Yüzey Altı Biyomining Bağlamında Basınca Bağımlı Mikrobiyal Aktiviteyi Simüle Etmek Için Esnek Altın-Titanyum Reaksiyon Hücrelerinin Kullanılması

Özet

Bu protokol, yerinde biyomining süreçlerinde çalışmak için yüksek basınç altında mikrobiyal deneyler açıklar. Deneysel yaklaşım, asidik, demir açısından zengin bir ortamda mikrobiyal kültür içeren altın-titanyum reaksiyon hücresi ile donatılmış sallanan yüksek basınçlı bir reaktör kullanır.

Özet

Derin cevher yataklarında metal yıkama (biyomining) gibi yeraltı mikrobiyal süreçlerini inceleyen laboratuvar çalışmaları, çoğaltılması gereken özel çevre koşulları, örneğin yüksek basınç dahil olmak üzere ortak ve zorlu engelleri paylaşır ve bazı durumlarda asidik çözeltiler. Eski 100 bar kadar basınçlandırma için uygun deneysel bir kurulum gerektirir, ikincisi korozyon ve konteyner duvarı ile istenmeyen kimyasal reaksiyonlara karşı yüksek kimyasal direnç ile sıvı bir konteyner gerektirir. Bu çalışmada, in situ biyomining alanında bir uygulama için bu koşulları karşılamak için, sallanan yüksek basınçlı reaktör içinde özel bir esnek altın-titanyum reaksiyon hücresi kullanılmıştır. Açıklanan sistem, anoksik, basınç kontrollü, kimyasal olarak son derece durağan deneysel bir ortamda kükürtlü mikrobiyal demir azaltma yoluyla in situ biyomining simülasyonu sağladı. Esnek altın-titanyum reaksiyon hücresi, sistem istenilen basıncı korurken herhangi bir zaman noktasında numune alınabilen 100 mL'ye kadar numune çözeltisi barındırabilir. Deneyler, saatler ile aylar arasında değişen zaman ölçeklerinde gerçekleştirilebilir. Yüksek basınçlı reaktör sisteminin montajı oldukça zaman alır. Bununla birlikte, kimyasal olarak agresif sıvılarda yeryüzünün derin yüzeyinde meydana gelen karmaşık ve zorlu (mikrobiyolojik) süreçler laboratuvarda incelendiğinde, bu sistemin avantajları dezavantajlardan daha ağır basmaktadır. Sonuçlar, yüksek basınçta bile mikrobiyal konsorsiyumun aktif olduğunu, ancak metabolik hızların önemli ölçüde daha düşük olduğunu ortaya koydu.

Giriş

Son on yılda, madenciliğin çevre üzerindeki etkisini en aza indirme çabaları artmıştır. Cevherlerin hammadde ekstraksiyonu için açık çukur madenciliği (örneğin, bakır bakımından zengin sülfür cevherleri), kazı faaliyetleri ve değerli çıkarma dan sonra işlenmiş cevher kalıntıları nın büyük hacimleri ve kalan büyük atık kayaları ile çevredeki peyzajı etkiler bakır gibi metaller. Yeraltı daki cevherden doğrudan bakır çıkarmak bu etkileri önemli ölçüde azaltacaktır. in situ biomining teknolojisi bu süreç için umut verici bir aday¹. Bu yayın, cevherden değerli metalleri yeraltı yüzeyinde sulu bir çözeltiye çıkarmak için uyarılmış mikrobiyal aktivitenin kullanımını açıklamaktadır. Böylece, bakır açısından zengin bir çözelti, örneğin metali daha fazla yoğunlaşmış olmak için yüzeye kolayca pompalanabilir.

Cevher-yıkama asiofilik mikroorganizmaların aktivitesi^{parametreleri 2,3},⁴,^5,6çeşitli bir dizi için birçok laboratuvarda incelenmiştir. Ancak, hidrostatik koşullar (~ 100 bar) ile 1.000 m derinlikte ortam yüzeyi laboratuvar koşulları (1 bara yakın) ve yeraltı yüzeyi arasındaki farktan kaynaklanan mikrobiyal aktivite üzerindeki basınç etkileri iyi belgelenmemiştir. Bu nedenle, mikrobiyal demir azaltma üzerindeki baskının etkileri farklıdeneysel yollar 7 ile araştırılmıştır. Burada en uygun teknik ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Yüksek basınçlı reaktörler, yerin yüzeyinde meydana gelen basınç ve sıcaklıklardaki reaksiyonları incelemek için yoğun olarak kullanılmıştır. Bu tür reaktörler, mikrobiyal kültüre sahip bir sıvı örneği içerebilen bir reaktör kabından oluşur. Reaktör gemisinin üzerinde oturan reaktör kafası, güvenlik önlemleri ve izleme sensörleri (örn. sıcaklık veya basınç) için çeşitli bağlantılar ve arayüzler sunar. Yüksek basınçlı reaktörlerin çoğu paslanmaz çelikten yapılmıştır. Bu malzeme yüksek esneklik ve iyi işleme özellikleri sunar, ancak paslanmaz çelik yüzeyin korozyon direnci her uygulama için yeterli değildir. Örneğin, yüksek asidik veya yüksek oranda azaltıcı sulu çözeltiler araştırılırsa, reaktör duvarı ile ilgili bileşiklerin önemli reaksiyonları oluşabilir. Bunu önlemek için bir yolu reaktör gemi içine bir astar eklemek için, örneğin borosilikat cam dan yapılmış bir astar⁷. Temizlenmesi kolaydır ve otoklavlama ile sterilize edilebilir. Buna ek olarak, asidik veya sulu çözeltiler azaltarak tarafından saldırıya uğramaz. Bir astar paslanmaz çelik reaktör duvarı ile çözüm çözeltisi veya mikropların yapay reaksiyonları önlemek için yardımcı olsa da, çeşitli sorunlar kalır. İlk olarak, sülfat azaltıcı bakteriler tarafından üretilen hidrojen sülfür gibi aşındırıcı bir gaz oluşursa, bu gaz reaktör kafasının astarÜzerinde oturan açık yüzeyi ile reaksiyona bile çıkabilir. Bir diğer dezavantajı da basıncı korurken reaktörden numune çekmenin mümkün olmamasıdır.

Bu sınırlamaları aşmak için, yüksek basınçlı reaktörler içinde özel esnek reaksiyon hücreleri çeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir. Esnek bir politetrafloroetilen (PTFE) hücre⁸ yüksek tuzlu salamura tuzların çözünürlük çalışmaları için tasarlanmıştır. Ancak, bu sistemin sınırlama bazı gazlar kolayca PTFE nüfuz olabilir. Buna ek olarak, bu malzeme hala nispeten düşük sıcaklık stabilitesi vardır. Böylece, sistem paslanmaz çelik yüksek basınçlı reaktör içine yerleştirilecek bir titanyum kafa⁹ ile esnek bir altın çanta tasarlayarak geliştirilmiştir. Altın yüzey, asidik veya azaltıcı çözeltilere ve gazlara karşı korozyona dayanıklıdır. Titanyum yüzeyi de sürekli titanyum dioksit tabakası oluşturmak için iyice pasifildiğinde son derece durağan. Bağlı bir titanyum örnekleme tüpü ile bu reaksiyon hücresinden örnekleme sırasında, altın torba hacmi küçülür. Sistemin iç basıncı, aynı su hacminin pompalanmasıyla korunur, örnekleme ile geri çekilir, reaksiyon hücresini barındıran paslanmaz çelik yüksek basınçlı reaktöre. Reaksiyon hücresi içindeki numune, deney sırasında yüksek basınçlı reaktörü 90°'den fazla sallayarak veya yatırarak hareket halinde tutulur.

Reaksiyon hücresi Şekil 1'debetimlenen parçalardan oluşur: altın torba, titanyum yaka, titanyum kafa, paslanmaz çelik yıkama, titanyum sıkıştırma cıvata halkası, paslanmaz bezleri ve yüksek basınçlı koni ve yakalı titanyum örnekleme tüpü her iki tarafta dişli bağlantıları ve titanyum vana. Altın torba 0.2 mm duvar kalınlığı, 48 mm dış çapı ve 120 mm uzunluğunda silindirik altın (Au 99.99) hücredir.

Tüm titanyum parçaları, atölye tarafından titanyum sınıf 2 çubuklarından özel olarak üretilir. Yaka,baş, yıkama ve sıkıştırma cıvata halkasının boyutları Şekil 2'de görülmektedir. Titanyum örnekleme tüpü, dış çapı 6,25 mm ve duvar kalınlığı 1,8 mm olan titanyumkamı, iç çapı 2,65 mm olan bir tüptür. Titanyum baş ve titanyum valf içine yüksek basınçlı koni ve dişli bağlantıları titanyum-karşı-titanyum yüzeylerbir mühür sağlayan sabitlenir. Yüksek basınçlı titanyum valf, yüksek basınçta bile çok kontrollü bir açma veya örnekleme sağlamak için yavaş bir açma sapı ile donatılmıştır. Bu sistem çok sayıda çalışmada kullanılmıştır^10,11,12.

Protokol

1. Mikrobiyal kültürün orta ve aşılanmasının hazırlanması

1. Yayınlanan tekniklere göre ototrofik prokaryotlar için bazal tuz ortamı hazırlayın¹³. Aşağıdaki kimyasalları distile suda (mg/L) çözün ve karıştırın: Na₂SO₄·10H₂O (150) (NH₄)₂SO₄ (450), KCl (50), MgSO₄·7H₂O (500), KH₂PO₄ (50) ve Ca(NO) _{3) (3) 2}·4H₂O (7).
2. 1000x konsantre iz eleman çözeltisi (g/L): ZnSO₄·7H₂O (10), CuSO₄·5H₂O (1), MnSO₄· H₂O (0.76), CoSO₄·7H₂O (1), CrK(SO₄)₂·12H₂O (0.4), H₃BO₃ (0.6), Namoo₄·2H₂O (0.5), NiSO₄·6H₂O (1), Na _2.000 SeO₄ (0.51), Na₂WO₄·2H₂O (0.1) ve NaVO₃ (0.1). 5 M sülfürik asit ekleyerek pH'ı 1,8'e ayarlayın.
3. Orta yı 121 °C ve 1,2 bar'da 20 dakika sterilize edin ve ferrik demir çözeltisini 0,22 m gözenek büyüklüğünde şırınga filtresi ile filtreleyerek sterilize edin.
4. Sterilize bazal tuz ortamının 50 mL'sini serum şişesine aktarın ve ferrik demir solüsyonu ve elemental kükürtü sırasıyla 50 mM ve 10 g/L'lik son konsantrasyona ekleyin.
5. Birkaç mezoasiofilik demir oksitleyici prokaryot14 oluşan karışık bir kültürile orta inoculate .
6. Serum şişesini sterilize butil kauçuk durdurucularla kaplayın ve alüminyum kıvrımlı mühürleyin.
7. Şiddetle 25 dakika boyunca çözünmüş oksijen şerit N₂ ile kültür ortamı kabarcık. İki iğne kullanın, şişe başının daha derin bir yer, kapak yakın diğer.
8. Serum şişesinin kafa boşluğunda %90 N 2 ve %10 CO₂ atmosferi elde etmek için CO₂ enjekte edin. Kültürü karanlıkta 30 °C'de karıştırmadan kuluçkaya yatırın.

2. Altın-titanyum reaksiyon hücresi ve yüksek basınçlı reaktörün hazırlanması

1. Altın-titanyum reaksiyon hücresini temizleyin.
   1. Reaksiyon hücresini, asitin paslanmaz çelik parçalarla temasından veya farklı ısıgenleme özelliklerine sahip monte edilmiş parçaların ısıya maruz kalmasını önlemek için ayrı parçalara ayırın.
   2. Deney sırasında numuneyle temas edecek yüzeyleri (altın torba, titanyum kafa, titanyum örnekleme tüpü ve titanyum valf) temizleyin.
      1. Altın torbayı ve titanyum kafayı cam bir kabın içine koy.
      2. Tüm parçaları kapsayacak kadar % 10 HCl ekleyin.
      3. Bir ısıtma plakası üzerindeki asidi karıştırArak 3 saat boyunca 50 °C'ye ısıtın.
      4. PTFE cımbızlı kısımları asit çözeltisinden çıkarın ve deiyonize suyla durulayın.
      5. Altın torbanın iç yüzeyini ve titanyum kafayı %65 HNO₃ ile iyice durulayın ve sonra deiyonize suyla durulayın.
      6. Titanyum örnekleme tüpünün iç yüzeyini ve titanyum valfin iç yüzeyini %10 HCl ile durulayın, ardından deiyonize su, %65 HNO₃, ve sonra tekrar deiyonize su.
      7. Organik kontaminasyondan tüm parçaları aseton ile durulayarak temizleyin.
      8. Fırındaki tüm parçaları 105 °C'de en az 1 saat kurulayın.
   3. Altın torbanın, titanyum kafanın ve titanyum örnekleme tüpünün yüzeylerini 450 °C'lik bir sıcaklığa maruz bırakarak hava atmosferinde bir boğuk fırında 4 saat ısıtın.
      NOT: Bu işlem yüzeyleri sterilize eder ve tüm titanyum yüzeylerde pasifize edici titanyum dioksit tabakasının oluşmasına neden olabilir. Titanyum parçaları ısıl işlemden sonra sarı dan maviye renk olmalıdır.
   4. Anneal altın hücre bir propan meşale ile ısı uygulayarak küçük kristalizasyon etki alanları sıfırlayarak altın esnekliğini artırmak için. Bir deneyde altın torbası hacminin son küçülmesi sırasında oluşmuş olabilecek altındaki kinkleri azaltmak için altın yüzeyini her yerde ısıtın. Erimesini önlemek için altını tek bir yerde çok fazla ısıtmamaya niçin bu kadar çok fazla ısıtmayın.
      NOT: Altın yüzeyin kırmızı bir parıltı yeterli ısıtma gösterir.
   5. Altın torbayı titanyum yakaya ve titanyum örnekleme borularını bezler için 10 Nm tork kullanarak titanyum kafaya monte edin.
2. Yüksek basınçlı reaktörü inceleyin.
   1. Reaktörü olası hasar, korozyon ve gevşek parçalar için görsel olarak kontrol edin.
      NOT: Mührün ve sızdırmazlık yerinin bulunduğu çentiklere özel ilgi çekilmelidir. Daha önce reaktörü mühürlemek için grafit conta kullanılmışsa, kalıntıları hala kaldırımda olabilir ve bir sonraki denemeden önce plastik bir iğneyle çıkarılmalıdır.
   2. Bakır sülfür macunu yüksek basınçlı reaktör başlığındaki itme cıvatalarına uygulayın. Gresin tüm iplik üzerinde dağıtıldığından emin olun.
   3. Kalan grafit ambalajUzunluğu için vida montaj sıkıştırma confama kontrol edin.

3. Altın-titanyum reaksiyon hücresinin anoksik koşullarda doldurulması ve montajı

1. Torpido kutusunu yükleyin.
   1. Bölüm 1'e göre serum şişelerinde kültür ortamını hazırlayın.
   2. Herhangi bir potansiyel kontaminasyonu en aza indirmek için daha sonra alüminyum folyo numune ile temas edecek goldtitanium reaksiyon hücresi parçaları sarın.
   3. Torpido gözü kutusunun ön odasını açın ve kilidini açın, gelen tüm malzemeyi hareket ettirilebilir tepsiye yükleyin ve ön kapağı kapatın ve kilitleyin.
   4. Antechamber 3x tahliye ve yüksek saflıkta azot ile sel.
   5. Bir çift eldiven giyin ve iç kapağına mümkün olduğunca yaklaşın. Gelen malzemeyi hareketli tepsiden çıkarmak için iç kapağın kilidini açın ve açın.
   6. İç kapağı kapatın ve kilitleyin.
2. Altın hücreyi doldur.
   1. Temiz altın torbayı aç ve cam bir beher ile ayağa kalk, örneğin. 100 mL bakteri kültürü ve elementel sülfür içeren serum şişesini açın.
   2. Yavaşça serum şişesi sallamak ve altın torbaya bakteri kültürü aktarın.
3. Tepki hücresini birleştirin.
   1. Altın torbanın üst kenarını çevreleyen titanyum yakaiçine bağlı titanyum örnekleme tüpü ile titanyum baş yerleştirin.
      NOT: Titanyum başın konik alt kısmının sızdırmazlık yüzeyinin 90° ileri geri çevirerek düzgün bir şekilde oturduğundan emin olun.
   2. Yıkayıcıyı ve sıkıştırma cıvata halkasını titanyum örnekleme borusu üzerinde titanyum baş üzerine kaydırın.
      NOT: Titanyum yakanın flanşlarını ve itme cıvata halkasını hizalamak için titanyum yakadaki sıkıştırma cıvata halkasını 30° çevirin.
   3. Altı Allen vidasını aynı ölçüde sabitleyerek titanyum yakadaki altın torbanın en üst kenarındaki titanyum kafanın eşit basınç dağılımını (yani reaksiyon hücresinin sızdırmazlık yüzeyine) sabitleyin.
      NOT: Allen vidalarını sıkıştırma cıvata halkasına, karşı vidaların torku saat yönünde devam etmeden önce önce artırılsın (crisscrossing) artırın, böylece sıkısıkıya kadar sabitle.
4. Örnekleme valfini titanyum tüpün üst kısmında yeniden kurun. Bağlantıyı elle sıkı titretin ve vanayı kapattırdığından emin olun.
5. Torpido glove kutusundan tüm parçaları çıkarın.

4. Yüksek basınçlı reaktörün reaksiyon hücresi ile montajı

1. Reaksiyon hücresini reaktör kafasına birleştirin.
   NOT: Yüksek basınçlı reaktörün montajı, örnekleme borusunun açık ucunun çevredeki atmosfere çok kısa bir şekilde maruz kalmasına neden olur, çünkü örnekleme valfi, tüpü reaktör başlığındaki vida lı contadan geçirmek için çıkarılmalıdır. Kurulum için, reaktör kafası zaten bir tezgah mengene içine yerleştirilmelidir. 45° açı daha kolay kullanım sağlar. Sıkıştırma contası montajı (reaktör kafasının gage blok tertibatının merkezi konumunda yer alan) numune alma tüpünü yerinde tutan, açık olmalıdır.
   1. Örnekleme tüpünün üstündeki titanyum örnekleme valfini, vidayı ve yakayı çıkarın.
   2. Tüpün yaklaşık 5 cm'si geçene kadar tüpü reaktör başlığındaki merkezi delikten bağlı reaksiyon hücresi ile yönlendirin. Büyük vidayı tüpün üzerine kaydırın ve küçük yakayı sabitle.
      NOT: Reaksiyon hücresi tertibatı reaktör başlığından geriye doğru kayamaz ve her iki el de örnekleme valfini yeniden kurmak için serbesttir.
   3. Titanyum valfi yeniden bağlayın.
   4. Sıkıştırma contasını sıkın.
   5. Reaktör kafasını tezgah takindan çıkartın ve reaktör kabına tonuyla tonuyla tattı.
2. Reaktörü mühürlemeye hazırlanın.
   1. Reaktör gemisinin kerf üzerine grafit sızdırmazlık koyun.
   2. Reaktör kafasını bağlı tepki hücresi ile reaktör kabına dikkatlice yerleştirin.
      NOT: Termokupl da dahil olmak üzere reaktör kafası, altın torbaya veya termokupla zarar vermemek için reaktör kabına dikkatlice yerleştirilmelidir.
3. Reaktör kabını deiyonize ve musluk suyu karışımıyla doldurun (yaklaşık olarak 1:1 oranında).
4. Reaktörü kapatın.
   1. Sıkıştırma cıvatalarının alt uçlarının ipliklerinin dışına çıkmadığından emin olmak için yakayı kontrol edin. Aksi takdirde, basınçlı kap doğru monte edilmez.
   2. Tasmayı kaldırın ve reaktör başlığı arabiriminin çıkıntılı kenarlarına yerleştirin. Tasmanın hafifçe hareket ettirilmesi uygun bir uyuma neden olur. Tasmanın yerinde tutulmasını engelleyen kilitleri kapatın.
   3. Sıkıştırma cıvatalarını bir crisscross deseni takip ederek sabitle ve üretici tarafından önerilen son değerelde edilene kadar torku orta adımlarla artırın.
      NOT: Farklı yüksek basınçlı reaktör sistemleri farklı tork değerlerine sahip olabilir.
   4. Son olarak, sıkıştırma cıvatalarını saat yönünde sabitle.
5. Yüksek basınçlı reaktörü sallanan cihaza takın.
   NOT: Yüksek basınçlı reaktörün sallanan cihaza yerleştirilmesi, Almanya'nın Hannover şehrindeki Federal Yerbilimleri ve Doğal Kaynaklar Enstitüsü'nde üretilen özel yapım bir model için tanımlanmıştır. Bu nedenle, açıklanan yükleme karşılaştırılabilir tasarıma uygun aygıtlar için genel bir kılavuzdur.
   1. Reaktörü sallanan alete dikkatlice monte edin.
      NOT: Yüksek basınçlı reaktörü gage blok montaj parçaları (örneğin, manometre veya numune alma tüpü vidaları) ile tutarak sallanan cihaza düşürmek en iyisidir.
   2. Reaktörü bir çift uzun vidanın üzerine iki kelepçeyle sabitle.
   3. Her vida üzerine yıkayışyerleştirin ve kelepçeleri vidalı somunlarla sıkın.
   4. Termokupl, basınç transdüserve ısıtma elemanı için kontrol üniteleri bağlayın.
      NOT: Tüm tellerin sallanan hareket için yeterli uzunlukta olduğundan emin olmak ve ısıtmalı yüzeylere temas etmesini önlemek önemlidir.
   5. Isıtma elemanını reaktör kabının üzerine kaydırın ve vida kilidini sıkın.
      NOT: Sistemi basınçlandırmak için su yüksek basınçlı pompalı bir rezervuardan alınır. Paslanmaz çelik kılcal damarlardan yüksek basınçlı reaktöre aktarılır.
      NOT: Yüksek basınçlı reaktörün sallanması, reaksiyon hücresi içeriğinin (yani gaz, sıvı ve içindeki tüm katı fazların) eksiksiz bir şekilde karıştırılması garanti eder. Yavaş sallanan hız, yüksek sıcaklıklarda esnek altın üzerindeki yerçekimi etkileri nedeniyle hızlı hareket eden katılar veya deformasyon ile altın torbasının zarar görmesini önlemek için önemlidir. Sallanan sistem 180°'ye yakın dönebilir.

5. Deneyi başlatma

1. İzleme yazılımındaki sıcaklık ve basınç sınırlarının istenilen değerlere ayarlanıp ayarlanıp ayarlanıp ayarlanıp ayarlanıp ayarlanıp ayarlaolmadığını kontrol edin.
   NOT: Bu deneyde 70 °C ve 25 MPa olarak belirlenmiştir.
2. Sızıntı kontrolü yapın.
   1. Paslanmaz çelik bir kılcal damar olan basınç borusunu reaktör başlığına bağlayın.
   2. Sürekli sızıntı için kontrol ederken farklı aralıklarla hedef basıncı basıncı yükseltmek.
   3. Pompanın akış hızı neredeyse sıfır olana kadar basıncı sabit tutun.
      NOT: Suda sıkıştırılabilir, çözünmüş havanın ince akış okumalarında uzun süre görülebildiğine dikkat edin.
3. Başarılı bir sızıntı kontrolünden sonra ısıtmabaşlatın.
   1. Basınç pompalarının tomruklarını başlatın.
   2. IsıtMa için ayar noktasını istenilen değere ayarlayın ve ısıtmayı yazılımla başlatın.
   3. Tüm parametreleri ve sistem durumunu düzenli olarak kontrol edin.
   4. Hedef sıcaklığa ulaştıktan sonra basınç borusunu sıkın.
   5. Sallanan cihazı çalıştırın.

6. Yüksek basınçlı reaktörün operasyonel modda örnekalınması

1. Numune almak için, yüksek basınç reaktörünün üst kısmındaki numune valfinin Luer Lock konektörüne 5 mL'lik bir şırınga takın.
2. Vanayı dikkatlice açın ve sıvı örneğinin yüksek basınç reaktörüiçindeki basınçla şırıngaya itmesine izin verin. Örneklenmiş hacim 1 mL'ye ulaştıktan sonra vanayı kapatın. Şırıngayı çıkar.
3. Şırıngadaki numuneleri işleme için hemen bir duman kaputundaki 2 mL'lik bir tüpe aktarın.

7 . Sıvı numunesinin analizi

NOT: Sadece daha az yaygın olan fotometrik ferrozin testinin basamakları (yani bölüm 7.1) burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve videoda belirtilmiştir, çünkü diğer adımlar mikrobiyolojide standart işlem prosedürleridir.

1. Çözünmüş demir (Fe²⁺_(aq)ve toplam demir (Fe_tot) konsantrasyonunu fotometrik olarak belirlemek için ferrozin etomu kullanın¹⁵.
   1. Bilinen miktarda FeSO₄·7 H₂O'nun suda eriterek bir dizi demir standardı çözüm hazırlayın.
   2. Bu standart seviyelerin 50 μL'sini 1 M ferrozin çözeltisinin 1 mL'si ile karıştırın.
      NOT: Ferrozinin çözünmüş demir ile reaksiyonu mor bir kompleks oluşturur. Rengin yoğunluğu demir konsantrasyonu ile ilişkilidir.
   3. Demir-ferrozin kompleksinin demir konsantrasyonu ve emiciliği arasında bir kalibrasyon eğrisi kurun.
   4. Bir numunenin demir demirinin konsantrasyonunun belirlenen standart eğriye göre iki paralel ölçümden hesaplayın.
2. PH değerini ve oksidasyon/azaltma potansiyelini (ORP) dijital pH/redoks metreile yarı mikro pH elektrotları ve gümüş klorür elektrotile analiz edin.
3. Bir Thoma odası ile Bir ışık mikroskobu kullanarak doğrudan planktonik hücreleri saymak.
4. Elektron mikroskobu (SEM) tarayarak hücre morfolojisini araştırın.
   1. 0,1−0,2 m'lik gözenek boyutu filtresi ile farklı koşullar altında yetiştirilen planktonik hücreleri filtreleyin.
   2. Örnekleri aseton ile kurutun ve %90 aseton içinde 4 °C'de bir gecede saklayın.
   3. Kritik nokta kurutarak numuneleri kurutun ve grafit veya altınla kaplayın.
   4. Elektron mikroskobu (FE-SEM) ile 10 kV'de alan emisyon taraması yapılan numuneleri inceleyin.

Sonuçlar

Özel altın-titanyum reaksiyon hücresi ile yapılan yüksek basınçlı reaktör deneyinin sonuçları, asitofillerin mikrobiyal karışık kültürünün sülfür okside ettiğini ve ferrik demiri demirdemire indirgediğini göstermektedir(Şekil 3).

Her iki 1 bar veya 100 bar basınç koşullarında, kültürler altın-titanyum reaksiyon hücresinde yetiştirilen bir gecikme faz vardı. Bu dönemden sonra demir konsantrasyonunda yaklaşık 9 mM'den 31 mM'ye hızlı bir artış 1 bar'da yetişen kültürde meydana gelmiştir. 22 günlük kuluçka süresi boyunca, 1 bar ve 100 bar'da tahlillerde sırasıyla ~31 mM ve 13 mM demir demirtespit edildi. Bu açıkça mikrobiyal hücrelerin 100 bar aktif olduğunu göstermektedir, ancak ferrik demir azaltıcı aktivite yüksek basınçta önemli ölçüde daha düşüktü. Hungate tüpleri ve serum şişelerinde yapılan abiyotik kontrol deneyleri 1 bar ve 100 bar'da ferrik demir redüksiyonu göstermedi.

Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri(Şekil 4)düşük ve yüksek basınçtaki deneylerde yetişen çubuk şeklindeki hücreleri göstermektedir. Hücre morfolojisinde 1 bar a itrinde anlamlı bir değişiklik gözlenmedi. Ancak hücre büyümesi, hücre sayısı 1 bar'da 1 bar'da 1,3 x 10⁸ hücre/mL olduğu için, 100 bar^7'de4,5 x 10⁷ hücre/mL olduğu için, hücre büyümesi açıkça yüksek basınç la inhibe edilmiştir. Bu veriler Hungate tüpleri⁷yapılan testler ile karşılaştırılabilir. Böylece, esnek altın-titanyum reaksiyon hücresinin kendisi hücre büyümesi üzerinde hiçbir etkisi yoktu ve mikrobiyal büyüme testleri için uygun oldu.

Sonuçlar, biyoleaching mikroorganizmaların 100 bar yüksek basınçta bile aktif olduğunu göstermektedir, bu da yerinde biyomining için son derece önemlidir, çünkü bu koşullar 1.000 m^7'ninaltındaki derinlikte derin cevher yataklarında meydana gelir.

Şekil 1: Reaksiyon hücresi parçalarına genel bakış. Aşağıdan yukarıya: altın çanta, titanyum yaka, titanyum kafa, yıkayıç, titanyum sıkıştırma cıvata halkası, paslanmaz bezleri ve yakalar ile titanyum örnekleme tüpü her iki tarafta yüksek basınçlı koni ve dişli bağlantıları için, ve titanyum vana ile bir Luer Lock şırınga bağlamak için adaptör. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Titanyum sınıf 2 çubuklarından işlenmiş titanyum parçaların boyutlu çizimleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Altın-titanyum reaksiyon hücresindeki demir konsantrasyonlarının demir oksitleyici kültürle değişimi. Hücreler 30 °C'de anaerobik olarak yetiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Demir oksitleyici kültürün morfolojisi 1 bar ve 100 bar'da yetişir. Hücreler 30 °C'de anaerobik olarak yetiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Asidik çözeltiler içinde mikrobiyal reaksiyonların yüksek basınçlı deneyleri için sunulan yöntem, laboratuvar ortamında derin yeraltı jeomikrobiyolojik süreçlerini simüle etmek için güçlü bir araçtı.

Bazıları özel dikkat gerektiren çok sayıda manuel çalışma adımları söz konusur. Genel bir not olarak, esnek altın-titanyum hücre ve reaktör kafasının tek tek parçaları (bölüm 3 ve 4) montajı nda aşırı güç kullanılmamalıdır. Üreticinin teknik özellikleri (örn. maksimum basınç, sıcaklık, tork için) göz ardı edilirse, sızıntı ve/veya malzeme arızalarına neden olabilir.

Altın ve titanyum parçalarının (bölüm 2.2) temizlenmesi sadece bu deney için değil, özellikle (in-)organik reaksiyonları içeren deneyler için de vazgeçilmez bir çalışma adımıdır. Altın hücrede önceki deneylerden kalıntılar istenmeyen reaksiyonlara neden olabilir ve bu nedenle sonuçların önyargılı. Monte edilen altın-titanyum hücresi reaktör kafasına monte edildiğinde, hızlı ve hassas bir şekilde çalışmak en iyisidir, çünkü şu anda az miktarda oksijen altın hücreye girebilir. Torpido glovebox ayrılmadan önce örnekleme vanakapatılması altın hücrenin iç ortam atmosferi arasındaki değişimi en aza indirmek için iyi bir ilk önlemdir.

Reaktör sallanan cihaza yerleştirildikten sonra, sallanan hareket hızını ~170°/da kin olarak ayarlamak önemlidir. Yüksek basınçlı reaktör çok hızlı hareket ederse, kullanıldığında yerçekimsel etkiler veya tortu veya kaya örneklerinin keskin kenarları nedeniyle altın hücresinin kopması meydana gelebilir.

Bu yöntem ek araştırma alanlarında kullanılabilir. Esnek altın-titanyum reaksiyon hücresi, yüksek basınç ve sıcaklıktaki tepkileri inceleyen^{9 farklı} bilimsel araştırmalar ve yüksek aşındırıcı sıvı lar veya gazlar için kullanılma potansiyeline sahiptir.

Mineral yüzeylerin varlığında 70 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda derin yeraltı yüzeyindeki mikroorganizmalar, yüksek basınç altında bile moleküler hidrojen veya asetat gibi organik asitlerin üretimini uyarabilir¹⁶. Bu ürünler, ve diğer bileşikler, yerinde biyoleaching süreçleri sırasında yüksek mikrobiyal aktivite neden olabilir, bu çalışmada araştırılan kükürt bileşikleri ek olarak.

Uygulamalar sulu sıvılarda gazve iyonların çözünürlüğünün belirlenmesi, hidrotermal havalandırma sistemlerinin koşullarında jeokimyasal reaksiyonlar¹⁷, izotop fraksiyonu^18,CO sırasında jeokimyasal reaksiyonlar nicel ₂ haciz¹⁹, kaynak kayalarda petrol ve gaz oluşumu sırasında abiyotik süreçler²⁰, ve mikrobiyal reaksiyonlar yüzey altı²¹ yüksek basınçlarda bu çalışmada olduğu gibi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Merck	100013
CaN2O6	Fluka	31218
Conax compression seal fittings	Conax Technologies	PG2-250-B-G	sealant could be selected according to temperatures in experiment
Copper paste	Caramba	691301
Copper paste	CRC	41520
CoSO4x7H2O	Sigma	10026-24-1
CrKO8S2x12H2O	Roth	3535.3
CuSO4x5H2O	Riedel de Haen	31293
Disposable cuvettes	Sigma	z330388
Ethanol absolute	Roth	9065.3
FE-SEM	JEOL	model no. JSM-6330F
Ferrozine	Aldrich	180017
Fe2(SO4)3x7H2O	Alfa Aesar	33316
FeSO4x7H2O	Merck	103965
Gold cell	Hereaus GmbH		manufactured according to dimensions supplied by customer
High-pressure reactor	PARR Instruments	model no. 4650 Series	reactors from other vendors could be used, too
High-pressure syringe pump	Teledyne ISCO	DM-100
HCl	Roth	6331.3
HNO3	Fluka	7006
H3BO3	Sigma	B6768
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4	Merck	104873
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C	Applichem	A1052
Light microscope	Leica DM3000
MgSO4x7H2O	Merck	105886
(NH4)2SO4	Sigma	A4418
NaMoO4x2H2O	Sigma	331058
NaO3Sex5H2O	Sigma	00163
NaO3V	Sigma	590088
Na2SO4	Merck	106649
Na2WO4x2H2O	Sigma	72069
NiSO4x6H2O	Sigma	31483
Omnifix Luer	BRAUN	4616057V
pH meter	Mettler Toledo
Redox potential meter	WTW	ORP portable meter
Safe-Lock Tubes, 2 mL	Eppendorf	0030120094
Serum bottle	Sigma	33110-U
Spectrophotometer	Thermo Scientific	model no. GENESYS 10S
Sterican Hypodermic needle	BRAUN	4657519
Stoppers	Sigma	27234
Sulfur powder	Roth	9304
Thoma Chamber	Hecht-Assistent
Titanium parts of reaction cell	Titan-Halbzeug GmbH	121-238	manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH
Titanium valve	Nova Swiss Technologies	ND-5002
Whatman membrane filters nylon	Sigma	WHA7402004
ZnSO4x7H2O	Sigma	Z4750