Ultraviyole-C (UV-C) Hasarına Yanıt Olarak Birincil Fare Oküler Yüzey Hücrelerinde/Kök Hücrelerinde Oksidatif Hasarın Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, fare oküler yüzey hücrelerinden canlı birincil kültürlerde reaktif oksijen türlerinin (ROS), canlı hücrelerin ve ölü hücrelerin eşzamanlı olarak tespitini göstermektedir. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iyodür ve Hoechst boyama ros, ölü hücreleri ve canlı hücreleri değerlendirmek için kullanılır, sırasıyla, görüntüleme ve analiz izledi.

Özet

Oküler yüzey çeşitli çevresel faktörler nedeniyle düzenli aşınma ve yıpranmaya maruz kılmaktadır. UV-C radyasyonuna maruz kalmak iş sağlığı açısından tehlike oluşturur. Burada, fare oküler yüzeyinden UV-C radyasyonuna birincil kök hücrelerin maruz kalma gösteriş. Reaktif oksijen türleri (ROS) oluşumu oksidatif stres/hasar ın derecelerinin okunmasıdır. Deneysel bir in vitro ayarda, oksidatif stres nedeniyle oluşan ölü hücrelerin yüzdesini değerlendirmek de gereklidir. Bu yazıda, UV-C maruz kalan fare primer oküler yüzey kök hücrelerinin 2',,7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) boyama ve dcfda boyama floresan görüntüleridayalı bunların nicelliği gösterecektir. DCFDA boyama doğrudan ROS üretimine karşılık gelir. Ayrıca sırasıyla propidium iyodür (PI) ve Hoechst 3332 ile eşzamanlı boyama ve DCFDA (ROS pozitif) ve PI pozitif hücrelerin yüzdesi ile ölü ve canlı hücrelerin sayısallaştırılmasını gösteriyoruz.

Giriş

Göz yüzeyi (OS) fonksiyonel bir birim ağırlıklı olarak dış tabaka ve kornea glandüler epitel oluşan, lachrymal bezi, meibomian bezi, konjonktiva, göz kapağı marjları ve innervasyonları bir parçası bu transduce sinyalleri¹. Şeffaf kubbe şeklindeki kornea tabakası retinaüzerine ışık odaklanır. Bu avasküler doku epitel hücreleri, keratositler ve endotel hücreleri ve kollajen ve glikozaminoglikanlar 2 gibi hücresel bileşenler gibi hücresel bileşenlerden oluşur². Alan da besinlerin çoğunu kaynağı gözyaşları tarafından boşaltılır. İşletim sistemi anatomik konumu genellikle parlak ışık, mikroplar, toz parçacıkları ve kimyasallar gibi çeşitli sert bileşenlere maruz, dış çevre ile doğrudan temas olması için zorlar. Bu faktör işletim sistemi fiziksel yaralanmalara yatkındır ve çeşitli hastalıklara yatkın hale getirir.

Oksidatif stres reaktif oksijen türlerinin üretimi arasındaki dengesizlik nedeniyle kaynaklanır (ROS) ve endojen antioksidan savunma mekanizmaları³. ROS, moleküler oksijenden (O₂₎mitokondriyal oksidatif fosforilasyon⁴ile elde edilen reaktif moleküller ve serbest radikaller olarak sınıflandırılır. Eski grup hidrojen peroksit (H₂O_2),singlet oksijen (¹O₂) gibi radikal olmayan türlerden oluşur ve ikincisi süperoksit anyonlar (O₂^-), ve hidroksil radikalleri^(•OH) gibi türleri içerir. Bu moleküller normal hücresel süreçlerin yan ürünleridir ve rolleri sinyal transdüksiyonu, gen ekspresyonu ve konak^savunması5 gibi önemli fizyolojik fonksiyonlarda rollenmiştir. Ros gelişmiş bir üretim patojen invazyonu, ksizbiyotikler ve ultraviyole maruz kalma gibi faktörlere yanıt olarak üretildiği bilinmektedir 4^. ROS'un bu aşırı üretimi, nükleik asitler, proteinler ve^lipidler6 gibi moleküllerin zarar görmesine yol açan oksidatif strese yol açar.

Doğal güneş ışığı, UV radyasyonunun en baskın kaynağı, UV-A (400-320 nm), UV-B (320-290 nm) ve UV-C (290-200 nm)⁷oluşur. Dalga boyu ve spektral enerjiler arasında ters bir korelasyon bildirilmiştir. Doğal UV-C ışınları atmosfer tarafından emilir rağmen, cıva lambaları ve kaynak aletleri gibi yapay kaynaklar yayarlar ve bu nedenle, bir mesleki tehlike oluşturmaktadır. Gözlere maruz kalma belirtileri fotokeratit ve fotokeratokonjonktivit⁸içerir. ROS üretimi UV kaynaklı hücresel hasar inflicting önemli mekanizmalardan biridir^9. Mevcut çalışmada, UV-C'ye maruz kalan fare primer oküler yüzey hücrelerinde/kök hücrelerinde 2',7'-Diklorodihidrofloresesein diasetat (DCFDA) boyama yöntemi kullanılarak ROS saptanması gösterilmiştir. Yeşil floresan floresan mikroskopi ile yakalandı. Hücreler, canlı ve ölü hücreleri lekelemek için iki boya, Hoechst 33342 ve kırmızı propidium iyodür ile karşı lekeli idi.

Protokol

Deney İsviçre albino fare gözünden elde edilen primer göz hücreleri/kök hücreler üzerinde gerçekleştirildi. Bu deney için hayvanların göz hasat için kullanımı Kurumsal Hayvan Etik Komitesi, Yenepoya (Üniversite olarak kabul) (IEAC onay numarası, 6a.19.10.2016) tarafından onaylanmıştır.

1. Reaktiflerin hazırlıkları

NOT: Fare oküler yüzeyinden birincil hücrelerin/kök hücrelerin türemesi bu protokolün kapsamı dışındadır. Bu nedenle, UV-C maruziyet dozları, ROS, canlı ve ölü hücreleri ve bunların nicel değerlendirmek için reaktif hazırlık göstermek. Reaktiflerin ilgili hacimleri için tablo 1'e bakınız (nihai boyama çözeltisi elde etmek için eklenecek %10 fetal büyükbaş serum, DCFDA, Hoechst ve propidium iyodür stok çözeltileri).

1. DMSO'nun 5,13 mL'inde 25 mg DCFDA tozu eriterek 10 mM DCFDA'lık bir stok çözeltisi hazırlayın. Aliquot 250 μL her kehribar renkli 1,5 mL tüpler ve -20 °C'de saklayın.
2. 25 mg şişenin tüm içeriğini 2,5 mL deiyonize su içinde eriterek 10 mg/mL (16.23 mM çözelti) Hoechst 33342'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Kehribar renkli mikrosantrifüj tüplerde 100 μL'lik aliquotlar yapın ve 2-6 °C'de 6 aya kadar saklayın. Uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın.
3. Deiyonize suda 1 mg/mL propidium iyodür, her biri 1,5 mL sarı renkli tüplerde aliquot 1 mL bir stok çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.

2. Hücre kaplaması ve UV-C radyasyon tedavisi

1. Kaplama önce, bizim laboratuvarda izole fare birincil oküler yüzey hücreleri ayrıştırMak (yayınlanmamış sonuçlar; bu hücreler kornea epitel bir karışımıdır, stromal hücreler ve keratositler) nazik bir hücre ayrıştırma ajanı kullanarak (Malzeme Tablosu).
2. Plaka 0.2 x 10⁶ fare primer oküler yüzey hücreleri 35 mm 0.2% bazal membran matris kaplı hücre kültürü yemekleri 2.5 mL tam medya. Bir gecede %5 CO₂ ve nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
   NOT: Fare oküler yüzeyinden birincil hücreleri gruplamak için komple ortam% 20 FBS içeren DMEM yüksek glikoz oluşur, 1% Pen-strep, 1% Glutamax, 1% esansiyel olmayan amino asit (NEAA), 1% sodyum piruvat, ve 0.1% β-mercaptoetanol.
3. Hücreleri çeşitli dozlarda UV-C'ye maruz bırakmadan önce, maksimum ortam hacmini atın ve sadece ince bir ortam tabakasının (~500°L) hücrelerle temas halinde kalmasını bekleyin, sadece onları kapsayacak kadar.
4. Bulaşıkları teker teker UV-C kaynağına/odasına (hibridizasyon fırını/UV çapraz bağlantı nın alt haznesine) götürün; Malzeme Tablosu). Tabağı odaya yerleştirin ve yemeğin kapağını çıkarın. Yemeğin açık kapak konumu, hücrelerin UV-C maruziyeti sırasında maksimum UV-C dozunu almasını sağlar.
5. Hücreleri farklı sınıflarda/DOZLARDA UV-C'ye maruz bırak: 1 J/m², 100J/m², 1,000 J/m² ve 10.000 J/m².
6. UV-C maruziyetinden sonra, her yemeğin kapağını hemen değiştirin ve UV-C kaynak odasından çıkarın.
7. Yemeklerin her birini laminar hava akışı başlığına getirin ve 2 mL taze tam ortam la yemeklerin her birini doldurun.
8. Hücreleri 37 °C CO₂ kuluçka makinesinde 3 saat kuluçkaya yatırın. UV-C maruziyeti sonrası üç saatlik kuluçka, erken etkileri görselleştirmek ve ölçmek için en uygun şeydir.

3. Canlı hücre boyama ortamının hazırlanması

1. UV-C maruziyeti sonrası 3 saatlik hücre kuluçkasının son 15 dakikasında boyama ortamını taze hazırlayın.
2. %10 FBS-DMEM içeren boyama ortamının 10 mL'si %1 Kalem-Strep ile 37 °C arasında tamamlanır.
3. 10 mM DCFDA 5 μL ekleyin; 5 μL 10 mg/mL Hoechst çözeltisi ve 200 μL 1 mg/mL propidium iyodür. DCFDA, Hoechst ve PI'nin son konsantrasyonları 10 mL boyama ortamlarında sırasıyla 5 μM, 5 g/mL ve 20 g/mL'dir.

4. UV-C maruz fare primer oküler hücrelerin DCFDA boyama

1. UV-C maruz fare primer oküler hücrelerinin çeşitli dozlarda inkübasyon 3 saat sonra, 35 mm yemeklerden medya aspire.
2. Yanlardan her bir tabak için taze hazırlanmış DCFDA boyama ortamı 2 mL ile yeniler.
3. Canlı hücre boyama için 37 °C CO₂ kuluçka makinesinde karanlıkta 15 dakika boyunca hücreleri boyama makinesiyle kuluçkaya yatırın.

5. DCFDA (ROS), Hoechst ve PI lekeli hücrelerin görüntülenmesi

1. Kuluçka tamamlandıktan sonra, boyama ortamını atın.
2. Hücrelere taze tam ortam ekleyin ve ters floresan mikroskop / hücre görüntüleyici(Tablo Malzemeler)altında hücreleri gözlemlemek. Fotoğraf istenilen alanları: parlak alan, mavi floresan, kırmızı floresan, yeşil floresan.
   NOT: Mavi floresan lekeli hücreler çekirdekleri, yeşil floresan ROS üreten hücreler için ve kırmızı floresan PI pozitif ölü hücreleri gösterir.

6. Görüntüleme teknikleri kullanılarak lekeli hücrelerin (Hoechst-Blue, PI-Dead ve Green-ROS) sayısallaştırılması

1. Ters floresan mikroskobun/hücre görüntüleyicisi altında yakalanan görüntüleri niceliklendirme için ImageJ'e aktarın.
2. Sayım için her kanalı (örneğin, mavi (Nuclei/Hoechst), yeşil (ROS), kırmızı (Ölü/PI pozitif)) kullanarak görüntülerin her birini teker birer açın. Pozlanmamış denetimden başlayın ve sırayla 1, 100, 1.000 ve 10.000 J/m^-2'yegeçin.
3. Alanların her biri için yazılım menüsünde çapraz olarak işaretlenmiş hücre sayma aracını kullanan hücreleri saymak [mavi pozitif (Hoechst pozitif; çekirdekler), kırmızı pozitif (PI pozitif; ölü hücreler); yeşil pozitif (ROS)] her bir görüntüye karşılık gelen Tedavi.
4. Alanların her birinde belirli sinyallerin her birine tıklayarak sayın. Örneğin, mavi/Hoechst lekeli çekirdeklere tıkladığınızda belirli bir alandaki toplam çekirdek sayısı verecektir.
5. Sonuçları UV hasarına göre hücre ölüm yüzdesi olarak hesaplayın (PI pozitif hücre sayısı x 100 Hoechst pozitif hücrelerin sayısına bölünür) ve ROS üretiminin UV hasarına göre yüzdesi (DCFDA pozitif hücrelerin sayısı x 100 Hoechst pozitif hücrelerin sayısına bölünür).

Sonuçlar

DCFDA hücrelerde ROS tespit etmek için bir gösterge olarak kullanılan floresan kimyasal olarak azaltılmış bir formu renksiz bir boya. Bu boya hücrelerin içinde sıkışıp alır ve kolayca floresan diklorodihidrolüorescein okside edilir (DCF), hangi yeşil floresan yayan. Bu floresan floresan mikroskopi ile tespit edilebilir. Hücreler şu şekilde görüntülenebilir ve ROS birikimi ile ilişkilendirilebilir: (i) ROS'suz canlı hücreler yüksek mavi floresan yontabilir; (ii) ROS birikimi ile canlı hücreler ...

Tartışmalar

Burada açıklanan DCFDA boyama yöntemi, UV-C radyasyonu ile tedavi edilen fare primer göz canlı hücrelerinde ROS'un görüntülenmesine olanak sağlar. Bu boyama yönteminin bir avantajı da araştırmacılar UV-C hemen etkilerini incelemek için izin olmasıdır (3 saat uvc sonrası maruz kalma) canlı hücreler ve ROS pozitif yüzdesi için eşzamanlı numaralandırma, yanı sıra, ölü hücreler. Ayrıca, boyama yöntemi canlı hücreler üzerinde kullanıldığından, hücreler UV-C radyasyonunun gecikmiş etki...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad