İnsan Bağırsak Organoidlerinde Lipid Damlacık Oluşumunun Karakterizasyonu ve Niceliği için Floresan Esaslı Bir Test

Özet

Bu protokol yağ asitleri ile stimülasyon üzerine insan bağırsak organoidlerinde lipid damlacık (LD) oluşumunun karakterizasyonu için bir test açıklar. Bu denemenin LD oluşumunun nicelleştirilmesi için nasıl kullanıldığını ve LD oluşumunu etkileyen ilaçlar için yüksek iş elde taramalarda nasıl kullanılabileceğini tartışıyoruz.

Özet

Diyet lipidler bağırsak epitel tarafından serbest yağ asitleri (FAs) olarak alınır. Bu FA'lar hücre içi trigliserid (TG) moleküllerine dönüştürülür, lenfe veya hücre içi depolama için sitozolik lipid damlacıklarına (LD) götürülmek üzere şilomikronlara paketlenmeden önce. LDs oluşumu için önemli bir adım Diacylglycerol ayltransferazların katalitik aktivitesidir (DGAT) TG sentezinin son adımında. LDs toksik lipid türleri tampon ve farklı hücre tiplerinde hücresel metabolizmayı düzenleyen önemlidir. İnsan bağırsak epiteli düzenli lipidlerin yüksek konsantrasyonlarda ile karşı karşıya olduğundan, LD oluşumu homeostaz düzenlemek için büyük önem taşımaktadır. Burada insan bağırsak organoidlerinde en sık görülen doymamış yağ asidi, oleik asit ile uyarılması üzerine LD oluşumunun (LDF) karakterizasyonu ve nicelemesi için basit bir analiz açıklıyoruz. LDF testi, ld'lerin konfokal mikroskopi, floresan plaka okuyucu veya akış sitometrisi ile ölçülmesine olanak tanıyan LD'ye özgü floresan boya LD540'ya dayanmaktadır. LDF analizi insan bağırsak epitel hücrelerinde LD oluşumunu karakterize etmek için kullanılabilir, veya LD metabolizmasını etkileyen insan (genetik) bozuklukları incelemek için, DGAT1 eksikliği gibi. Ayrıca, bu test aynı zamanda yeni terapötik bileşikleri test etmek için yüksek iş lenme boru hattı kullanılabilir, hangi bağırsak veya organoidlerin diğer türleri LD oluşumunda kusurları geri.

Giriş

Lipidler insan diyetinin önemli bir bileşenidir ve sistemik enerji depolama ve metabolizmaönemli bir rol oynamaktadır. Sindirildiğinde, diyet lipidleri pankreas lipazları tarafından serbest yağ asitleri (FFA) ve monogliseritler (MGs) içine bozulur. Bu substratlar daha sonra bağırsak epitelinin enterositleri tarafından alınır, burada ilk olarak monogliserit ayltransferazlar (MGAT) enzimleri tarafından digliseritlere (DG) ve daha sonra diacylrigerolerol tarafından trigliserid (TG) tarafından yeniden esterlenirler. acyltransferaz 1 (DGAT1)¹. Son olarak, bu TGs ya lenf sistemine veya sitosolik lipid damlacıkları (LDs) hücre içi depolama için ihracat için şilomikronlar entegre edilmiştir^2,3. Şilomikronlar diğer organlara diyet lipidleri dağıtmak için gerekli olmasına rağmen, LDs hücre içi yağ depolama önemi tamamen açık değildir. Ancak, LDs bağırsakta düzenleyici bir işlev icra gösterilmiştir, onlar yavaş yavaş bir yemekten sonra dolaşıma lipidler serbest olarak 16 saat⁴. Ayrıca, LDs toksik yağ asidi konsantrasyonlarına karşı korumak için gösterilmiştir, lipolitik koşullar sırasında fare adipositler gibi⁵.

