin bölgeleri arasında fonksiyonel bağlantı da tespit edilebilir. İmmünosittokimya bir laboratuvarda uygulama kolaylığı göz önüne alındığında, yakın kızılötesi yüksek çözünürlüklü tarama ile immünsitokimya kullanarak bir sistem düzeyinde nörobiyolojik süreçleri incelemek için Nörobilim yeteneği genişletebilirsiniz.

Giriş

Nörobilim çalışma beyin hücrelerin belirli fonksiyonları aracı nasıl bir soruşturma endişeleri1. Bu nasıl glia hücrelerinin merkezi sinir sisteminde dokunulmazlık görüşmek gibi doğada hücresel olabilir ya da dorsal hipokampus nöronların aktivitesinin mekansal navigasyon neden açıklamak amacı deneyler içerebilir. Geniş anlamda, hücresel fonksiyon, bir hücrede ifade edilen proteinler ve bu proteinlerin aktivitesi2ile belirlenir. Sonuç olarak, beyin hücrelerinde proteinlerin ifade ve/veya etkinliğini ölçmek Nörobilim çalışması için önemlidir.

Beyindeki protein ifadesini ölçmek için bir dizi teknik mevcuttur. Bu reseptör yoğunlukları için pozitron emisyon topografyası gibi in vivo yöntemleri içerir3 ve küçük peptitler için mikro-diyaliz4. Daha sık, ex vivo yöntemleri protein fonksiyonu ve ifade incelemek için kullanılır. Bunlar arasında kütle spektrometresi teknikleri5, Batı leke ve enzim bağlantılı İmmünosorbent tahlil (ELISA)6ve immünositokimya7yer aldı. İmmünositokimya Nörobilim alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, bir protein (veya antijen) ilgi (örn., c-fos) ve proteinli primer antikor kompleksi (Şekil 1) tespit etmek için konjonk ikincil antikor algılamak için birincil antikor kullanımını içerir. Protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksinin algılanmasını sağlamak için, ikincil antikorlar, onlara konjuze edilen horserpu peroksidaz (HRP) gibi maddelere oksitleyici sahiptir. Bu ışık mikroskobu7kullanılarak tespit edilebilir hücrelerde çökeller oluşumu için izin verir. İkincil antikorlar da onlara (yani, fluorophores) conjuated kimyasallar floresan olabilir. Ne zaman bu kimyasallar uyarıcı protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksleri7algılamak için kullanılabilir ışık, yayar. Son olarak, bazen primer antikorlar azalan ajanlar ve floresan kimyasallara bağlı olarak ikincil antikorlara olan ihtiyacını doğrudan ihmal ediyorlar7 (Şekil 1).

İlginçtir, birçok immünosittokimya yöntemleri beyin hücrelerinde proteinlerin görselleştirme için izin, ancak belirli bir hücre veya beyin bölgesinde protein miktarını ölçmek için yeteneği. Azaltma reaksiyonlarının çökmesini algılamak için ışık mikroskobu kullanarak nöronların ve glia görselleştirme için izin verir, ancak bu yöntem hücrelerde veya belirli bir beyin bölgesinde protein ifadesi ölçmek için kullanılamaz. Teorik olarak, fluoresan mikroskobu için kullanılabilir, çünkü floresan ikincil antikor yayılan ışık protein-primer antikor-ikincil antikor kompleksi bir ölçüsüdür. Ancak, beyin dokusunda otofloresans, beyin dokusunda protein ifadesini ölçmek için Floresan Mikroskobu kullanmak zor yapabilir8. Sonuç olarak, beyin dokusu floresan görüntülerden yayılan ışık nadiren beyinde protein ifadesi ölçmek için kullanılır.

Bu konuların çoğu yüksek çözünürlüklü tarama9,10ile birlikte yakın kızılötesi immünosittokimya kullanılarak ele alınabilir. Bu yazıda, yakın kızılötesi emisyon spektrumunda fluorophores ile birleşen immünositozin, yüksek çözünürlüklü tarama (örneğin, 10 – 21 μm) ile birleştirilip farklı beyin bölgeleri.

Protokol

Aşağıdaki protokol Delaware Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (IAUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol için yaklaşık 55 – 75 gün eski erkek Sprague Dawley fareler kullanıldı.

1. beyin ekstraksiyon ve doku hazırlama

  1. Anestezi indüksiyon odasında isofluran ile sıçan artık ayak tutam bir yanıt sergiler kadar fare anestezize.
  2. Bir Giyotin kullanarak hızlı deplitasyon ile fareler feda.
  3. Kafatası arka ön ve kafatası üst açık deri kes.
  4. Dikkatli bir şekilde kafatası arka parçasını kaldırmak için rongeurs kullanın ve sonra küçük Diseksiyon makas kullanarak kafatası orta çizgi aşağı kesmek, beyin dokusu zarar görmesini önlemek için her zaman kafatası üst karşı yukarı iterek.
  5. Beyin ortaya çıkarmak için kafatasının yarısını sağ ve sol soyulmak için rongeurs kullanın.
  6. Beyin altında kepçe için küçük bir spatula kullanın ve sinirleri sever, dikkatle beyin yükseltmek ve kuru buz üzerinde soğutulmuş isopentane beyni dondurmak (en az-20 °C). Bundan sonra, beyin a-80 ° c dondurucuya kadar dilimleme kadar saklayın.
  7. -9 °C ve-12 °C arasında tutulan bir kriyostat içinde 30 – 50 μm ' lik ilgi bölgelerindeki beyni dilimleyin. Doğrudan cam slaytlar üzerine dilimleri monte ve a-80 °c buzluğu immünositokimya tahlil zamana kadar saklayın.
    Not: Bu protokolde beyin bölgelerinde Hippocampus ve amigdala vardı.

2. tek Immünhistokimyasal reaksiyon

Not: Çift immünhistokimyasal reaksiyon için, protokol tek immünhistokimyasal reaksiyon ile aynıdır, ancak bu reaksiyon farklı konakların iki primer antikoruna sahiptir (örneğin, tavşan ve fare) ve karşılık gelen iki ikincil antikorlar tek bir konak (örneğin, keçi antirabbit ve keçi antimouse) olmalıdır. İkincil antikorlar da yüksek çözünürlüklü tarayıcılar mevcuttur iki farklı Spectra olması gerekir. Örneğin, 680 Nm 'de bir emisyon spektrumunun zirvesine sahip bir ikincil antikor ve bir ikincil antikor 800CW (780 nm 'de emisyon spektrumunun zirvesinde).

  1. Dondurucudan cam slaytları çıkarın ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
  2. Bir duman kaputu altında, 0,1 M fosfat tampon tuzlu (PBS) Oda sıcaklığında 1 − 2 h için% 4 civarında formaldehite beyin dokusu düzeltin.
  3. 0,1 M Tris tamponlu tuz (TBS) içinde 10 dakika boyunca üç kez durulayın. 30 − 60 dakika boyunca hafif bir deterjanla (örn.% 0,01 deterjan) slaytları inküten hücre membranlarını geçirgen.
  4. TBS 'deki slaytları her biri 15 dakika boyunca üç kez durulayın.
  5. Doğru konsantrasyon PBS ilgi protein için primer antikor seyreltilme. Örneğin, hemen erken gen c-fos algılamak için, 1:500 bir konsantrasyon bir tavşan primer Anti c-fos antikor hazırlayın.
  6. Doğrudan beyin dokusu üzerine pipet primer antikor çözeltisi (yaklaşık 200 μL başına 3 inç x 1 inç slayt).
  7. 4 °C ' de oda sıcaklığında 1 − 2 saat ya da gece (~ 17 saat) için primer antikor seyreltme sırasında beyin dokusunu cam slaytlarda tutmak için kapak fişi kullanın.
  8. Her biri için dört kez (örneğin,% 0,01 deterjan, "TBS-T") eklenen küçük bir deterjan miktarı olan TBS 'de kapak kuponları ve yıkama kaydırakları çıkarın.
  9. 2 h için oda sıcaklığında ikincil bir antikor içinde beyin bölümlerini kulkaymak için Cover, kullanın.
    Not: İkincil antikor, doğru seyreltme ve TBS, deterjan ve ana serumun% 1,5 ' ü içeren bir seyreltilme olmalıdır. Örneğin, 1:2000 ' in seyreltilmesi sırasında bir keçi ikincil antikor% 1,5 keçi serumu ve% 0,05 deterjan içerir.
  10. TBS-T ' y i her biri 20 dakika boyunca dört kez ve sonra TBS 'de 20 dakika boyunca dört kez durulayın.
  11. Karanlık bir gecede oda sıcaklığında kuru slaytlar. Slaytlar kuru olduğunda, görüntüleme için hazırdır.

3. görüntüleme

  1. Doku aşağı bakacak şekilde yakın kızılötesi tarama arayüzü üzerine slaytlar yerleştirin. Bir seçim aracını kullanarak bir defada bir cam slayt veya birden fazla slayt görüntü.
  2. 0 Nm uzaklığı ve 21 μm çözünürlüğe sahip en yüksek kalitede ayarı kullanarak görüntü slaytları. Tarama genellikle kullanılan tarama ekipmanınıza bağlı olarak 13 − 19 h alacaktır.
  3. Görüntü analiz yazılımına (örn. ImageStudio) görüntüleri içe aktarın ve yarı nicel protein analizini görüntüleyin ve işaretleyin.

4. protein Ifadesi Analizi

  1. Görüntü analiz yazılımını açın ve görüntünün tarandığı çalışma alanını seçin.
  2. Taramayı görüntülemek için görüntü analiz yazılımında taranan görüntüyü açın ve Ham görüntüyü veya toplam nicelik emisyonu değiştirmeden gösterilen kontrast, parlaklık ve büyütme gibi hangi dalga boylarının görüntülendiği ayarlayın.
  3. Ölçüme yönelik anahtar bölgeleri tanımlayın ve sayfanın üst kısmındaki analiz sekmesini seçin, ardından dikdörtgen çizin (veya elipsi çizin/FreeHandçizin), nicelleştirilir alan üzerinde bir dikdörtgen çizin.
  4. Dikdörtgenin boyutunu görüntülemek için ekranın sol alt tarafındaki şekiller 'i seçin, ardından sağ alt tarafında sütunlar 'ı seçin. Şekil boyutunu tanımlamak için Yükseklik ve Genişlik sütunları ekleyin.
    Not: Ölçü miktarını karşılaştırırken şekil boyutunu kontrol etmek önemlidir. O bölge için emisyonların doğru bir şekilde örnekleme elde etmek için, istenilen miktarın içinde yer alan özdeş şekiller kullanılması önerilir.
  5. Sonra şekli adlandırın ve tekrarlayın. Tüm bölgeler örneklendikten sonra sütunlar sekmesinden kullanılabilen veriler toplanabilir ve analiz edilebilir.

Sonuçlar

İmmunhistokimya için yüksek çözünürlüklü tarama kullanmadan önce, bir protokol çalıştığını doğrulamak gerekir. Bu aynı hayvanın beyin bölümleri birincil ve ikincil antikorlar, ikincil antikor tek başına, ya da ne birincil ne de ikincil antikor ile inkübe bir doğrulama tahlil kullanılarak gerçekleştirilebilir. Böyle bir doğrulama tahlil sonuçları Şekil 2' de gösterilir. Bu reaksiyonda, dorsal hipokampus ve amigdala 'da hemen ...

Tartışmalar

Bu makalede sunulan sonuçlar, yüksek çözünürlüklü tarama ile birlikte yakın kızılötesi immünsitokimya beyin dokusunda protein ifadesi yarı niceliksel önlemler elde etmek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Aynı beyin bölgesinde aynı anda iki proteini etiketlemek için de kullanılabilir. Daha önce birden fazla beyin bölgelerinde hemen erken gen ifadesi ölçmek için yakın kızılötesi immünhistokimya kullandık9,10. Hemen erke...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu raporda yapılan araştırmalar, NIGMS 'den (1P20GM103653) DK 'ya verilen bir hedef hibe tarafından finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Brain Extraction
Anesthesia Induction ChamberKent ScientificVetFlo-0530SM
Kleine GuillotineHarvard Apparatus73-1920
Friedman RongeurFine Science Tools16000-14used to remove back of skull
Delicate Dissecting ScissorsFischer Scientific08-951-5used to cut upward along midline of skull
Micro SpatulaFischer Scientific21-401-5used to scoop out brain
Glass Microscope SlidesFischer Scientific12-549-6
Immunohistochemical Reaction
 Triton X-100Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody 
Tween-20Used as a small amount of detergent added to TBS  to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody
Licor Odyssey scannerLicor Biotechnology Inc.
Image StudioLicor Biotechnology Inc.

Referanslar

  1. Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
  2. Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
  3. Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
  4. Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
  5. English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
  6. David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
  7. Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
  8. Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
  9. Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
  10. Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
  11. Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
  12. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  13. Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
  14. Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimsay 147imm nhistokimyayak n k z l tesiy ksek z n rl klmPFCamygdalahipokampus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır