Kas Biyopsilerinde İmmünlabelling Miyofiber Dejenerasyon

Özet

Burada açıklanan kas kriyokesitlerinde nekrotik miyofiberlerin doğrudan immünolabelling için bir protokoldür. Nekrotik hücreler immünglobulin G (IgG) dahil olmak üzere serum proteinlerine geçirilebilir. Miyofiberler tarafından IgG alımının ortaya çıkması, kas durumuna bakılmaksızın nekroz geçiren miyoliflerin tanımlanmasını ve ölçülmesine olanak sağlar.

Özet

Kas liflerinin nekrozu (mionekrozisi) kas distrofileri de dahil olmak üzere çeşitli kas hastalıklarının patogenezinde merkezi bir rol oynar. Kas dejenerasyonu hafifletmek için kas distrofi patogenezi nedenleri ele terapötik seçenekler bekleniyor. Bu nedenle kas biyopsilerinde hücre ölümünün derecesini hesaplamak ve hesaplamak için bir yöntem gereklidir. Yerinde miyofiber dejenerasyongözlemlemek için geleneksel yöntemler ya kötü kantitatif ya da hayati boyaların enjeksiyonu güveniyor. Bu makalede, immünofloresan protokolü, miyolifler tarafından immünglobulin G (IgG) alımını hedefleyerek nekrotik miyoliflerin lekelerinin nekrotik miyokerruz lar olduğu tanımlanmıştır. IgG alım yöntemi nekrotik ölümü karakterize eden hücre özelliklerine dayanır, dahil 1) hasara bağlı moleküler desenlerin salınımı ile plazma membran bütünlüğünün kaybı ve 2) plazmatik proteinlerin alımı. Murine kesitlerinde, miyoliflerin, hücre dışı matriks proteinlerinin ve fare IgG'nin birlikte immünetiketlemesi miyoliflerin nekrotik kaderle temiz ve anlaşılır bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu basit yöntem kantitatif analiz için uygundur ve insan örnekleri de dahil olmak üzere tüm türler için geçerlidir ve hayati boya enjeksiyonu gerektirmez. IgG alımı ile nekrotik miyofiberlerin boyanması da diğer co-immünlabelling ile eşleşebilir.

Giriş

Striated iskelet kası esas olarak karakteristik gönüllü kontraktil fonksiyon sorumludur kas lifleri (miyofiberler), oluşur. Bu hücreler daralma sırasında meydana gelen mekanik stresi destekleyen çok çekirdekli, post-mitotik yapılardır. Miyofiber membranın yapısal stabilitesi (sarkolemma) ve hücre dışı matriks doku homeostazisi için çok önemlidir. Uydu hücreleri olgun iskelet kası ana kas atası popülasyonunu oluşturur ve sağlıklı kaslarda kin halinde bulunur. Miyofiber ölümden sonra, kas rejenerasyonuydu hücre aktivasyonu içeren bir miyojenik programı takip uydu hücreleri tarafından desteklenir, çoğalma, farklılaşma, ve füzyon sonuçta yeni multinükleli miyofonlar oluşturmak için.

Miyofik ölümü birden fazla kas koşullarında oluşabilir, mekanik travma da dahil olmak üzere, iskemi-reperfüzyon yaralanmaları, veya kas distrofiler, ve ölü hücrelerin nekrotik morfolojisi ile ilişkili^1,2. Nekrotik ölüm plazma zarının hızlı geçirgenliği ve hücre dışı kompartmanda hücre içeriğinin serbest bırakılması ile karakterizedir³. Uygun bir hücre sinyali (yani kazara nekroz) içermeyen düzensiz bir süreç ya da düzenlenmiş bir hücre içi yol (yani, düzenlenmiş nekroz) ile sonuçlanabilir. Miyofiberlerde hem düzenlenmiş⁴ hem de düzensiz⁵ proses nekrozuna yol açabilir. Mionekrozun tipik bir sonucu, hasarla ilişkili molekül desenlerinin serbest bırakılmasıdır, güçlü bir inflamatuar^yanıtıaktive 6. Makrofajların varlığı yaklaşık 48 h ve 72 h yaralanma dan sonra gözlenmektedir⁷. Nekrotik enkaz temizliği ndeki rollerinin yanı sıra, kas rejenerasyonu^8,9da önemlidir.

Kas distrofileri (MDs) genellikle sarkolemma yapısında bir kusur sonucu patolojiler heterojen bir gruptur. Duchenne musküler distrofi (DMD)^dünyaçapında her 3.500 erkek doğumdan yaklaşık 1'ini etkileyen x bağlantılı bir hastalıktır ve sarkolemmada distrofin ekspresyonunun olmamasından kaynaklanır. DMD erkek çocuklarda kas dokusunun kronik dejenerasyonu aşırı kas güçsüzlüğü ve erken mortaliteye yol açar. Nekrotik ölüm sonucu inflamasyon sitotoksisite artırır, ve kas fibrozis ve kas fonksiyonu kaybı teşvik^11,12. Gen tedavisi gibi kas dejeneratif bozukluklarının köklerini hedefleyen klinik çalışmalarda şu anda tedavilerin mionekroziyi hafifletmesi beklenmektedir. Bu nedenle kas dejenerasyonu doğru bir şekilde ölçmek için basit tekniklere ihtiyaç vardır.

Çeşitli yöntemler rutin in vivo miyofiber kaybını izlemek için kullanılır. Kandaki kreatin kizazın (CK) enzimatik aktivitesinin ölçülmesi kas ve kalp dokularında devam eden nekrozun güvenilir bir şekilde ölçülmesine olanak sağlar. Yerinde, hematoksilin ve eozin (H & E) boyama şu anda dejenerasyon-rejenerasyon remodelling değerlendirmek için tanı kullanılan en popüler yöntemdir. Ancak, ölü hücrelerin H & E etiketleme moleküler temeli belirsizliğini koruyor. Ayrıca, H & E boyama miyofiber ölüm düşündüren renk modifikasyonları nispeten ince ve güvenilir ve tekrarlanabilir nicelleştirme kolaylaştırmak değildir. Terminal deoksinükleotidyl transferaz dUTP nick uç etiketleme (TUNEL), kusurlu etiket nekrotik ölüm³gibi DNA parçalanması ortaya çıkaran yöntemler. Onlar da kötü miyofibers gibi senytial hücrelerin ölümünü izlemek için adapte edilmiştir. Evan'ın mavi boya (EBD) gibi hayati boyaların enjeksiyonu, sarkolemmanın bütünlüğünü kaybetmiş miyolifleri değerlendirmek için yararlı bir alternatiftir, ancak bazı deneysel protokollerde mutlaka uygun değildir. Örneğin, kan örneklerinde EBD varlığı CK ölçümleri, bir kolorimetrik tahsin sonuçlarını etkileyebilir. Ayrıca, EBD hücre içi alımı co-immunolabelling zorlu hale getirir. Bu nedenle, nekroz geçiren miyofiberlerin doğrudan etiketlenmesine olanak tanıyan alternatif bir yöntem ilgi çekicidir.

Hayati boyaların etki mekanizması nekrotik miyofiberlerde plazma membran bütünlüğünün kaybına ve enjekte edilen boyanın pasif alımına dayanır. Benzer şekilde, nekrotik miyofiberler albümin gibi kan proteinlerini alımı, hangi EBD güçlü bir yakınlık vardır^13,14, immünglobulin G (IgG), ve IgM¹⁵. Miyolifler içinde kan proteinlerinin anormal varlığı bu nedenle yerinde mionekroz için uygun belirteçleri temsil eder. Bu proteinlerin boyanması hayati boyaların kullanımı için bir alternatif olabilir.

IgG alımını yerinde mionekrozun belirteci olarak kullanarak, bu protokol mdx distrofin eksikliği olan farelerin tibialis anterior (TA) kas dejenerasyonu değerlendirmek için kullanılır. Bu yöntem alternatif teknikler üzerinde önemli avantajlar sunar: 1) çoğaltılabilir ve yürütülmesi basit; 2) bu kas toplama öncesinde herhangi bir hayvan tedavisi gerektirmez, hayati boyalar dolaşan enjeksiyon gibi, ve 3) herhangi bir konvansiyonel immünetiketleme olarak, bu co-etiketleme ile uyumludur.

Protokol

Deneyler Fransız ve Avrupa Topluluğu mevzuatına (lisans numarası 11-00010) uygun olarak yapılmıştır.

1. Tragacanth sakız hazırlama

1. Bir cam kabında, 100 mL deiyonize suda 6 g tragacanth tozunu çözün. Folyo ile kaplayın ve en az 3 saat bekletin.
2. Tragacanth karışımını bir gece leme 60 °C'de bir su banyosunda veya fırında bırakın. Kurumasını önlemek için kabı dikkatlice kapatın. Aliquoting önce en az bir kez karıştırın.
3. Aliquot ve 2 hafta ya kadar 4 °C'de saklayın.

2. Kas toplama

NOT: Bu deney için servikal çıkığı ile 4 haftalık erkek mdx faresi kurban edildi. Bu prosedür anestezi gerektirmez ve yerel mevzuata uygun olarak insancıl bir öldürme yöntemidir.

1. Tibialis anterior (TA) kasının diseksiyonu
   1. Fare bacağını tıraş ettikten sonra fareyi sırtüstü yatırın ve ayakları iğnelerle bir mantar tahtasına sabitle. Hassas makas (veya neşter) ve forceps kullanarak, tibia ve TA tüm uzunluğu ortaya çıkarmak için diz ayak bacak deri sini çıkarın.
   2. Makas ile, tibia ve TA arasında bir kesi yapmak. Bu kemikTEN TA ayrılmasını kolaylaştıracak ve epimysium için kolay bir kavrama sağlar. Hassas forceps kullanarak, dikkatle TA yüzeyinden epimysium tabakası kaldırın.
      NOT: Bu adımdan itibaren, TA kurumaya daha duyarlı olabilir, bu kaçınılmalıdır.
   3. Ayak bileği bölgesinde, forceps ile diğer tendonları TA tendon izole. Yavaşça tibia ve çevresindeki kaslardan izole etmek için TA tendon çekin.
   4. TA göbek tamamen ayrıldığında, ta kas sadece proksimal kısmı diz bağlı böylece tendon tutun. Proksimal tendonu diz kemiğine mümkün olduğunca yakın bir şekilde hafifçe ayırın.
   5. Kas dondurma önce kurumasını önlemek için hafifçe tuzlu ile nemlendirilmiş bir gazlı bez TA yerleştirin.
2. Plastik veya politetrafloroetilen kabın içinde 70−100 mL isopentane'nin önceden soğutulması ve kısmen sıvı nitrojene batırılması. Kabın altındaki isopentane beyaz bir katı hale gelene kadar soğumasını bekleyin.
3. Dairesel bir mantar parçasına (20 mm x 11 mm x 8 mm) ~0,5 mL tragacanth sakız yerleştirin. Biyopsinin donma adımından sonra doğru bir şekilde tespit edilebilmeleri için mantarın diğer tarafını dikkatlice etiketleyebilirsiniz.
4. Ta'yı forceps ve distal tendonla sakızın içine gömün. Kasın uygun kesitleri sağlamak için, mantar yüzeyine dik ekseni ile kas tutun. Biyopsi sakızın içine tamamen gömülmemişse kriyokesitlerin kalitesi artacaktır. TA (tendon tarafı) en az yarısı sakız tarafından ortaya çıkarmak için izin verin.
5. Hızlı bir şekilde dondurulmamış içine gömülü kas ile mantar daldırma, soğuk isopentane tabaka. Mantar sıvı isopentane içinde yüzen olacağını unutmayın. Kas isopentane içine batırılmış olması gerektiğinden örnek baş aşağı tutun. Tam donma sağlamak için yaklaşık 2 dakika boyunca isopentane örnekleri bırakın.
   NOT: Bu aşamadan itibaren, TA kriyoksiyon kadar dondurulmuş kalmalıdır. -80 °C'lik bir dondurucuda uzun süreli depolamadan önce kasları kuru buzda saklayın.

3. Kriyoding

1. Kriyostat sıcaklığını -25 °C olarak ayarlayın. Nesne sıcaklığını -20 °C civarında tutun. En uygun kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği kullanarak kriyostattaki nesneyi düzeltin. Kas göbeğine ulaşana kadar kas kırpın sonra 7−10 μm kesin.
   NOT: Nesne sıcaklığının stabilizasyonu en az 10 dakika gerektirir.
2. Oda sıcaklığında (RT) kriyokesit toplamak için kullanılan cam slaytları tutun. Her slaytta en az iki bölüm toplayın. Kas bölümleri otomatik olarak sıcak cam slayt temas sopa ve çözülme olacaktır. Slaydını çıkarın ve RT'de saklayın.
3. Havalandırılan bir ortamda rt'de en az 20 dk'lık bölümlerin kurumasını bekleyin.
4. Kriyokesitleri cam kaydıraklarda -80 °C'de kullanıma kadar saklayın.

4. İmmün etiketleme

1. Havalandırılan bir ortamda en az 15 dakika boyunca RT'de kaydırma lar çözülür.
2. Bir hidrofobik kalem ile bölümler alanı delineate. Hidrofobik bariyerin kurumasını bekleyin.
3. Nemli bir odada 10 dakika için% 2 paraformaldehit ile doku düzeltin.
4. Bölümleri her biri 5 dk için fosfat tamponlu salin (PBS) 2x ile yıkayın.
5. PBS'de %10 keçi serumu seyreltilmiş kas bölümlerini nemli bir odada RT'de 1 saat boyunca bloke edin.
6. %5 keçi serumunda seyreltilmiş birincil antikorlar ile nemli bir odada RT'de (veya geceleme 4 °C'de) 2 saat boyunca bölümleri kuluçkaya yatırın. Miyofiberlerde basit IgG alımı etiketleme için, fare pan-laminin tavşan antikorile sadece kuluçka bölümleri.
   NOT: Hücre dışı matriksin diğer antijenleri, miyofiberlerin çevresindeki ekstrasellüler matriksin net etiketlemisi sayıldıkları sürece hedeflenebilir. Antikorlar bir fare konakçısında yükseltilmediği sürece kas yenilenmesi, inflamasyon veya diğer parametreler için belirteçler birleştirilebilir. Analiz için kullanılan mikroskop ek bir floresan renk içermelidir.
7. Her biri 5 dakika boyunca PBS 3x ile bölümleri yıkayın.
8. Tavşan IgG H & L ve yeşil floresan keçi poliklonal sekonder antikor ile kırmızı floresan keçi poliklonal sekonder antikor ile bölümleri kuluçka ya da yeşil floresan keçi poliklonal sekonder antikor fare IgG H & L. İnkübate RT için 45 dk nemli bir odada.
9. Her biri 10 dakika boyunca PBS 3x ile yıkayın.
10. 100 ng/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) içeren floresan montaj ortamındaki bölümleri monte edin ve her slaytı bir kapak kaymaile kaplayın.
11. Görüntülemeden önce 4 °C'de bir gecede kurutulun.

Sonuçlar

Miyofiberler lamina içeren hücre dışı bir matrisle çevrilidir. Kırmızı boyama miyofiberlerin çevresini sınırlar ve kimliklerinin belirlenmesini sağlar. IgG yeşil olarak gösterilir. Çekirdekler DAPI ile boyanmış ve mikroskop altında mavi bulunur. Ancak, çekirdekleri burada beyaz olarak gösterilir (Şekil 1). Zayıf bir IgG immünoreaktivite ekstrasellüler bölmesi bekleniyor, hangi inflamasyon durumunda artabilir. Miyofiberler içinde ye?...

Tartışmalar

Miyofiber nekrozu normal kaslarda travmatik egzersizin yaygın bir sonucudur. Bu iyi yerel kas atalarının güçlü bir rejeneratif kapasitesi ile telafi edilir. Ancak, MDs gibi çeşitli kas koşullarında, uydu hücrelerinin rejeneratif kapasitesi kronik mionekroz isi ve aşırı fibrozis tarafından tehlikeye. Son bulgular kas liflerinin nekrozun düzenlenmiş bir formu olan nekroz ile ölebileceğini göstermektedir. Daha spesifik olarak, nekroz inhibisyonu DMD tedavisi için yeni bir tedavi stratejisi haline gelebi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Circular cork disks	Pyramid Innovation	R30001-E	Don't forget to clearly label the cork so that the the ID of the sample can be determined after freezing
Cryostat	Leica	CM3050 sn34	Muscle cryosectionning should be performed between -20 and -25°C. Thickness:7-10 micrometers.
Dakopen	Dako	S2002	A hydrophobic barrier around the muscle sections. It prevents the dispertion of medium during incubation
Forceps	FST	91117-10	/
Goat anti-Mouse IgG (H+L) antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFischer Scientific	A-11029	Dilution: 1/500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) antibody Alexa Fluor Plus 594	ThermoFischer Scientific	A32740	Dilution: 1/500
Goat serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	At the blocking step, use 10% dilution in PBS. For antibodies incubation, use 5% dilution in PBS
Isopentane	Sigma Aldrich	78-78-4	Freezing medium. Should be cooled down in a beaker placed in liquid nitrogen.
mdx mouse	Jackson Laboratory	C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J	Mdx mice are mutated for the dystrophin gene. From three weeks of age, muscles are characterized by chronic degeneration
Microscope	Zeiss	Imager.D1	/
OCT	Cellpath	KMA-0100-00A	Embedding matrix
PFA (Paraformaldehyde)	ThermoFischer Scientific	28908	Used for fixing cryosection (2% or 4% PFA can be used)
PBS	Eurobio	CS3PBS00-01	Dilution medium for immunolabeling
Precision scisors	FST	fst 14001-12 and fst 14001-14	Used for the muscle collection
Rabbit antibody to mouse pan-Laminin	Sigma Aldrich	L9393	Dilution: 1/1000
Tragacanth	Sigma Aldrich	G1128	Aliquots to keep at +4°C