JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada embriyonik kök hücrelerden immün uyarıcı granülosit makrofaj kolonisi uyarıcı faktörler taşıyan ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerin izole edilmesine yönelik bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Embriyonik kök hücreler (ESC' ler), kendini yenileyebilen ve her türlü embriyonik hücreye ayırabilen pluripotent kök hücrelerdir. Diğer birçok hücre tipi gibi, ESC'ler de ekzomlar gibi küçük membran vesiklelerini hücre dışı ortama bırakır. Ekzozomlar hücreler arası iletişimin temel arabulucuları olarak hizmet eder ve birçok (pato) fizyolojik süreçte temel bir rol oynar. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) immün yanıtı modüle etmek için bir sitokin olarak işlev eder. Eksozomlarda GM-CSF varlığı, bağışıklık düzenleyici işlevlerini artırma potansiyeline sahiptir. Burada, GM-CSF, ES-D3 numaralı murine ESC hücre hattında bıçaklanarak aşırı ifade edildi. GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinden yüksek kaliteli eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklinleri (EV) izole etmek için bir protokol geliştirilmiştir. İzole ekzozom zenginleştirilmiş EV'ler çeşitli deneysel yaklaşımlarla karakterize edildi. Daha da önemlisi, eksozom zenginleştirilmiş EV'lerde önemli miktarda GM-CSF bulunduğu bulunmuştur. Genel olarak, ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozom zenginleştirilmiş EV'ler, bağışıklık düzenleyici faaliyetlerini uygulamak için hücresiz veziküller olarak işlev görebilir.

Giriş

ESC'ler preimplantasyon embriyosunun blastosist aşamasından türetilir1. Pluripotent kök hücreler olarak, ESC'ler her türlü embriyonik hücreye kendi kendini yenileme ve ayırt etme yeteneğine sahiptir. Olağanüstü gelişimsel potansiyelleri ve uzun vadeli proliferatif kapasiteleri nedeniyle, ESC'ler biyomedikal araştırmalar için son derece değerlidir1. Mevcut araştırma çalışmaları büyük ölçüde DIYABET, kalp hastalığı ve nörodejeneratif hastalıklar 2,3,4dahil olmak üzere çeşitli ana patolojik bozukluklar için ESC'lerin terapötikpotansiyelineodaklanmıştır.

ESC'ler de dahil olmak üzere memeli hücrelerinin hücre dışı ortama değişken boyutlarda veziküller salması bilinmektedir ve bu EV'ler hücreler arası iletişimdeki rolleri nedeniyle birçok fizyolojik ve patolojik işleve sahiptir5. EV'lerin farklı alt tipleri arasında, ekzozomlar, çeşitli hücre tiplerinden, ara endosit bölmelerin, çokvesiküler gövdelerin (MVB'ler) plazma membran6ile füzyonu üzerine hücre dışı boşluğa salınan küçük membran vezikülleridir. Ekzozomların hücreler arası iletişime aracılık yaptığı ve birçok (pato)fizyolojik süreçlerde kritik rol aldığı bildirilmiştir7,8. Ekzozomlar bazı biyolojik işlevleri kendi ebeveyn hücrelerinden miras alırlar, çünkü ekzozomlar proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere sitozolden elde edilen biyolojik malzemeler içerir. Bu nedenle, belirli bir hastalığa özgü immün yanıtı uyarıcı ilişkili antijenler veya faktörler, belirli hücre türlerinden ekzozomlarda kapsüllenir9. Bu, kanser önleyici bir aşı olarak tümör türevi ekzozomları araştıran klinik çalışmaların önünü açtı10.

GM-CSF, farklı bağışıklık hücreleri tarafından salgılanan bir sitokindir11. Ortaya çıkan kanıtlar, GM-CSF'nin bağışıklık sistemini aktive ettiğini ve düzenlediğini ve antijen sunma sürecinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir12. Örneğin, bir klinik rapor GM-CSF'nin tümörlere karşı bağışıklık tepkisini bir aşı adjuvan13olarak uyardığını göstermektedir. KLINIK DENEYLERDE GM-CSF'nin güçlü immün uyarıcı aktivitesini kullanmak için çeşitli GM-CSF tabanlı kanser immünoterapi stratejileri araştırılmıştır14. Bunlar arasında, ışınlanmış GM-CSF salgılayan tümör hücrelerinden oluşan bir kanser aşısı, metastazlı tümörlerde hücresel ve humoral antitümör yanıtları ve sonraki nekrozu indükleyerek ileri melanom hastalarında bazı vaatlerde bulundu15.