DGAT1 proteini endoplazmik retikulum (ER) membranÜzerinde yer alır ve intestinal epitelde LD oluşumunda önemli rol oynar. DGAT1'deki homozigot mutasyonlar erken başlayan şiddetli ishale ve/veya kusmaya, hipoalbuminemiye ve/veya (ölümcül) protein kaybeden enteropatiye yol açarak yağ alımı üzerine bağırsak yetmezliği ile birlikte, insan lipid homeostazisinde DGAT1'in önemini gösterir. bağırsak epitel^6,7,8,9,10. İnsanlarda DGAT1 eksikliğinin ortaya çıkması nadir olduğundan, primer hasta kaynaklı hücrelere erişim az olmuştur. Ayrıca, bağırsak epitel hücrelerinin uzun vadeli kültür uzun sadece sınırlı bir uzatmak için normal fizyolojisi temsil tümör kaynaklı hücre hatları ile sınırlı olmuştur. Bu nedenle, DGAT1 aracılı LD oluşumu çoğunlukla fibroblastlar veya hayvan kaynaklı hücre hatları^7,10,11,12çalışılmıştır. Bu nedenle, son zamanlarda DGAT1-eksik hasta kaynaklı fibroblastlar oleik asit ile stimülasyon sonra sağlıklı kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında daha az DDs birikir gösterilmiştir (OA)⁸.

Daha önce, protokoller üç boyutlu (3D) organoidler¹³şeklinde herhangi bir gastrointestinal organdan kültür epitel kök hücreleri kurulmuştur. Bu bağırsak organoidleri uzun bir süre kültürde tutulabilir¹³, ve hasta fonksiyonel çalışma sağlar- ve bağırsak konumuna özgü epitel özellikleri¹⁴. Onlar genetik ve fenotipik kararlı ve saklanabilir, uzun vadeli genişleme ve biyobankacılık izin¹³.

Yakın zamanda LD oluşumunun insan bağırsak organoidlerinde ld oluşumunda (LDF)^6'dakolayca ölçülebileceğini gösterdik. 16 saat boyunca OA maruz kaldığında, organoidler lipid kaynaklı toksisite hücreleri korumak için LDs oluşturmak. OA konsantrasyonları çok yüksek olduğunda, hücreler caspase aracılı apoptoz⁶tarafından ölür. LDF tsay daha önce büyük ölçüde DGAT1 bağımlı olduğu gösterilmiştir organoidler DGAT1-mutant hastalardan elde edilen ve DGAT1-spesifik inhibitörleri kullanımı ile gösterildiği^{gibi 6}.

Burada ayrıntılı olarak açıklanan LDF analizi için, 3D organoidler bağırsak biyopsilerinden kültürlenir ve kolayca yeni organoidler oluşturan tek hücrelere bozulma tarafından haftalık olarak geçmektedir. LDF analizini çalıştırmak için, ~7,500 organoid kaynaklı tek hücre 24 kuyulu bir plakanın her kuyusunda kaplanır. Organoidler birkaç gün içinde oluşur, bir gecede 1 mM OA ile kuluçkaya yatırılır ve görüntülemeyi kolaylaştıran floresan hücre geçirilmezLD spesifik boya LD540 ile boyanmıştır. LD oluşumu daha sonra konfokal mikroskopi, floresan plaka okuyucu veya akış sitometrisi ile ölçülür.

96-iyi bir biçimde bu LD oluşumu tahlil ölçekleme olarak, tahlil de insan bağırsak organoid kültürlerde LD oluşumunu etkileyen yeni ilaçlar için ekran ld oluşumunun yüksek iş lenme analizi için kullanılabilir, ya da etkileyen (insan genetik) bozuklukları çalışma LD metabolizması.

Protokol

Burada tanımlanan insan dokuları kullanılarak yapılan tüm deneyler Utrecht Üniversitesi Tıp Merkezi (UMCU) etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Wilhelmina Çocuk Hastanesi (WKZ)-UMCU'daki hastalardan organoidlerin toplanması, üretimi, depolanması ve kullanımı için bilgilendirilmiş onam alındı.

1. Kültür Medyasının Hazırlanması

NOT: Bu protokol bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Organoidler standart hücre kültürü kurallarına göre ele alınmalıdır.

1. Bazal kültür ortamı nı hazırlayın.
   NOT: Büyüme faktörü olmayan kültür ortamına bazal orta (BM) denir.
   1. 5 mL HEPES (1 M), 5 mL L-glutamin (100x) ve 5 mL penisilin-streptomisin (5.000 U/mL) ila 500 mL ileri Dulbecco'nun modifiye kartal orta sını jambon besin karışımı F-12 ile BM ortamını hazırlayın.
   2. Hazırlanan BM ortamını 4 °C'de saklayın ve en fazla 2 ay kullanın.
2. R-spondin ve Noggin koşullu orta (CM) üreticinin protokolüne göre hazırlayın.
   1. Kısaca, flask başına seçici antibiyotik olmadan 555 mL ortamda 5 x 10⁷ hücreleri ile hiperflasklarda istenilen miktarda hücreleri büyümek.
   2. Hücreleri 4 gün boyunca büyütün.
   3. Ortamı 8 gün daha BM ve kültürle değiştirin.
   4. 37 °C'de 8 günlük kültürden sonra, kalan hücreleri peletlemek için 450 x g'de 5 dk kültür ortamı ve santrifüj toplayın.
   5. Filtre supernatant sterilize ve r-spondin veya Noggin CM aliquots saklamak -20 °C maksimum 6 ay boyunca.
3. Boj ve ark.¹⁵göre Wnt3A-CM hazırlayın.
   1. Kısaca, çanak başına seçici antibiyotik olmadan 2x 10⁶ hücreleri 20 mL orta ile 145 mm yemeklerde istenilen miktarda hücreleri büyümek. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için her yemeği plastik folyo ile sarın.
   2. 37 °C'de 8 günlük kültürden sonra, kalan hücreleri peletlemek için 450 x g'de 5 dk kültür ortamı ve santrifüj toplayın.
   3. Filtre supernatant sterilize ve 4 °C'de Wnt3A-CM aliquots saklamak 2 ay maksimum.
4. Organoid genleşme ortamını hazırlayın.
   NOT: İnsan ince bağırsak organoid genişleme ortamı (Ek Tablo 1'dekitarife bakınız) hSI-EM olarak adlandırılır. Aşağıdaki adımlar 1 L hSI-EM'nin son hacmini üretecek ve gerektiği gibi yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir.
   1. 1 M son seyreltme oluşturmak için hücre kültürü sınıf fosfat tamponlu salin (PBS) 12 mL nikotinamid 1.46 g çözünür.
   2. 500 mM son seyreltme oluşturmak için hücre kültürü sınıf PBS 3 mL n-asetil sistein 245 mg çözünür.
      NOT: Bir çözeltioluşumunu hızlandırmak için, nikotinamid ve n-asetil sistein 37 °C'de bir su banyosunda kuluçkaya yatırılabilir. Her iki çözelti de toplu olarak hazırlanabilir, aliquoted ve ileride kullanılmak üzere -20 °C'de saklanabilir.
   3. Filtre steril bir 15 mL tüp içine 0,22 μm filtre ile her iki çözelti sterilize.
   4. Steril 500 mL kültür orta şişesine 167 mL BM ekleyin. 200 mL R-Spondin-CM, 100 mL noggin-CM ve 100 μL rekombinant mEGF (500 g/mL) son konsantrasyonu 50 ng/mL ekleyin.
   5. Sterilize nikotinamid çözeltisinin 10 mL'sini ve sterilleştirilmiş n-asetil sistein çözeltisinin 2,5 mL'sini ekleyin. B27 takviyesi (50x) 20 mL ekleyin.
      NOT: Bu aşamada ortam, WAS olmadan hSI-EM (Wnt3A-CM, A83-01 ve SB202190) olarak adlandırılır ve -20 °C'de depolanabilir. Ortam daha küçük hacimlere ayrılırsa, aşağıdaki adımların konsantrasyonlarını buna göre ayarlayın.
   6. WAS olmadan hSI-EM 500 mL için, Wnt3A-CM koşullarında değişkenlik değişiklikleri en aza indirmek için son taze hazırlanmış toplu 10 mL wnt3A-CM ve ikinci son toplu wnt3A-CM 10 mL ekleyin.
   7. A83-01'i 500 nM'lik son konsantrasyona, SB202190'ı ise 10 μM'lik son konsantrasyona ekleyin.
   8. Hazırlanan hSI-EM'i (WAS ile) 4 °C'de saklayın ve en fazla 2 hafta kullanın.
      NOT: Kriptolar veya tek hücreler kültürlü veya organoidler kriyopreservation başlatıldığında 10 μM (hSI-EM +Y olarak anılacaktır) son konsantrasyonuna ek Y-27632 ekleyin.
5. Floresan aktif hücre sıralama (FACS) tamponhazırlayın.
   1. %10 FCS'lik son konsantrasyon için Ca²⁺/Mg²⁺ olmadan 40 mL'ye 10 mL fetal baldır serumu (FCS) ekleyin.
      NOT: FCS, hücrelerin laboratuvar yazılımına yapışmasını önler.

2. İnsan İnce Bağırsak Organoidleri Için Kültür Prosedürleri

NOT: Bu protokol bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Organoidler standart hücre kültürü kurallarına göre ele alınmalıdır. Organoidler veya organoid kaynaklı hücreler ele alırken, hücreler mümkün olduğunca buz üzerinde tutulmalıdır. Bu sağlandığında hücreler hasat tan sonra birkaç saat canlı kalır. Organoidler standart hücre kültürü kuluçka makinesinde %5 CO₂ile 37 °C'de kültürlenmelidir. Bu koşullar, bu protokol boyunca temel membran matrisine (BMM; yani Matrigel) gömülü organoidler ile tüm kuluçka basamakları için geçerlidir. Yazarlar bu tahliller için duodenum kaynaklı organoidler kullandık.

1. Passaging organoidler
   Not: Her organoid kültürün kendi iki katına zamanı vardır. Normalde, ince bağırsak organoidleri her 7−10 günde bir 1:3−1:5'e kadar geçiş yapılabilir. Tek hücre olarak geçildiğinde, geçiş verimi hücre yoğunluğuna bağlı olarak 1:20'ye kadar olabilir. Kuruluş ve bakım için, organoidler 24 kuyulu plakalar halinde kültürlenir; LDF tsur, ya 24- veya 96-iyi plakalar için.
   1. Hazırlık
      1. 37 °C'de bir kuvözde önceden ısıtılmış 24 kuyulu doku kültürü plakaları, en az bir gecede ve tercihen 5 gün önceden % 5 CO_2.
         NOT: Hücre kültürü kuluçka makinesindeki doku kültürü plakalarının önceden ısıtılmaması, BMM'in organoid içeren damlacıklarının doğru oluşumunu ve bağlanmasını sağlar.
      2. Donma-çözülme döngülerinin sayısını azaltmak için 1 mL bmm alquot hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Organoid geçiş işlemine başlamadan önce en az 30 dk buz üzerinde BMM bir şişe çözülme.
      3. Çamaşır makinesi olarak 50 mL'lik bir BM tüpünü buz üzerinde saklayın.
      4. Bölüm 1.4'te açıklandığı gibi HSI-EM'i hazırlayın ve uygun miktarda hSI-EM+Y hazırlayın, örneğin tam 24 kuyulu bir plaka için 15 mL.
   2. Organoidleri topla.
      1. BMM damlacıklarını rahatsız etmeden kültür ortamını dikkatlice aspire edin.
      2. Organoidlerin ilk kuyusuna 500 μL soğuk BM ekleyin ve P1000 pipet ile hafifçe yukarı ve aşağı boru lar atarak BMM damlacıklarını organoidlerle bozun.
      3. Bu işlemi bir sonraki ortamda da aynı ortamda gerekli olan şekilde tekrarlayın, ancak 500°L BM'de 2'den fazla kuyu hasat etmeyin.
      4. Organoidleri düşük bağlayıcı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte toplayın ve 15−20 s (max. 2.000 x g)için mini bir masa üstü santrifüjde aşağı doğru döndürün. Supernatant'ı tamamen aspire edin ve P200 pipetile ortamın son parçasını çıkarın.
         NOT: Organoidler kültürleri mikroskop altında temiz görünüyor ve herhangi bir ölü hücre veya diğer enkaz içermez, BMM damla adım 2.1.2.2 BM yerine doğrudan trypsin hasat edilebilir. Adım 2.1.2.3'ten sonra, 2.1.3.1 adımda doğrudan kuluçkaya geçin.
   3. Organoidleri tek hücrelere ayırın.
      1. Bükülmüş organoidlere 400 μL tripsin ekleyin. 37 °C'de 5 dk su banyosunda organoidleri kuluçkaya yatırın.
      2. P200 pipetile yavaşça yukarı ve aşağı boru lar atarak hücrelerin kalan toplamlarını bozun. Yine, 37 °C'de bir su banyosunda 5 dakika boyunca organoidleri kuluçkaya yatırın.
      3. 4x büyütme kullanarak mikroskop altında hücre bölünmesinin ilerlemesini kontrol edin. Büyük hücre kümeleri kaldığında manuel bozulma ve kuluçkayı tekrarlayın.
      4. Sadece tek hücreler kaldığında, 1 mL BM ekleyin ve 15−20 s için mini bir masa üstü santrifüj hücreleri aşağı spin.
      5. Supernatant'ı tamamen aspire edin. P200 pipet kullanarak 200 μL taze hSI-EM'deki tek hücreleri yeniden askıya alın. Ek 800 μL hSI-EM ekleyin.
      6. Askıya alınmış hücre sayısını sayın.
         NOT: Yazarların laboratuvarında, ayrıştırılmış organoid hücrelerin manuel olarak saysayımı otomatik bir hücre sayacından daha güvenilir sonuçlar verir. Otomatik bir hücre sayacı kullanıldığında, downstream uygulamaları için hücre yoğunluğu şirket içinde test edilmeli ve çok az veya çok fazla organoid büyürse ayarlanmalıdır.
   4. Bakım veya lipid damlacık oluşumu için tohum organoidler tsay.
      1. Son hücre yoğunluğu için gereken hücrelerin hacmini hesaplayın.
         NOT: Yaklaşık 250 hücre/μL uygun bir yoğunluktadır. 24 kuyulu bir plakada, her kuyuya 30°L, 96 kuyulu bir plakanın her kuyunun içine 5°L tohumlanır.
      2. Uygun süspansiyon hacmini çıkarve yoğunluğu 750 hücre/μL olarak ayarlayın (veya yoğunluk çok düşük olduğunda aşağı doğru döndürün ve askıya alın).
      3. Hücre süspansiyonuna 2:1 oranında BMM ekleyin. Bu karışımdaki son hücre yoğunluğu 250 hücre/μL'dir. Süspansiyonu pipetleme yaparak hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan dikkatlice kaçının.
      4. Önceden ısıtılmış bir doku kültür plakasında, 24 kuyulu bir tabakta kuyu başına üç tane 10 μL damlacık veya 96 kuyulu bir tabakta kuyu başına tek bir 5 μL damlacık tohumlayın.
      5. BMM damlacıklarını katılaştırmak için plakayı 37 °C, %5 CO_2'yi 10−15 dakika bir kuvöze yerleştirin. Bu arada, 37 °C'deki bir su banyosunda uygun miktarda hSI-EM+Y önceden ısıtın.
      6. 24 kuyulu bir plakanın her kuyuya önceden ısıtılmış hSI-EM+Y'yi 500 μL veya 96 kuyulu bir plakanın her kuyusu için 100°L dikkatlice ekleyin. Hücreleri 37 °C, %5 CO₂ ve 2−3 gün sonra bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırın ve 2−3 gün sonra ortamı hSI-EM (Y olmadan) olarak değiştirin ve haftada 2−3 kez yenileyin.
         NOT: 7−10 gün sonra organoidlerin bakım kültürü tekrar geçilmelidir.

3. Lipid Damlacık Oluşumu Tsası

1. Oleik asit konjuge hazırlanması
   NOT: Oleik asit (OA) hidrofobik olduğundan ve suda çözünmediğinden, büyükbaş hayvan serum albuminine (BSA) konjuge edilir. BSA birden fazla yağ asidi molekülleri bağlayabilir ve bu durumda oleik asit bağırsak hücreleri için erişilebilir hale getirmek için 1:8 oranı kullanılır. Serbest yağ asitleri ve BSA hem plastik labware bağlayabilirsiniz. Uygun bir son konsantrasyon sağlamak için, mümkün olduğunca cam şişeleri ve cam pipetler kullanın.
   1. Oda sıcaklığında sıvı oleik asit 0,2 g ağırlığındadır. 1,5 mL kültür sınıfı steril PBS ekleyin ve karışımı 70 °C'ye 1 saat boyunca aralıklı olarak ısıtın.
   2. 5.89 g yağ asidiiçermeyen BSA ağırlığında ve PBS 33.9 mL çözünür. BSA tamamen eriyene kadar karışımı 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın.
   3. Girdap OA karışımı tekrar ince damlacıklar bir emülsiyon oluşturmak ve hemen bir cam pipet kullanarak BSA çözeltisi ekleyin. OA'yı ekledikten sonra son çözeltiyi 37 °C'ye yakın tutun. Son karışım 2.5 mM BSA'da 20 mM OA'dan oluşmaktadır.
   4. Karışımı 37 °C'de 30 dk boyunca açık sarımsı bir solüsyon kalana kadar saklayın.
   5. OA-BSA konjuge en az 6 ay boyunca -20 °C'de dondurulabilir. Bir aliquot eritme üzerine, 37 °C'de kuluçkaya yatırın ta ki bulutluluk eriyene ve karışım tekrar temizlenene kadar.
      NOT: Nihai çözeltinin yüksek protein ve lipid içeriği nedeniyle, karışım sterilize edilemez veya otoklavlanamaz. Bileşenler özenle, mümkün olduğunda laminar akış kaputunda ve steril PBS kullanılarak ele alınınca, yazarlar mikrobiyal enfeksiyonlar yaşamadı.
2. LDF konfokal analizi
   1. Numune hazırlama
      1. Bölüm 2.1'de açıklandığı gibi pasaj organoidleri. Organoid kaynaklı tek hücreleri siyah açık alt 96-iyi plaka içinde tohum.
      2. HSI-EM'deki kültürün 6.
      3. Hücreleri 16−17 h (gece) için 37 °C'de 0,1 μM DGAT1 inhibitörü bulundurun. 2,5 mM BSA araç kontrolü ekleyin.
      4. 16−17 saat sonra, BMM damlacıklarını rahatsız etmeden ortamı aspire edin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyulara 100 μL %4 nötr tamponlu formaldehit ekleyerek organoidleri sabitle.
         NOT: Formaldehit bmm'i kısmen eritecek, organoidler ise dibe batar ve plakanın dibine yapışır.
      5. Formaldehiti hafifçe çıkarın ve kuyuları kuyu başına 150 0L PBS ile dikkatlice yıkayın.
      6. 0.025 mg/mL LD540 ve 4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) pbs ile LDs için hücreleri leke 15 dakika için karanlıkta oda sıcaklığında.
      7. PBS ile kuyuları dikkatlice yıkayın.
         NOT: Protokol gerektiğinde burada duraklatılabilir. Numuneleri 4 °C'de pbs ile kaplanmış olarak karanlıkta saklayın. LD540 boyama bir hafta kadar sabit kalacaktır. Bu töz de canlı hücreler ile yapılabilir, bir süre içinde LD oluşumunu izlemek için. Bunun için fiksasyon protokolünden çıkarılmalıdır ve DAPI'nin Hoechst boyama ile değiştirilmesi gerekir. LD540 açıklanan aynı konsantrasyonda canlı hücrelerde DD'ler leke olabilir.
   2. Konfokal görüntüleme
      NOT: Görüntüleme siyah açık alt 96-well plaka içinde hazırlanan organoid örnekleri üzerinde yapılabilir.
      1. Tüm organoidlerin genel görüntüleri için konfokal floresan görüntüleme için uygun 40x objektif kullanın.
      2. Mikroskobu, DAPI kanalını 405 nm uyarma ve yaklaşık 410−535 nm emisyon dalga boyunda görüntülemek için ayarlayın. LD540 boya için 540 nm (543 nm en uygun) bir uyarma lazer seçin ve emisyon filtreleri 545−700 nm ayarlayın.
         NOT: Bu protokolde beyaz ışık lazeri, akozto-optik ışın ayırıcı (AOBS), 10x/20x objektif ve spektral algılama sistemi ile lazer taramalı konfokal sistem kullanılmıştır. Bu, belirli dalga boylarında tam atonlama sağlar. Karşılaştırılabilir bir sistem yoksa, yukarıdaki özelliklere yakın lazer çizgileri ve kısa/uzun geçişli filtreleri seçin. Tam organoid görüntüleme için, 512 x 512 veya 1024 x 1024 çözünürlüğü aşağı görüntü analizi için yeterlidir.
      3. Yeterli z ekseni çözünürlüğü için iğne deliği boyutunu 1 havadar birime (AU) ayarlayın.
      4. Küresel bir organoidin yarısını görmek için, yaklaşık 85 μm'ye bir z destesi ayarlayın.
   3. Görüntü analizi
      NOT: Görüntü analizi için, Fiji /ImageJ^16,17 maksimum projeksiyonlar oluşturmak için kullanılmıştır. Analiz maksimum projeksiyon, manuel eşik ve parçacık analizi sağlayan herhangi bir görüntü analizi yazılım paketi ile yapılabilir.
      1. Fiji/ImageJ'i kullanarak, her organoidin z-yığınını maksimum projeksiyona dönüştürün: Resim | Yığınlar | Z-projesi.
      2. Maksimum projeksiyon eşiğini, BSA araç kontrol örneğinde görünür LD540 sinyali bulunmayan bir seviyeye ayarlayın: Resim | Ayarla | Eşik. Her görüntüyü eşiğe getirmek için bu ayarları kullanın.
      3. Analiz işlevini kullanarak her maksimum projeksiyon için toplam floresan alanını ölçün | Parçacıkları analiz edin.
         NOT: Bir konfokal mikroskop kullanılarak test çözünürlüğü daha iyi olsa da, bu test aynı zamanda benzer filtrelere sahip floresan plaka okuyucu kullanılarak da analiz edilebilir. Kuyu başına organoid sayısı için normale dönmek için LD540 sinyali DAPI sinyaliile bölünmelidir. Son olarak, ölçümleri normalleştirmek için BSA araç kontrolünün sinyali çıkarılmalıdır. Bu yaklaşım, talın 96 kuyulu plaka biçimine doğru ölçeklendirilmesine olanak sağlar.
3. LDF akış sitometrik analizi
   1. Numune hazırlama
      1. Bölüm 2.1'de açıklandığı gibi pasaj organoidleri. 24 kuyulu doku kültürü plakasında organoid kaynaklı tek hücreleri tohumlayın. Her koşulda iki kuyu akış sitometrisi için yeterlidir.
      2. HSI-EM'deki kültürün 10.
         NOT: Konfokal analizin aksine, 6 gün yerine akış sitometri sitometrisi tahlilleri için EM'de 10 günlük büyüme tercih edilebildi. Ekstra 4 günlük genişleme, mikroskopi tabanlı teşriyi zorlaştıracak optik olarak örtüşen organoidlerle sonuçlanacaktır. Ancak, hücrelerin daha fazla sayıda akış sitometri analizi kolaylaştırır.
      3. Hücreleri 16−17 h (gece) için 37 °C'de 0,1 μM DGAT1 inhibitörü bulundurun. 2,5 mM BSA araç kontrolü ekleyin.
      4. 16−17 saat sonra, bölüm 2.1.2'de açıklandığı gibi organoidleri toplayın.
      5. Bölüm 2.1.3'te açıklandığı gibi organoidleri tek hücrelere ayırın.
         NOT: Kesinlikle gerekli olmasa da, her örnekte hücre sayısını kontrol etmek önerilir. Örnek başına toplam 10.000 hücre sayısı yeterli çözünürlük için gereken mutlak minimumdur. En iyi sonuçlar için 50.000−100.000 hücre kullanın.
      6. Hücreleri 15−20 s için mini bir masa üstü santrifüjde aşağı çevirin.
      7. Her numuneyi 500 μL 0,025 mg/mL LD540 ve PBS'de 1 μg/mL Hoechst ile karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika boyunca lekeleyin.
      8. Hücreleri 15−20 s'ye mini bir masa üstü santrifüjünde döndürün ve PBS ile 3 kat yıkayın.
      9. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 nötr tamponlu formaldehitin 500 μL'lik bir kısmını yeniden sulandırarak sabitleyin.
      10. Hücreleri aşağı spin ve FACS arabellek ile 3x yıkayın.
      11. Hücrelerin tüp duvarına yapışmasını önlemek için FACS tamponu ile önceden durulayın.
      12. 200 μL'lik FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonu önceden durulanmış FACS tüplerine aktarın.
   2. Akış sitometrik analizi
      1. Ölü hücreleri ve hücre kümelerini hariç tutmak için gating parametrelerini ayarlayın (temsili sonuçlar bölümüne bakın).
      2. Son kapılı popülasyonda, güvenilir sonuçlar için en az 10.000 hücreyi ölçün.
         NOT: Bu popülasyondan LD540'ın ortalama floresan yoğunluğu (MFI) ve ortalama SSC-A sinyali hücre başına ld oluşumunun toplam hacminin bir ölçüsünü sağlar.

Sonuçlar

LD oluşumunun doğru analizi için, organoidler OA ve sonraki boyama ile stimülasyon öncesinde çok yoğun tohumlu olmamalıdır. Örtüşen organoidler floresan ile müdahale edebilir, çünkü bu konfokal ve plaka okuyucu okuma için özellikle önemlidir. Uygun organoid tohumlama yoğunluğuna bir örnek(Şekil 1A) ve üst üste binen organoidlere sahip bir kültür gösterilmiştir (Şekil 1B

Tartışmalar

Burada, oleik asit ile kuluçka üzerine insan bağırsak organoidlerinde LD oluşumunu belirlemek için bir protokol sağlar. Bu yöntem LD'ye özgü floresan boya LD540^18'edayanmaktadır, bu da organoid kültürdeki lipid damlacıklarının toplam hacminin karakterizasyonuna ve ölçülmesine olanak sağlar. İnsan bağırsak organoid kültürleri kurmak ve korumak için prosedürler¹³önce yayınlanmıştır , ve bu protokolün görsel bir rehber de mevcuttur

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-028
B27 supplement	Gibco	17504-044
Basement membrane matrix (matrigel)	BD Biosciences	356231
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988)	Tocris Bioscience	4837/10
Fatty acid free BSA	Sigma-Aldrich	A7030
Formaldehyde	Klinipath	4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x)	Gibco	15630-056
HEPES (1 M)	Gibco	15630-080
Laser scanning confocal microscope	Leica	SP8X
LD540			kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF	Peprotech	315-09_500ug
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-100G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells)			MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid	Sigma-Aldrich	O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190)	Sigma-Aldrich	S7067-25MG
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML
PBS without Ca2+/Mg2+	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells)	R&D systems	3710-001-01
TC-treated 24 well plates	Greiner-One	662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates	Corning Life Sciences	353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)	Tocris Bioscience	2939/10
Trypsin (TrypLE Express)	Life Technologies	12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells)			MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor)	Abcam	ab120129-10