JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada plazmid DNA dağıtımı ve yetişkin zebrabalığı telencephalon ependymoglial hücre etiketleme için bir elektroporasyon yöntemi dir. Bu protokol, tek tek ependymoglial hücreleri görselleştirmek ve izlemek için hızlı ve etkili bir yöntemdir ve çok çeşitli genetik manipülasyonlara elektroporasyon uygulamak için yeni olanaklar sunar.

Özet

Elektroporasyon, hücre zarında geçici gözenekler oluşturmak ve geçirgenliğini artırmak için hücrelere elektriksel bir alanın uygulandığı ve böylece hücreye farklı moleküllerin sokulmasını sağlayan bir transfeksiyon yöntemidir. Bu yazıda, elektroporasyon ependymoglial hücrelere plazmidler tanıtmak için kullanılır, hangi yetişkin zebrabalığı telencephalon ventriküler bölge hattı. Bu hücrelerin bir kısmı kök hücre özelliklerini gösterir ve zebra balığı beyninde yeni nöronlar üretir; bu nedenle, nörogenez ve rejenerasyon rollerini belirlemek için davranışlarını incelemek esastır. Plazmidlerin elektroporasyon yoluyla piyasaya sürülmesi, tek bir ependymoglial hücrenin uzun süreli etiketlemesini ve izlenmesini sağlar. Ayrıca, Cre rekombinaz veya Cas9 gibi plazmidler tek ependymoglial hücrelere teslim edilebilir, bu da gen rekombinasyonunu veya gen düzenlemesini sağlar ve hücrenin otonom gen fonksiyonunu kontrollü, doğal Ortam. Son olarak, bu ayrıntılı, adım adım elektroporasyon protokolü tek ependymoglial hücrelerin çok sayıda içine plazmidlerin başarılı giriş elde etmek için kullanılır.

Giriş

Zebra balığı bir bıçak yarası yaralanması sonra beyin rejenerasyon incelemek için mükemmel hayvan modelleri vardır. Memelilere kıyasla, evrim merdiveninde, zebra balığı gibi daha az gelişmiş türler genellikle daha yüksek kurucu nörogenez ve yetişkin nöral kök hücre ikamet alanlarının daha yüksek oranlarını göstererek, sürekli olarak yeni nöronların yetişkin hayatında en beyin alanları. Bu özellik memelilere göre zebra balığının önemli ölçüde daha yüksek rejeneratif kapasitesi ile ilişkili görünüyor1, zebra balığı verimli bir şekilde en beyin hasarı modellerinde yeni nöronlar oluşturmak için olağanüstü bir potansiyele sahip olduğu gibi2, 3,4,5,6,7,8. Burada, zebra balığı telensefalon çalışılır, yetişkinlikte belirgin nörogenezi olan bir beyin alanı olduğu için. Erişkin nörogenezin bu bölgeleri yetişkin memeli beyninde nörojenik bölgelere homolog vardır9,10,11.

Zebrabalığı telensefalon bol nörojenik alanlar hücreleri veya ependymoglia hücreleri gibi radyal glia varlığı nedeniyle mevcuttur. Ependymoglial hücreler yerleşik yetişkin nöral kök hücreleri olarak hareket ve bozulmamış ve yenileyici beyin hem de yeni nöronların nesil sorumludur3,5. Soy izleme deneyleri ventriküler ependymoglia yaralanmatepki göstermiştir, daha sonra çoğalır ve lezyon sitesine göç yeni nöroblastlar üretmek5. Zebrabalığı telensefalon everted doğası nedeniyle, ependymoglial hücreler ventriküler yüzey hattı ve ventral ventriküler duvar inşa. Dorsal ventriküler duvar dorsal ependimal hücre tabakası ile oluşur (Şekil 1A). Daha da önemlisi, zebra balığı ependymoglia hem memeli radyal glia ve ependymal hücrelerin özelliklerini somutlaştırmak. Uzun radyal süreçler radyal glia hücrelerinin tipik bir özelliğidir, hücresel uzantıları ve sıkı kavşaklar ise (yanı sıra ventriküler pozisyonlar) ependimal hücrelerin tipik özellikleri12,13,14. Bu nedenle, bu hücreler ependymoglial hücreler olarak adlandırılır.

Rejenerasyon sırasında tek ependymoglial hücrelerin in vivo davranışını takip etmek için, güvenilir bir şekilde etiketlenmiş olması gerekir. Floresan mikroskopi için in vivo hücre etiketleme çeşitli yöntemler daha önce tarif edilmiştir, endojen muhabirler veya lipophilic boyalar gibi15. Bu yöntemler, elektroporasyon aksine, daha uzun süre ler gerektirebilir ve genellikle tek hücre etiketleme veya kalıcı uzun vadeli izleme imkanı sunmuyoruz. Elektroporasyon, ancak (tek hücre etiketleme yanı sıra), konak hücreiçine yeni DNA girme imkanı sunuyor. Ayrıca, hücrelere DNA transferi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, elektroporasyon en verimli yöntemlerden biri olduğu gösterilmiştir16,17,18,19.

Burada sunulan yetişkin zebrabalığı telencephalon tek ependymoglial hücreleri etiketleme amacıyla rafine edilmiş bir elektroporasyon protokolüdür. Bu protokol, uzun vadeli bir süre20 onları takip etmek veya hücre özerk bir şekilde belirli yolları işlemek için tek ependymoglial hücrelerin etiketleme sağlar21,22.

Protokol

Bu protokolde kullanılan tüm hayvanlar standart hayvancılık koşullarında muhafaza edilmiş ve deneyler AB ve Yukarı Bavyera Hükümeti'nin (AZ 55.2-1-54-2532-0916) kullanım yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak yapılmıştır.

1. Elektroporasyon için Plazmid Karışımı hazırlanması

  1. Steril su ilgi plazmid seyreltmek ve hızlı yeşil leke stok çözeltisi ekleyin [1 mg/mL]. Plazmidin son konsantrasyonunun (1 μg/μL) olduğundan emin olun.
  2. Hazırlandıktan sonra, plazmid çözeltisini birkaç kez yukarı ve aşağı boruyla veya parmak dokunarak karıştırın. Kullanıma kadar oda sıcaklığında (RT) saklayın.
    NOT: Aynı hücreye iki plazmidin birlikte elektroporasyonu için, karışımda kullanılan her plazmidin konsantrasyonunun en az 0,8 ng/μL olduğundan ve molar oranının 1:1 olduğundan %80-90 eş elektroporasyon verimi elde edilmesini sağlayın.

2. Enjeksiyon ve Elektroporasyon Prosedürü Için Hazırlıklar

  1. İğne çekme aparatının enjeksiyonu için gerekli olan cam kılcal damarları (dış çap 1 mm, iç çap 0,58 mm) hazırlayın.
  2. Doğru miktarda plazmid enjekte etmek için (yukarıya bakınız), kılcal damarı 68,5 °C sıcaklıkta iki hafif ve iki ağır ağırlıkla çekin (çekmece spesifikasyonları için Malzeme Tablosu'na bakın).
    NOT: Farklı bir çekmece kullanılması durumunda, uygun elektroporasyon karışımı hacmini sunmak için kılcal damarı kalibre edin.
  3. Enjeksiyon cihazını 200 hPa enjeksiyon basıncına (Pi buzunu çevirerek) ve 0 hPa sabit basınca manuel olarak ayarlayın. Enjeksiyon süresini manuel modda manuel olarak ayarlayın ve ayak pedalı ile basıncı kontrol edin.
  4. Elektroporasyon cihazını 54-57 V'da beş darbeyle "LV moduna" ayarlayın (her biri 1 s aralıklı 25 ms). Elektrotları cihaza bağlayın.
  5. Temiz balık suyu ile bir balık tankı hazırlayın, burada balık elektroporasyon işleminden sonra anestezi den uyandırılacaktır. Balık tamamen uyanana kadar tüm kurtarma dönemi boyunca hava pompasına bağlı hava taşını tutarak suyu aerate.
  6. Düzenli bir mutfak süngeri alın ve enjeksiyon ve elektroporasyon işlemi sırasında içine balık tutmak için sünger uzunlamasına kesim yapmak (önceki yayın3bakınız).
    NOT: Mutfak süngeri, potansiyel toksik kimyasalları gidermek için düzenli olarak yıkanmalı veya değiştirilmelidir.
  7. Enjeksiyon ve elektroporasyon kurulum yanında son derece iletken çok amaçlı ultrason jel küçük bir miktar yerleştirin.
    NOT: Bu yeterli elektrikiletkenlik sağlayacak, ve sonuç olarak, tüm telencephalon boyunca elektroporated hücrelerin dağılımı.

3. Zebrabalığı Anestezisi

  1. Anesteziden önce, distile suda %0,2 MS222 ile anestezi stok çözeltisi hazırlayın ve Tris-HCl tamponu ile pH'ı 7'ye ayarlayın. Balık suyunu kullanarak bu stoğu 1:10'u (yani %0,02 MS22'ye kadar) seyreltin.
  2. Vücut ve solungaçların hareketi (genellikle birkaç dakika için) yatışana kadar bu çalışma çözüm onları tutarak balık anestezik.

4. Plazmid Çözeltisi Enjeksiyonu

  1. Hazırlanan cam kılcal damarı mikroyükleyici uçlarını kullanarak 10 μL plazmid çözeltisi ile doldurun. Kılcal damar içinde hava kabarcıkları oluşumunu önlemek.
  2. Enjeksiyon cihazında Menü/Değişiklik Kılcal damarına basın. İğneyi iğne tutucuya takın ve sabitle.
  3. 3.2x veya 4x büyütme ile bir stereomikroskop altında, ince uç forceps kullanarak kılcal sadece ucu kesti. Enjeksiyon cihazını Değişim Capillary modundan Inject moduna geçin, ardından plazmid çözeltisinin iğneden kolayca dışarı akmasını ve engel teşkil etmeden çalışmasını sağlamak için ayak pedalı ile basınç uygulayın.
  4. Balıkları hayvancılık tankından anestezik solüsyonla konteynere (plastik kutu) aktarın. Solungaçların hareketi dinilene kadar birkaç dakika bekleyin.
  5. Sırt tarafı yukarı bakacak şekilde önceden ıslak sünger içine balık yerleştirin. Prosedürün doğruluğunu sağlamak için stereomikroskop altında aşağıdaki enjeksiyon adımlarını gerçekleştirin.
  6. 40 mm kesme kenarı ve 0,5 mm kalınlığında paslanmaz çelikten bir kesme mikro-bıçak kullanarak, telencephalon arka tarafında balık kafatası küçük bir delik oluşturmak(Şekil 1B),optik tektum ile sınırın hemen yanında.
    NOT: Delik çok küçük ve yüzeysel olmalıdır, beyin hasarı önlemek için, sadece kafatası nüfuz bu yana bu adım dikkatle yapılmalıdır.
  7. Balığı gerektiği gibi yatırın ve cam kılcal damarUcunu doğru açıyla kafatasına doğru yönlendirerek kılcal ucun delikten nüfuz etmesini kolaylaştırın.
  8. Kılcal damar ucunu, telensefalik ventriküle ulaşana kadar dikkatlice kafatasındaki delikten geçirin (Bkz. Şekil 1B). Bu dorsal ependymal hücre tabakası ile penetrasyon gerektirir. Özellikle beyin dokusu ile temas önlemek için çok derin kılcal sokmak için dikkatli olun. Sadece dorsal ependymal tabakası piercing sonra ventrikül içinde kalan, hemisfer arasında tam olarak kılcal tutun.
    NOT: Bu çok hassas bir adım. Bu prosedürün doğruluğu pirinçgibi pigmentasyon mutant hatları kullanılarak geliştirilmiş24, enjeksiyon sırasında cam kılcal pozisyonudaha iyi görselleştirme sağlayan.
  9. Ventrikül içinde kılcal ucu ile, yaklaşık 1 μL plazmid çözeltisi karşılık gelen yaklaşık 10 s, ayak pedalı ile basınç uygulayarak plazmid çözeltisi enjekte.
    NOT: İğne çekmecesi, kılcal damarlar veya enjektör değiştirilmelidir, sistem her zaman 1 μL plazmid çözeltisi sunmak için kalibre edilmelidir. Kalibrasyon, bir mineral yağa (örneğin, parafin yağı) atılan plazmid damlacığının çapının ölçülmesi ve daha sonra damlacık hacminin hesaplanması ile gerçekleştirilebilir. 10 s enjeksiyondan sonra mineral yağa ~1 μL plazmid sıvısı atılmalıdır.
  10. Ventrikül boyunca sıvı yayılmasını gözlemleyerek önceki adımın başarısını onaylayın.

5. Elektroporasyon

  1. Hala sünger tutarak enjeksiyon kurulum balık çıkarın.
  2. Ultrason jel elektrotların ucuiç tarafı batırın.
  3. Ultrason jel küçük bir miktar ile balık telencephalon kapağı.
  4. Balık kafasını elektrotlar arasına yerleştirin, pozitif elektrotı balığın başının ventral tarafına ve negatif elektrotu sırt tarafına yerleştirerek(Şekil 1C),balığın vücudunu süngerde tutarken. Bu subventriküler bölgede konumlandırılmış elektroporate ependymoglia için gerekli akımın yönünü ayarlar.
  5. Elektrotları telensefalona hafifçe ve hassas bir şekilde bastırın (Şekil 1C). Akımı ayak pedalı ile uygulayın. Beş darbe bitene kadar elektrotları yerinde tutun.

6. Balık Kurtarma

  1. Balıklar uyanana kadar önceden hazırlanmış, sürekli olarak temize çıkarılan tankta iyileşsin. Lidokain jel herhangi bir muhtemelen gelişmiş ağrı rahatlatmak için kafatası üzerinde uygulanabilir.

Sonuçlar

Açıklanan elektroporasyon yöntemi, zebrabalığı telensefalonsunda yüzeysel olarak bulunan ve dorsal ependymal hücre tabakasının hemen altında bulunan plazmid DNA'sının ependymoglial hücrelere ulaştırılmasını sağlar (Şekil 1A).

Elektroporasyon sonucu pozitif ise, etiketli tek ependymoglial hücreler (Şekil 2A,B'dekikırmızı hücreler) diğer ependymoglial hücr...

Tartışmalar

Bu elektroporasyon protokolü tek tek ependymoglial hücreleri etiketleme güvenilir bir in vivo yöntemidir. Protokol nöronlar veya oligodendrocytes gibi diğer hücre tipleri etiketlemek için daha fazla adaptasyon gerekebilir. Başarılı etiketleme elde etmek için, farklı organizatörler içeren plazmidler kullanılabilir. Tavuk-beta aktin organizatörü, eF1alpha, CMV ve ubikitin organizatörü daha önce ependymoglia farklı transgenlerin ekspresyonu ve onların döl23sürücü için kull...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

James Copti'ye el yazmasının düzenlenmesi için özel teşekkürler. Ayrıca SFB 870 ve SPP "Integrative Analysis of Olfaction" ve SPP 1738 "Sinir sistemi gelişiminde kodlamayan RNA'ların ortaya çıkan rolleri" spp1757 tarafından Alman Araştırma vakfından (DFG) JN'ye yapılan finansmanı minnetle kabul ediyoruz. Glial heterojenlik", ve Mükemmellik Stratejisi Münih Küme Sistemleri Nöroloji (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) çerçevesinde.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent/Material
Fast GreenSigma-AldrichF7258-25GFor coloring plasmid solution
MS222Sigma-AldrichA5040-25GMS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light
Ultrasound gelSignaGel, Parker laboratories INC.15-60Electrode Gel
Equipment
Air pumpTetraTec APS 50, 10l-60lCan be bought in the pet shops
BTX Tweezertrodes ElectrodesPlatinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus45-04861 mm diameter
Electroporation deviceBTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus45-0662
Injection deviceFemtoJet 4i, Eppendorf5252000013
Standard Wall Borosillicate Glass CapillaryWarner Instruments64-0766Model No: G100-4
Microloader tipsEppendorf5242956003
Micro-knifeFine Science Tools10056-12
Joystick micromanipulatorNarishige JapanMN - 151
Needle holderFemtoJet 4i, Eppendorf5252000013Needle holder comes together with the injection device
Needle pulling deviceNarishige JapanModel No: PC-10The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100
Petri dishesGreiner Bio-One International633161

Referanslar

  1. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B Biological Sciences. 363 (1489), 101-122 (2008).
  2. Baumgart, E. V., Barbosa, J. S., Bally-Cuif, L., Gotz, M., Ninkovic, J. Stab wound injury of the zebrafish telencephalon: a model for comparative analysis of reactive gliosis. Glia. 60 (3), 343-357 (2012).
  3. Barbosa, J., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 346 (6236), 789-793 (2015).
  4. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Model and Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
  5. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  6. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
  7. Ayari, B., Elhachimi, K. H., Yanicostas, C., Landoulsi, A., Soussi-Yanicostas, N. Prokineticin 2 expression is associated with neural repair of injured adult zebrafish telencephalon. Journal of Neurotrauma. , (2010).
  8. Skaggs, K., Goldman, D., Parent, J. M. Excitotoxic brain injury in adult zebrafish stimulates neurogenesis and long-distance neuronal integration. Glia. 62 (12), 2061-2079 (2014).
  9. Schmidt, R., Strahle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8 (3), (2013).
  10. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  11. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Developmetal Neurobiology. 72 (3), 429-461 (2012).
  12. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  13. Lyons, D. A., Talbot, W. S. Glial cell development and function in zebrafish. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (2), a020586 (2014).
  14. Obermann, J., et al. The Surface Proteome of Adult Neural Stem Cells in Zebrafish Unveils Long-Range Cell-Cell Connections and Age-Related Changes in Responsiveness to IGF. Stem Cell Reports. 12 (2), 258-273 (2019).
  15. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
  16. Kusumanto, Y. H., et al. Improvement of in vivo transfer of plasmid DNA in muscle: comparison of electroporation versus ultrasound. Drug Delivery. 14 (5), 273-277 (2007).
  17. Zou, M., De Koninck, P., Neve, R. L., Friedrich, R. W. Fast gene transfer into the adult zebrafish brain by herpes simplex virus 1 (HSV-1) and electroporation: methods and optogenetic applications. Frontiers in Neural Circuits. 8 (41), (2014).
  18. Van Tendeloo, V. F., et al. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98 (1), 49-56 (2001).
  19. Mars, T., et al. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts. The Journal of Membrane Biology. 248 (2), 273-283 (2015).
  20. Barbosa, J. S., Di Giaimo, R., Gotz, M., Ninkovic, J. Single-cell in vivo imaging of adult neural stem cells in the zebrafish telencephalon. Nature Protocols. 11 (8), 1360-1370 (2016).
  21. Di Giaimo, R., et al. The Aryl Hydrocarbon Receptor Pathway Defines the Time Frame for Restorative Neurogenesis. Cell Reports. 25 (12), 3241-3251 (2018).
  22. Breunig, C. T., et al. One step generation of customizable gRNA vectors for multiplex CRISPR approaches through string assembly gRNA cloning (STAgR). PLoS One. 13 (4), e0196015 (2018).
  23. Barbosa, J. S. . In vivo single cell analysis reveals distinct behavior of neural stem and progenitor cells in homeostasis and regeneration in the adult brain. , (2014).
  24. Kelsh, R. N., et al. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest development. Development. 123, 369-389 (1996).
  25. Torper, O., et al. In Vivo Reprogramming of Striatal NG2 Glia into Functional Neurons that Integrate into Local Host Circuitry. Cell Reports. 12 (3), 474-481 (2015).
  26. Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
  27. Chapouton, P., Godinho, L., Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. . Neurogenesis. Chapter IV in The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part A Developmental Biology. 100, (2010).
  28. Zhu, P., et al. Optogenetic Dissection of Neuronal Circuits in Zebrafish using Viral Gene Transfer and the Tet System. Frontiers in Neural Circuits. 3 (21), (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imbiyolojisiSay 151elektroporasyonependymogliain vivo h cre etiketlemeplazmid do umzebrabal telensefalongen d zenleme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır