Perivasküler Adipose dokularında modülasyon odaklı Izole mezenterik arterlerin kullanıldığı vasküler ton tepkisini değerlendirmek

Özet

Protokol, farelerden izole edilen mezenterik arterlerin transmural izometrik gerginliğini değerlendirmek için tel miyografi kullanımını açıklar ve endotel hücrelerden ve perivasküler adipoz dokulardan salınan faktörlerin modülasyonunun özel olarak değerlendirilmesidir.

Özet

Patofizyolojik stimüllerin vasküler ton reaksiyonunun değiştirilmesi, çok çeşitli kardiyovasküler ve metabolik hastalıkların gelişmesine katkıda bulunur. Endotel disfonksiyon azaltılmış vazodilatasyon ve arterlerin vazokonstriksiyon gelişmiş için büyük bir suçlu temsil eder. Arterlerin çevreleyen Adipose (yağ) dokularda endotelyum bağımlı rahatlama ve/veya vasküler pürüzsüz kas hücrelerinin kasılma düzenlenmesi önemli roller oynar. Endotel ve perivasküler adipoz dokularının arasındaki çapraz görüşmeler, Tel miyografi sistemi ile monte edilmiş kan damarlarını kullanarak ex vivo olarak değerlendirilebilir. Ancak, farklı türler, yaş, genetik kökenden ve/veya patofizyolojik durumların hayvanlarından elde edilen arterlerde optimum ayarlar kurulmalıdır.

Giriş

Arterlerin DİLATASYONLARI ve daralması, sırasıyla, vasküler pürüzsüz kas hücrelerinin gevşemeleri ve kasılmaları ile elde edilir. Küçük arterlerin vasküler yanıt değişiklikleri otonjik sinirler ve hormonlar kanda mevcut (örneğin, katekolaminler, Anjiyotensin II, serotonin, vasopressin) arteriyel kan basıncı homeostatik düzenleme katkıda bulunur. Yerel düzeyde, pürüzsüz kas hücrelerinin vasküler tepkiler intima ve arterlerin çevreleyen adipoz dokusu hem endotel hücrelerinden sinyalleri ile modüler (Şekil 1).

Endotelyum sadece pasif bir bariyer değil, aynı zamanda kan ve altta yatan vasküler pürüzsüz Kas hücreleri arasında sinyal değişimi için bir yüzey olarak hizmet vermektedir. Çeşitli vazoaktif maddeleri serbest bırakarak, endotelyum vasküler ton yanıtlarının yerel kontrolünde kritik bir rol oynar¹. Örneğin, asetilkolin yanıt olarak, endotel nitrik oksit sentaz (Enos) nitrik oksit üretmek için endotel aktive edilir (Hayır), hangi çözünür Guanil siklaz (SGC) ^{aktive ederek altta yatan vasküler pürüzsüz Kas rahatlama indükler 2}. diğer vazoaktif maddeler dahil Nonsteroid antienflamatuar ilaçlar ürünleri (örn., protoktik ve trombokan A₂), lipoksijenaz (örn., 12-hidroksiosatetraenoik asitler, 12-HETE), ve sitokrom P450 monooxygenases (hetes ve epoxyeicosatrienoic asitler, EETs), reaktif oksijen türleri (ROS), ve vazoaktif peptidler (örneğin, endothelin-1 ve Anjiyotensin II), ve endotel-türevi hiperpolarizasyon faktörleri (EDHF)³. Endotel türevi vazodilatörler ve vazokonstriktörler arasında hassas bir denge yerel vazomotor tonu^4,5korur.

Endotel disfonksiyon endotelyum bağımlı vazodilatasyon⁶, vasküler yaşlanma bir damgasını bozukluğu ile karakterize⁷. Yaş ile, endotelyum vasodilatasyon teşvik yeteneği aşamalı olarak azalır, büyük ölçüde bir azaltılmış NO biyokullanılabilirlik, hem de anormal ifade ve fonksiyon eNOS endotelyum ve sGC vasküler pürüzsüz kas hücrelerinde^{8 , 9 , 10}. azaltılmış hiçbir biyokullanılabilirlik endotel-bağımlı vasoconstrictors üretimini güçlendiren^11,12. Yaşlı arterlerde, endotel disfonksiyon medyada hiperplazi neden olur, duvar kalınlığındaki işaretli artışların yansıtıldığı gibi, medial çekirdekler sayısı, hipertansiyon ve ateroskleroz arteriyel kalınlaşma anımsatan insan gözlenen hastalar^13,14. Buna ek olarak, obezite, diyabet veya hipertansiyon gibi patofizyolojik koşullar endotel disfonksiyon gelişimini hızlandırır^15,16.

Perivasküler adipoz doku (PVAT) vasküler yapı ve fonksiyon¹⁷düzenleyen sayısız adipokines bültenleri. Pvat 'ın Anti-kontrel etkisi, adiponektin, Hayır, hidrojen peroksit ve hidrojen sülfür^18,19,20gibi rahatlatıcı faktörler tarafından aracılık edilir. Ancak, konum ve patofizyolojik duruma bağlı olarak, PVAT ayrıca çeşitli arterlerde kontril tepkiler artırabilir²¹. Pvat tarafından üretilen Pro-kontril maddeler Anjiyotensin-II, leptin, resistin ve Ros^22,23içerir.  İzole kan damarlarındaki çalışmaların çoğunda PVAT, damar işleme için basit bir yapısal destek olarak kabul edilmiştir ve böylece kan damarının halka segmentlerinin hazırlanması sırasında kaldırılır. Adipoz disfonksiyon hipertansiyon ve ilişkili kardiyovasküler komplikasyonlar için bağımsız bir risk faktörü temsil beri²⁴, kan damarları çevreleyen pvat vasküler tepkisini araştırırken dikkate alınmalıdır farklı arterlerde.

Çok tel miyografi sistemleri yaygın aort, mezenterik, böbrek, femoral, serebral ve koroner arter dahil olmak üzere çeşitli kan damarlarının vazomotor işlevlerini araştırmak için kullanılır^25,26. Burada açıklanan protokoller, genetik olarak değiştirilmiş fare modellerinden izole edilen mezenterik arterlerde vasküler yanıt hızını değerlendirmek ve PVAT tarafından modülasyon üzerine özel bir odaklama ile tel miyografi kullanacak.

Protokol

Aşağıdaki çalışmada kullanılan tüm hayvanlar, Hong Kong Üniversitesi Tıp Fakültesi laboratuar hayvan ünitesi tarafından sağlandı. Öğretim ve araştırma için Laboratuvar hayvanlarının kullanımı bölümlendirme Komitesi 'nden etik onay alındı (CULATR, No.: 4085-16).

1. preparatlar

1. İlaçların hazırlanması
   1. İlaçları aldıktan hemen sonra malzeme güvenliği veri sayfası 'nda (MSDS) belirtildiği gibi uygun şekilde saklayın. İlaçlar, yüksek konsantrasyon stok çözümleri ve daha sonra-20 °c ' de depolama için kısım olarak solvent içinde toz formunda çözülür.
      Not: çoğu ilaç, stok çözümlerini hazırlamak için damıtılmış suda çözülür; Isıtma veya sonication bazı ilaçlar için gerekli olabilir. İlaçlar tamamen suda çözünmez ise, 1 M NaOH bir damla eklenebilir, temel ilaçlar için 1 M HCl bir damla kullanılabilir. Hidrofobik ilaçlar dimetilsulfoxid (DMSO) veya mutlak etanol içinde çözülebilir. İkinci durumlarda, son banyo konsantrasyonu (M) bilinmelidir ve çözücüler etkilerini dışarı kural için uygun kontroller yapılmalıdır.
   2. Deney öncesinde, ilaç plakaya (malzeme tablosu) Krebs-Ringer bikarbonat çözeltisi (Krebs) 115 mm NaCl, 4,6 mm KCL, 2,5 mm CAcl₂, 1,17 mm MgSO₄, 1,17 mm KH₂Po₄, 25 mm NaHCO 3, içeren çözülür 11,1 mm D-glikoz ve 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
   3. Birikimli konsantrasyon-reaksiyon eğrileri için, farklı ilaçların stoklarını ve çalışma çözümlerini seri dilmeler (Tablo 1) ile hazırlayın.
2. Cihazı kurma
   1. Her gün myograph sistemi kullanmadan önce veya sistem her taşındığında, tüm kanallar için kuvvet dönüştürücünüzü kalibre edin.
      Not: ayrıntılı kalibrasyon prosedürü modele bağlı olarak değişir. Genel olarak, çenelere iki gram ağırlık uygulanır ve karşılık gelen kuvvet 9,81 ± 0,1 mN olmalıdır. Okuma 0,1 mN 'den fazla değilse, dönüştürücü yeniden kalibre edilmelidir. Mevcut protokolde kullanılan sistem için ( malzeme tablosunabakın) kalibrasyon sırasında kuvvet dönüştürücünün çalışma değerleri 3000 ile 3500 arasında olmalıdır. Dönüştürücü değeri daha yüksek veya daha düşük ise, kuvvet dönüştürücüyle değiştirilmesi gerekir.
   2. Her odanın montaj destekini ayarlayın ve hizalayın. Myograph odasının sürekli ve tekrarlanan kullanımı, çenelerin düzgün bir şekilde hizalanmasını sağlamak için deneylerden önce zaman zaman ayarlanması gereken montaj desteğinin bazı yanlış hizalamasına neden olabilir.
      Not: kuvvet dönüştürücleri çok hassas ve kırılgan olduğu için montaj desteklerini ayarlarken özel dikkat gereklidir.
   3. Isıtıcılar ve gaz açma (95% O₂ ve 5% Co₂) en az 30 dakika önce, odalar ve tamponlar 37 ± 0,1 °c ' ye kadar ısınmasına izin vermek ve gaz karışımı ile dengelenmiş.
      1. Isıtıcı doğruluğunu sağlamak için termometre üzerindeki sıcaklığı kontrol edin. Sıcaklık soğutma veya ısınma denemeleri çalıştırmak için değiştirilebilir. Sıcaklık set olarak doğru değilse, gerekli sıcaklığa ulaşmak için ayarları artırmak veya azaltmak için makinenin ofset fonksiyonunu uygulayın.
   4. Denemenin sonunda, tüm odaları temizleyin ve ısıtıcı yanı sıra gaz kurulum için çalışan kapatın.
      1. Odanın tüm sıvı sistemden sucked önce gaz kapalı açmayın, aksi takdirde asit/distile su kusturmak ve sonraki kullanım sırasında organ-odasına ulaşmak.
      2. Tel miyografi odaları temizlemek için, en etkili yolu Seyreltilmiş Asetik asit çözeltisi kullanarak asit yıkama gerçekleştirmesidir. Bir pamuk çubukla kenarı ve odalarının içini temizleyin.
      3. Yıkandıktan sonra, odaları damıtılmış suyla iyice durulayın. Kuru tuzu kaldırmak için odanın dışını ıslak bir bezle silin. Deneyde hidrofobik ilaçlar kullanıldığında etanol de kullanılabilir.
      4. Yıkama prosedürünü aşağıdaki gibi bir örnektir. % 8 asetik asit çözeltisi ile odaları doldurun ve 2 dakika boyunca kuluçat yapın. çelik Oda yüzeyini mekanik olarak temizlemek için pamuklu uçlu bir aplikatör kullanın. Myograph alüminyum parçası ile herhangi bir temas kaçının.
      5. Asetik asit aspirate ve myograph odası yıkayın ve distile su ile birkaç kez destekler ve emici kağıt veya pamuk ucu apnitatörler kullanarak yüzeyleri kuru.
3. Mezenterik arter Yüzüklerin diseksiyonu
   Not: mevcut çalışma için kullanılan hayvanlar kontrol olarak erkek Adipo-SıRT1 fareler ve vahşi tip Littermates beslenen yüksek yağlı diyet vardı. Her hayvan, deneylerin zamanında yaklaşık 45 g tartılır.
   1. Pentobarbital sodyum intraperitoneal enjeksiyon tarafından fare ötenize (50 mg/kg).
   2. Cerrahi makas ve forseps ile, karın içeriğini ortaya çıkarmak için orta hat laparotomi gerçekleştirin.
   3. Mesenterik Arcade 'i silikon kaplı bir petri tabağı içine toplayın.
   4. Yayılmak ve mesenterik ve bağ dokusu meshwork dallanma açığa Petri çanak mezenterik ağ aşağı pin.
   5. Mikroskop altında (10X), ve ince-makas ve forseps ile, dikkatlice çevreleyen bağ dokularını çıkarın. Adventisyal tabakaya zarar vermemek. Alternatif olarak, çevre adipoz doku deney için kan damarının etrafında muhafaza edilebilir (gerekirse).
   6. İnce makas ve forseps kullanarak, buz soğuk Krebs tampon mesenterik arterlerin ikincil dalları dışarı.
      Not: her araştırmacı kendi diseksiyon kiti, dizeleri ve stirrups kendi kümesi olmalıdır. Bu araçlar düzgün tutulmalıdır ve bazı ilaçlar kadar yıkamak zor ve kalıntı onlara sopa olabilir gibi deneme sonra her zaman temizlenir.
      1. PVAT dahil olmak üzere çevreleyen bağ dokularını ayırarak soğuk Krebs tampon kan damarlarını tutun. Kan damarının işlenmesi sırasında, Endotelyuma gereksiz hasarı önlemek için nazik olun.
      2. Deney PVAT çalışma içeriyorsa, kan damarının etrafında 2 mm çap PVAT küre 1,5 tutun. Alternatif olarak, deney için her odaya aynı miktarlarda yağ dokusu eklenebilir.
   7. Isteğe bağlı Endotelyum, yanıtların endotel-bağımlılığı değerlendirmek için bir kontrol olarak disseke kan damarından çıkarın. Mezenterik arterlerde, yumuşak bir tel karıştırılmış veya bir saç üzerine yuvarlayarak endotelyum çıkarın.
   8. Küçük halkalar (~ 2 mm uzunluğunda) içine yukarıda hazırlanan kan damarını kes ve bir plastik çanak havalandırmalı dolu koymak (95% O₂ ve 5% Co₂) Krebs tampon sonraki montaj için bir tel myograph odaları²⁷.
   9. Gemi halkaları mikroskop altına yerleştirilen bir miyografi odasına aktarın. Yüzükler, üst ve alt stirrups paraleliyle eşit şekilde yerleştirilmelidir. Bağlama teli (40 μm), ilaçlar dizelere bağlanabilir gibi yeni hazırlanmış olmalıdır.
   10. Diş kan damar halkası uygun bir uzunlukta (2 cm) Tel ve konumu düzeltmek için vidalama ile montaj odasının bir çene güvenli.
   11. İkinci bir kabloyu halka ve karşı çeneye çapa geçirin.
   12. Halkaları ile dişli ve oda çeneleri için güvenli, myograph kurulum üzerine oda Mount ve saat yönünde mikrometre vida Turn bağlı kullanıcı arayüzü üzerinde kuvvet okuma kadar birbirlerine yakın kabloları taşımak için monte sıfır veya sadece Aşağıda.
       Not: üst çeneye bağlı tel, gerilimin dedektöre tam olarak aktarılabilir olmasını sağlamak için minimal uzunlukta olmalıdır.
   13. Ayarlanabilir mikrometre kullanarak ilk kuvvet uygulamasından en az 30 dakika önce 37 °C ' de preparatları dengelentir.
   14. 115 mm yüksek potasyum (NaCl bir molar temelinde KCL yerine) doku canlılığı değerlendirmek 4,6 mm NaCl, 115 mm KCL, 2,5 mm CAcl₂, 1,17 mm MgSO₄, 1,17 mm KH₂Po₄, 25 mm NaHCO₃ içeren Krebs ve 11,1 mM D-glikoz pH 7,4.
       Not: Izolasyonlu gemiler, kontril kuvvet dönüştürücü ve myograph sistemin veri kayıt yazılımı temel üzerinde saptırma olarak kaydedilmiş ise uygun kabul edilir daha fazla 40% onların istirahat tonu, bir sözleşmeli ajan yanıt olarak. Arter uygun sözleşme yoksa, o zaman ya optimum bazal gerginlik/duvar basıncı düzgün ayarlanmamış veya arter yalıtım veya geminin montajı sırasında zarar görmüş olabilir.
   15. Isteğe bağlı Endotelyal hücrelerin bütünlüğünü değerlendirmek için damar kasılma teşvik etmek için fenylephrine uygulayarak 50% KCl ilk yanıt (olarak veri kayıt yazılımı kuvvet dönüştürücü tarafından kaydedilmiş), ardından ekleyerek 1 μM asetilkolin.
       Not: iyi bir kan damarının hazırlanması tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Bir hazırlık deney için ya da endotel bütünlük testi tatmin edici değilse ya da KCl yanıt vermiyor, bu endotel fonksiyon veya vasküler pürüzsüz Kas kontrazlığı, sırasıyla, tatmin edici olmadığını belirten kullanılmamalıdır. Bu durumda, hazırlık aynı kan damar veya yeni bir kan damarından yeni bir yüzük ile değiştirilmesi gerekir.

2. normalleştirme optimum ilk gerginlik belirlemek için

Not: normalleştirme prosedürü, kan damarının uygun bir istirahat transmural basıncı (100 mmHg veya 13,3 kPa mezenterik arterlerde) deneyimleri hangi arterlerin optimum iç çapı (ıC) belirlenmesi sağlar ve maksimal aktif üretir vasoaktif ajanlar yanıt olarak kuvvetler.

1. Bilgisayarı açıp veri kayıt yazılımını açın ( malzeme tablosunabakın).
2. Denemeyi, özgün ayar dosyasının üzerine yazmamak için yeni bir adla "LabChart veri dosyası" olarak kaydedin.
3. Normalleştirme ayarları penceresini açın ve k faktörü 1 olarak ayarlayın. Mercek kalibrasyonu için varsayılan değerleri kabul edin (0,3, damar uzunluğu bilinmiyor ise, veya gemi uzunluğu biliniyorsa 1), hedef basınç (13,3), Çevrimiçi ortalama süresi (2) ve gecikme süresi (60). Ayarları kaydetmek için Tamam 'ı tıklatın.
4. İlgi kanalları seçin ve tel çapı (40 μm), doku uç noktaları (a1:0; a2: ölçülen doku uzunluğu), normalleştirme penceresinde ilk mikrometre okuma giriş.
5. Kan damarına ilk pasif streç uygulayarak normalleştirme prosedürü başlatın (mikrometre vida saat yönünün tersine çevirin).
6. Geminin (3 dak) stabilizasyonu ve yeni mikrometre okuma normalleştirme penceresinde giriş bekleyin. Duvar gerilimi otomatik olarak hesaplanır ve grafik üzerinde bir nokta olarak gösterilir.
   Not: pasif streç sırasında kullanılan mikrometre "adımlar" aynı olması gerekmez. İlk birkaç uzanan her biri 20 μm olabilir. Genişler İzobar hattına yaklaştıkça, adımlar 10 μm, 5 μm, 2 μm veya daha küçük olarak azaltılabilir. Mikrometre ayarlarını ayarlarken ana grafik penceresini açın — bir uzunluk/gerginlik grafikte (önceden belirlenmiş bir değere karşılık gelen basınç noktalarını gösterir) ısobar çizgisini aşan büyük bir başak görünüyorsa, gerilimi azaltın.
7. Her pasif streç sonra, 115 mM KCl içeren ISO-ozostik yüksek potasyum Krebs ile kontrol Krebs değiştirin. Kasılma bir plato ulaştığında (yaklaşık 3 dakika), aktif kuvvet (F) potasyum aktive kuvvet her streç pasif kuvvet çıkararak kaydedin. Duvar gerginliğinin yanı sıra iç çevre (ıC) değerlerini hesaplayın.
   1. Temelin üstündeki saptırma olarak etkin gerilimi ölçün. Aktif gerginlik (T) F (mN) = T (mN/mm) x 2 x damar uzunluğu (mm) denklemi temel alınarak hesaplanır. İç çevre (ıC) değerleri mikrometre verilerinden hesaplanır (ıC = 205,6 μm + 2 x "GAP").
8. Taze Krebs ile değiştirerek yüksek potasyum durumu çıkarın. 5 dakika üzerinden üç kez yıkama tekrarlayın.
9. Etkin gerginlik azaltılana kadar (Şekil 2) 2,8 için 2,5 adımları yineleyin (pasif genişlikte diğer dönüşler içinde aktif kasılma tarafından izlenen inducing tarafından).
10. Alternatif uzanımlar birden fazla tur sonra, pasif uzunluk/gerginlik eğrileri IC100 değeri vermek, bir transmural basıncında geminin iç çevresi 100 mmHg, İzobar hattı ile geçiş noktası olarak.
    Not: pasif uzanır sırasında her mikrometre değeri el ile yazılım normalleştirme modülündekullanılmaya başlandı. Program, ısobar hattı (Şekil 2, sağ paneller) ile geçiş noktası olarak IC100 değerini verir pasif uzunluk/gerilim eğrisi oluşturmak için karşılık gelen kuvvet ölçümü otomatik olarak kaydeder. Yakın son nokta İzobar hattı için ama daha iyi normalleştirme üzerinde damarlara zarar vermeden. İzobar hattının çok üstünde bir nokta, deneme sırasında güvenilir olmayan sonuçlara neden olan bağlı gemisine fiziksel olarak zarar verebilir.
11. Icon değerlerini belirlemek ve sonraki miyografi deneylerinde bu tür kan damarında kullanılacak olan IC+/IC100 oranı olarak normalleştirme k faktörünü hesaplamak için aktif uzunluk/gerilim eğrileri oluşturun.
    Not: etkin uzunluk/gerilim eğrileri, x eksenindeki mikrometre verilerinden hesaplanan ŞA değerlerini ve y eksenindeki etkin gerginlikleri çizerek oluşturulur. IC2, zirve Plato bölgesi içinde yatan değerdir ( şekil iki'de kırmızı izler, sağ paneller). Etkin uzunluk/gerginlik eğrilerini çizdikten ve Icon belirlemekten sonra, normalleştirme k faktörü IC+/IC100 oranı olarak hesaplanır. Normalleştirme k faktörüne dayanarak, ICS olarak belirtilen temel için en uygun IC, pasif uzunluk/gerilim eğrisi üzerinde görünecektir. Bu ıC için mikrometre ayarı eğri altında görünür ve sonraki myografi deneyleri için mikropozisyoner ayarlamak için kullanılmalıdır. Başlangıç gerilimi (T) hedef basınca eşittir (Pi) x ıC/2π ve gemisine uygulanan optimum kuvvet (F) T x 2 x damar uzunluğuna eşittir.
12. Yüksek potasyum Krebs iyice yıkayın ve başka bir 30 ila 45 dk için preparatları doğrultma. bazal gerilimleri "sıfır" olarak sıfırlayın, böylece sonraki deney sırasında sadece aktif kontril tepkiler kaydedilecektir.

3. fenylephrine kaynaklı kasılmalar

Not: vazokonstriktif tepkiler inducing için seçilebilir Ilaçlar özel adrenokeptor agonist norepinefrin içerir, seçici α-1 adrenokeptor agonist fenitlephrine, peptid hormonu Anjiyotensin II, ve monoamin nörotransmitter 5-hidroxytryptamine. Fenylephrine muayene için mevcut protokolde kullanılır (malzeme tablosu).

1. Hazırlama ve montaj eşlenmiş arter halkaları bölümünde açıklandığı gibi 1,3, bir PVAT bozulmamış ve diğer PVAT ile kaldırıldı, deney için her arter bitişik bölümlerden.
2. Normalleştirme (Bölüm 2 ' de açıklanan) sonrası, Krebs içeren odaya 115 mM KCl solüsyonu ekleyerek yüksek potasyum Krebs tampon ile arter segmentleri ön-sözleşme.
3. Plato (3 dk) için kasılma için bekleyin, yüksek potasyum yıkayın ve taze havalandırılmış Krebs tampon ile değiştirin. 5 dakika üzerinde üç kez yıkama tekrarlayın.
4. KCL stimülasyon ve yıkama üç kez tekrarlayın ve KCL stimülasyon nedeniyle gerginlik temel gerginlik çıkararak KCl için maksimal kontril yanıt/gerginlik kaydedin.
5. Son kasılma ve yıkama sonra, sıcak, havalandırılmış Krebs tampon ile Oda dolum ve arter sonraki görevi gerçekleştirmeden önce yaklaşık 30 dakika kurtarmak için izin.
6. Her bir oda için, kümülatif preparatların izometrik gerginliğinin konsantrasyona bağlı artmasını teşvik etmek için, toplam miktarlarda fenikil (10-10-10-⁴ M arasında yarım günlük artışlarla) ekleyin.
7. Odasına agonist düşük konsantrasyon ekleyerek başlayın. İstikrarlı bir kasılma için yeterli zaman izin verdikten sonra (3 – 5 dk), bir sonraki konsantrasyon ekleyin. Phenylephrine konsantrasyonları artan ile adımları tekrarlayın.
8. Agonist son doz ekledikten sonra (fenillephrine), iyice ilaç yıkayın ve taze Krebs tampon ile Oda doldurma. Konsantrasyona bağımlı yanıtları KCl kaynaklı maksimal kasılmalar artan yüzdeleri olarak çizin (Şekil 3).
9. Isteğe bağlı Hayır katkısı değerlendirmek için, hiçbir sentaz inhibitörü ile preparatları inkük, L-adı (10^-4 M), 30 dakika önce fenilleahatin eklenmesi. L-NAME, mezenterik arterlerin sessiz preparatlarında fenillefrik kaynaklı kasılmaları geliştirir (Şekil 4).
   Not: inhibitörler veya antagonistler, genellikle 30 – 45 dk (herhangi bir deney kümesi için tutarlı), equilibration elde etmek için yeterli zamana sahip olmalıdır.
10. Ardışık olarak ikinci bir konsantrasyon-yanıt eğrisi gerçekleştirmek için, tüm önceki agonistleri kaldırmak için odası tamamen ve art arda yıkayın, tonda başka bir değişiklik görülene kadar.
    Not: paralel deney agonist için aynı kan damarından elde edilen en az iki yüzük ortaya çıkarır, bir kontrol koşulları altında ve bir inhibitör (s) varlığında; Her halka konsantrasyon-yanıt eğrisi yalnızca bir kez gerçekleştirilir. Bu ilaç eylem ve kan damar hassasiyeti için daha iyi bir kontrol sağlar çünkü, paralel deneyler gerçekleştirmek için tercih edilir. Seri deneyler tek bir yüzük bir agonist bir konsantrasyon-yanıt eğrisi elde; , deneysel koşulları değiştirme (örneğin, bir inhibitör ekleme), ve daha sonra aynı yüzük üzerinde konsantrasyon yanıt eğrisi tekrar. Bu durumda, zaman kontrolleri ilaç tepkiler zaman içinde doku değişiklikleri nedeniyle olmadığını göstermek için gereklidir. Bir konsantrasyon-yanıt deneyi maruz kaldıktan sonra doku tam olarak aynı durumda olduğundan emin olabilir asla. Yeterli zaman (en az 30 – 60 dk) damar segmentlerinin dinlenme (bazal) gerilimine geri dönmesini sağlamak için verilmelidir, ancak bazı durumlarda, bu reseptörlerden yüksek yakınlık agonist ayrışma sonra anında gerçekleşmeyebilir. Buna ek olarak, yüksek potasyum Krebs birikme konsantrasyon-reaksiyon eğrileri arasında duyarsızlaştırma azaltmak için uygulanabilir²⁸. Çoğu antagonistleri tamamen yıkanamaz, böylece deneme geri kalanı için eklemeyi devam unutmayın.

4. endotelyum-bağımlı relaxations/kasılmalar

1. Ön-sözleşme taze monte arteriyel segment (olarak açıklandığı gibi adımlar 3,2 3,5). Yine, KCL stimülasyon nedeniyle gerginlik temel gerginlik çıkararak KCl için maksimum kontril yanıt/gerginlik kaydedin.
2. Isteğe bağlı U46619 eklenmesini yapmadan önce 30 dakika boyunca No sentaz inhibitörü, L-Name (10^-4 M) ile preparatları inkük.
3. U46619 önceden hesaplanan konsantrasyonları odasına ekleyin ve arter segmentlerinde istikrarlı, sürekli bir kasılma sağlar.
   Not: Vazodilatuar tepkiler mezenterik arterlerde önceden sözleşmeli indüklenen yaklaşık 80% 115 mM KCl için maksimal tepkiler. farklı agonistler kendi özel reseptörlerinin aktivasyonu ile daralma ikna etmek için kullanılabilir. Burada, PVAT içermeyen veya olmayan kan damar segmentleri U46619 (1 – 3 x 10^-8 M; Malzeme tablosu), bir tromboxan a2 reseptör agonist, istikrarlı ve sürekli pürüzsüz kas kasılmaları teşvik etmek.
4. Organ odasına asetilkolin (10^- 10^-10-4 M) toplu konsantrasyonları ekleyin. Arter segmentlerinin konsantrasyona bağlı vazodilatuar tepkiler U46619 kaynaklı kontril tepkiler yüzdesi olarak sunulmaktadır (Şekil 5).
   Not: deney çoğu Için, rahatlatıcı agonist bir sonraki konsantrasyon hemen bir plato gerginlik rebound önlemek için gözlenen zaman eklenmesi gerekir. Arter segmentlerinin konsantrasyona bağlı vazodilatuar tepkiler, arter segmentleri arasındaki innervasyon ve çaplarda küçük farklılıklar için ayarlamak için U46619 kaynaklı kontril tepkiler yüzdesi olarak normalleştirilmiş (Şekil 5). Altı veya daha fazla deneyden oluşan bir grup istatistiksel olarak analiz edildiğinde, aynı kan damarından elde edilen tek halkalar arasında yanıt verme açısından küçük farklılıklar minimal hale gelir. Bireysel dokuların kendi maksimal kasılmaları yüzdesi olarak yanıtlar ifade ederken, karşılaştırmak için farklı hayvanlardan aynı türde dokuların yanıtlarını karşılaştırmak için eşleştirilmiş bir analiz (örneğin, eşleştirilmiş öğrenci t-testi) kullanmak için uygun önce ve bir müdahale sonrası tek bir doku tepkiler. PVAT 'ın etkilerini analiz ederken, iki yönlü ANOVA, birden fazla karşılaştırma testinin ardından kullanılır.
5. Rahatlatıcı agonist son doz ekledikten sonra, her oda ve taze Krebs tampon ile dolum ilaç çıkarın. Krebs tampon ile iyice yıkayın Oda ve arteri herhangi bir ek deneyler yapmadan önce en az 45 dk stabilize izin.

Sonuçlar

Normalleştirme faktörü k elde etmek için uzunluk/gerilim ilişkileri incelenmesi

Bir damar segmentine uygulanan streç miktarı, aktin-miyosin etkileşiminin kapsamını etkiler ve dolayısıyla geliştirilen maksimal aktif kuvvet. Böylece, her tür kan damarında, uygun miyografi çalışmaları için maksimal aktif kuvvet için gereken streç miktarını belirlemek gereklidir. Burada, fare modell...

Tartışmalar

Endotel hücrelerinden ayrı olarak, PVAT 'dan elde edilen sinyaller, pürüzsüz kas tonu reaktivite³⁰' unun düzenlenmesi konusunda önemli bir rol oynamaktadır. Sağlıklı pvat, obezite ve metabolik sendrom^31,32gibi patolojik koşullarda kaybedilen arterlerde Anti-kontrifli bir etkiye sahip olmayan ve anti-inflamatuar adiponektin bültenleri. Hastalık durumları, pvat endotel disfonksiyon ve diğer kardiyovasküler anomalilerin geli?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625	Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester)	Sigma-Aldrich	N5751	Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126	Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α)	Enzo	BML-PG023-0001	Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myograph	Danish MyoTechnology (DMT)	620M
PowerLab 4/26	ADInstruments	ML848
Labchart7	ADInstruments	-
Adipo-SIRT1 wild type mice	Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong	CULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishes	Danish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wires	Danish MyoTechnology (DMT)	300331
Surgical tools