ESC'lerden elde edilen ekzozomlar orijinal ESC'lerle benzer biyolojik aktivitelere sahip olduğundan, belki ESC'lerden GM-CSF taşıyan ekzozomlar bağışıklık tepkisini düzenlemek için hücresiz veziküller olarak işlev görebilirim. Bu makalede, GM-CSF'yi ifade eden ESC'lerden yüksek kaliteli eksozom zenginleştirilmiş EV'ler üretmek için ayrıntılı bir yöntem açıklanmıştır. Bu ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler, bağışıklık tepkisini modüle etmek için bağışıklık düzenleyici veziklinler olarak hizmet etme potansiyeline sahiptir.

Protokol

1. ES-D3 hücrelerinin kült örültme

  1. Eksozom içermeyen fetal sığır serumu (FBS) oluşturmak için FBS'yi 4 °C'de 16 saat boyunca 100.000 x g'da ultracentrifuge ve santrifüje yükleyin. Santrifüjlemeden sonra, ES-D3 murine ESC hücre hattını kültleştirmek ve ekzozomla zenginleştirilmiş EV'ler elde etmek için ekzozom içermeyen FBS olarak serum supernatant toplayın.
  2. ES-D3 hücrelerini kaplamadan önce, 15 cm doku kültürü yemeklerini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca jelatin (%0,1) kullanarak kaplayın.
  3. Daha önce açıklanan bir protokol16'nınardından, jelatin kaplı 15 cm doku kültürü yemeklerinde besleyici katman hücreleri olmayan ES-D3 hücrelerini kültürleyin. ES-D3 hücre kültürü ortamı DMEM'den oluşur, ekzozom içermeyen FBS (%15), gereksiz amino asitler (0,1 mM), L-glutamin (2 mM), β-mercaptoethanol (0,1 mM), penisilin (50 birim/mL), streptomisin (50 μg/mL) ve lösemi inhibitör faktörü (LIF; 100 birim/mL). %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de kültür ES-D3 hücreleri.
  4. ES-D3 hücreleri 15 cm'lik doku kültürü yemeklerinde yaklaşık% 90 izdiah ulaştığında, ortamı aspirasyonla çıkarın. Hücreleri tripsin kullanarak yıkayın (%5 mL; %0,05). Yemeklere tripsin (5 mL) ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri bulaşıklardan toplayın.
  5. Trypsin'i devre dışı bırakmak için toplanan hücrelere taze kültür ortamı (5 mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. Hücreleri taze ortamda yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücre numarasını belirleyin.
  6. Hücreleri geçirmek için, ES-D3 hücrelerini (5 x 106)jelatin kaplı (%0,1) 15 cm'lik bir doku kültürü çanağı ile taze orta (15 mL) ve kültür ile 3 gün boyunca plakalayın.
  7. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin izolasyonu için hücre kültürü üstnatantını toplamak için, hücre kültürü süpernatantı toplamadan önce 3 gün boyunca ES-D3 hücrelerini (1 x 107)jelatin kaplı (%0,1) 15 cm doku kültürü kabında taze orta (15 mL) ile tabaklayın.

2. GM-CSF ekspresyon plazmid üretimi

NOT: GM-CSF'yi ES-D3 hücrelerinde aşırı ifade etmek için transfection plazmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP oluşturun. Bu plazmidde, murine GM-CSF cDNA'nın marker proteini ile birlikte renilla reniformis GFP (hrGFP) ifadesi, insan polipeptid zincir uzama faktörü 1α (EF1α) promotörü17,18tarafından tahrik edilir.

  1. Vektör omurgasını oluşturun.
    1. İki DNA parçası oluşturmak için 2 saat boyunca 37 °C'de EcoRI (100 birim) kısıtlama enzimini kullanarak plazmid pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP 'yi (20 μg DNA) sindirin: vektör omurgası (6,0 kb) ve FD3ER kesici ucu (2,5 kb).
    2. Sindirilmiş plazmid DNA'nın (10 μg) %50'sini bir adet 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1 saat boyunca 37 °C'de alkali fosfataz (20 birim) ile tedavi edin. Agarose jel elektroforez (%2) kullanarak hem tedavi edilmemiş hem de defosforillenmiş DNA'yı çözün.
    3. Vektör omurga DNA parçalarını (6,0 kb) DNA jel ekstraksiyon kiti kullanarak arındırın. Tedavi edilmemiş vektör omurgası boş vektör (pEF1α-IRES-hrGFP) görevi görecekken, defosforillenmiş vektör omurgası GM-CSF ifade eden plazmid (pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP) oluşturmak için kullanılacaktır.
  2. GM-CSF cDNA kesici ucu oluşturun.
    1. İki DNA parçası üretmek için 2 saat boyunca 37 °C'de EcoRI(100 birim) kısıtlama enzimini kullanarak plazmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP 19 'u (20 μg) sindirin: vektör omurgası (6,5 kb) ve murine GM-CSF cDNA kesici ucu (474 bp).
    2. Sindirilen DNA'yı agarose jel elektroforezi (%2) ile çözün. DNA jel çıkarma kiti kullanarak murine GM-CSF cDNA parçasını (474 bp) arındırın.
  3. İfade plazmidlerini oluşturun.
    1. DNA ligasyon kiti kullanarak 2 ligasyon reaksiyonunu (10 μL toplam hacim) ayarlayın.
      1. Boş vektör pEF1α-IRES-hrGFP'yi oluşturmak için, işlenmemiş vektör omurgasını adım 2.1.3'ten (6.0 kb; 500 ng) kesin.
      2. pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP oluşturmak için, aşağıdaki DNA parçalarını birleştirir: (1) adım 2.1.3'ten (6.0 kb; 500 ng) ve (2) adım 2.2.2'de (474 bp; 200 ng) oluşturulan mGM-CSF cDNA parçasından defosforillenmiş vektör omurgası.
    2. 5 dakika boyunca 25 °C'de ligat. Liglenmiş DNA'yı DH5α yetkin E. coli hücrelerine dönüştürün. Dönüştürülmüş E. coli hücrelerini karbenisilin (50 μg/mL) içeren LB-agar plakaları üzerine plakalayın.
    3. DNA izolasyon kiti kullanarak plazmidleri tek E. coli kolonilerinden arındırın. Plazmidlerin kimliklerini DNA dizilimi ile doğrulayın.

3. GM-CSF'yi aşırı ifade eden ES-D3 hücrelerinin üretimi

NOT: GM-CS'yi aşırı ifade etmek için ES-D3 hücrelerini plazmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP ile transfect. Plazmid pBabe-Neo'yu ES-D3 hücrelerine kotransfect18,20.

  1. Plazmidleri ES-D3 hücrelerine aktarın.
    1. ES-D3 hücrelerini (1,4 x 106)jelatin kaplı (%0,1) 10 cm'lik doku kültürü çanağı ile transfeksiyon için kültür ortamı (10 mL) ile plakalayın. Kültür kaplamalı ES-D3 hücreleri 37 °C'de 24 saat boyunca.
    2. 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerde iki plazmid karışımı hazırlayın: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, vektör kontrolü) ile pBabe-Neo (4 μg) ve (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, gm-CSF ifade eden) pBabe-Neo (4 μg). Transfection'ı, üreticinin protokolünü izleyerek bir transfection kiti kullanarak gerçekleştirin.
    3. Plazmid karışımlarını içeren her tüpe transfeksiyon ortamı (1 mL) ve transfeksiyon reaktifi (64 μL) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatın.
    4. Transfeksiyon karışımlarını ES-D3 hücrelerinin ilgili 10 cm'lik yemeklerine ekleyin. 5 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    5. 10 cm'lik yemeklerdeki ortamı taze kültür ortamıyla (10 mL) değiştirin. 24 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
  2. Stably transfected ES-D3 hücrelerinin toplu popülasyonlarını oluşturun.
    1. Ortamı transfected ES-D3 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri tripsinle yıkayın (%2 mL; %0,05). Tripsin (2 mL) ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır. Hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve tripsin nötralize etmek için 2 mL taze kültür ortamı ekleyin. 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj.
    2. Transknakte olmuş hücreleri taze kültür ortamında (10 mL) yeniden biriktirin. Üreticinin protokolünü izleyerek floresanla etkinleştirilen hücre sıralamasını (FACS) kullanarak transfected ES-D3 hücrelerinde GFP'nin floresan yoğunluğunu değerlendirin.
    3. Transfected hücreleri taze kültür ortamı (10 mL) içeren iki adet 10 cm'lik yemeklere aktarın. Bulaşmamış hücreleri ortadan kaldırmak için nembilin (0,5 mg/mL) ekleyin.
    4. Transkredaklı hücreleri neomisin (0,5 mg/mL) içeren kültür ortamında kültlü çalışmaya devam edin. Transfected ES-D3% 90 izdiah ulaştığında, hücreleri tekrar 15 cm doku kültürü yemeklerine aktarın. İşlemi 2 hafta boyunca tekrarlayın.
  3. Stably transfected ES-D3 hücrelerinin klonlarını oluşturun.
    1. Stably transfected ES-D3 hücrelerinin toplu popülasyonları oluşturulduktan sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi toplayın. Hemositometre kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. Hücreleri (1 x 107 hücre/mL) taze kültür ortamında yeniden biriktirin.
    2. Hücreleri steril 40 μm hücre süzgecinden filtreleyin. Üreticinin protokolüne uyarak FACS kullanarak GFP pozitif ES-D3 hücrelerini arındırın.
    3. Tek sıralanmış bir ES-D3 hücresini, yenidoğan içermeyen ortamda (200 μL) ebeveyn ES-D3 hücreleri (1 x 103)içeren jelatin kaplı (%0,1) 96 kuyulu doku kültürü plakasının bir kuyusuna plakalayın. Transtransfected ES-D3 hücrelerinin, transtrans enfekte olmayan ebeveyn meslektaşlarıyla birlikte kült halineilmesi, enfekte olmuş tek ES-D3 hücrelerinin tek bir klon olarak hayatta kalmasını ve çoğalmasını sağlar.
    4. Hücreleri 48 saat boyunca kültürleyin ve daha sonra 96 kuyu plakalarına nembilin (0,5 mg / mL) ekleyerek enfekte olmayan ebeveyn ES-D3 hücrelerini ortadan kaldırın.
    5. GFP pozitif ES-D3 hücrelerini 1 hafta boyunca orta boy nemlendiricin (0,5 mg/mL) içeren 96 kuyu doku kültürü plakalarında kültleştirmeye devam edin. Klonal ES-D3 hücre hatlarını 1 hafta boyunca nemlendiricin (0,5 mg/mL) içeren kültür ortamı (5 mL) ile jelatin kaplı (%0,1) 6 cm doku kültürü yemeklerine aktarın.
    6. Üreticinin protokolüne uyarak, FACS kullanarak transfected ES-D3 hücre klonlarının her birinde GFP floresanının yoğunluğunu belirleyin. GM-CSF'yi veya yüksek düzeyde yeşil floresan içeren boş vektörü ifade eden ES-D3 klonlarını seçin.
    7. Üreticinin protokolüne uyarak, bir murine GM-CSF ELISA kiti kullanarak ES-D3 hücreleri tarafından salgılanan GM-CSF miktarlarını belirleyin.

4. Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin izolasyonu

  1. ES-D3 hücrelerini (1 x 107) 15cm doku kültürü yemeklerinde 37 °C'de 72 saat boyunca kültür edin. Hücre kültürü üstnatant toplamak. Mağaza, ekzomal bütünlüğü korumak için 1 haftaya kadar 4 °C'de süpernatant topladı.
  2. Büyük hücre parçalarını yatıştırmak için bir santrifüj kullanarak 4 °C'de 60 dakika boyunca 5.000 x g'da hücre kültürü üstnatantını santrifüj edin.
  3. Bir ultracentrifuge kullanarak 4 °C'de 90 dakika boyunca 100.000 x g'da süpernatant ve santrifüjü toplayın.
  4. Üsttekini çıkarın. Kalan kültür üstnatantı kaldırmak için her peleti fosfat tamponlu salin (PBS; 1 mL) ile iki kez hafifçe durulayın.
  5. Her peleti PBS'de yeniden diritin. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri protein içeriğine göre ölçün5.
    1. Ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV'lerin protein konsantrasyonlarını bicinkoninik asit (BCA) tahlili ile ölçün. ES-D3 hücrelerinden beklenen ekzozom zenginleştirilmiş EV verimi, hücre kültürü süpernatantının yaklaşık 4 μg proteini / mL'dir. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri PBS'de yeniden canlandırın (protein konsantrasyonu: ~6 μg/μL). Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri -80 °C'de saklayın.

5. Eksozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin iletim elektron mikroskopisi ile karakterizasyonu

NOT: İletim elektron mikroskopisi (TEM) 5 kullanarak ESC'lerden izole edilen ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerin bileşimini ve yapısını araştırın5.

  1. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri (3-5 μg/μL) oda sıcaklığında 2 saat boyunca %2 EM sınıfı paraformaldehit konsantrasyonu ile sabitlayın.
  2. Sabit numuneleri (10 μL) karbon destek filmi ile bakır ızgaralara yükleyin. Numuneleri bakır ızgaralarla 1 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından ızgaraları filtre kağıdı ile boşaltın.
  3. Izgaraları üreticinin protokolüne uygun bir boyama çözeltisi ile lekelendirin.
  4. Izgaraları cımbız kullanarak bir filtre kağıdı parçasına aktarın. Izgaraların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasını bekleyin.
  5. Üreticinin protokolüne uyarak bir iletim elektron mikroskobu (50.000x büyütme) kullanarak elektron mikroskopi görüntüleri elde edin.

6. Ekzozom zenginleştirilmiş hücre dışı veziklilerin batı leke analizi ile değerlendirilmesi

  1. Tüm hücre özlerini hazırlayın.
    1. Ortamı 15 cm'lik yemeklerde kültürlenmiş ES-D3 hücrelerinden çıkarın. Hücreleri tripsinle yıkayın (%5 mL; %0,05). Hücrelere tripsin (5 mL) ekleyin. 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın. Hücreleri toplayın ve tripsin nötralize etmek için taze kültür ortamı (5 mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da santrifüj edin. PBS'deki hücreleri yeniden biriktirin.
    2. Hemositometre kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 390 x g'da tekrar santrifüj edin. %0,5 SDS (5.000 hücre/μL) içeren SDS-PAGE yükleme arabelleğindeki hücreleri yeniden kullanın.
    3. Örnekleri% 10 genlikli bir sonicator kullanarak 10 s için sonicate (watt: 500 W; ultrasonik frekans: 20 kHz). Numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
  2. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'lerin lizazlarını hazırlayın.
    1. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri 1,2 μg/μL konsantrasyonda %0,5 SDS içeren SDS-PAGE yükleme tamponunda yeniden kullanın.
    2. Örnekleri% 10 genlikli bir sonicator kullanarak 10 s için sonicate (watt: 500 W; ultrasonik frekans: 20 kHz). Numuneleri 100 °C'de 5 dakika ısıtın.
  3. Proteinleri Batı lekesi ile tespit edin.
    1. Bis-Tris PAGE jelinin her kuyusuna (%4-20) tam hücre özleri (10 μL; 5.000 hücre/μL) ve eksozomla zenginleştirilmiş EV lizazları (10 μL; 1,2 μg/μL) yükleyin. Proteinleri polivinylidene florür (PVDF) membranlarına aktarın.
    2. Membranları uygun primer ve sekonder antikorlarla kuluçkaya yatır. PBS, Ara-20 (%0,2) ve yağsız kuru süt (%10 w/v) içeren şişirme tamponunda antikorları seyreltin (aşağıda belirtilen konsantrasyonlarda).
      1. Aşağıdaki primer antikorları kullanın: anti-Annexin V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-sitokrom c (100 ng/mL), anti-protein disülfit isomerase (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) ve anti-Oxphos COX IV-subunit IV (600 ng/mL).
      2. Aşağıdaki ikincil antikorları kullanın: peroksidaz konjuge keçi anti-tavşan IgG (20 ng/mL) ve peroksidaz konjuge keçi anti-fare IgG (20 ng/mL).
    3. Gelişmiş bir kemimuminesans tespit kiti kullanarak proteinleri tespit edin.

7. ELISA tarafından ekzozomla zenginleştirilmiş hücre dışı veziküllerde GM-CSF konsantrasyonlarının belirlenmesi

NOT: Üreticinin bazı değişikliklerle yaptığı protokolü izleyerek, ELSA tarafından murine GM-CSF için bir kit kullanarak exozom zenginleştirilmiş EV'lerdeki GM-CSF miktarlarını değerlendirin.

  1. ELISA plakasını yakalama antikor ile kapla. Eksozomla zenginleştirilmiş EV'leri (0,6 μg) sadece PBS'de veya PBS + %0,05 Ara-20 (100 μL) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tedavi edin. Kaplamalı ELISA plakasına işlenmiş numuneler ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın.
  2. Örneklere algılama antikorları ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın. Örneklere Avidin-HRP ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatır. Plakayı sadece PBS veya PBS + %0,05 Ara-20 ile yıkayın.
  3. Mikro plaka okuyucuda emiciliği 450 nm olarak ölçerek ekzozom zenginleştirilmiş EV'lerde GM-CSF konsantrasyonlarını belirleyin.

Sonuçlar

GM-CSF, murine ESC'lerde aşırı ifade edilir.
ES-D3 hücrelerinde GM-CSF'yi kesin bir şekilde aşırı ifade etmek için, murine GM-CSF cDNA, pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (Şekil 1A)ifade vektörünü oluşturmak için bir transfeksiyon vektörüne klonlandı. GM-CSF, ES-D3 hücrelerinde transfeksiyon ile aşırı ifade edildi ve geçici olarak transktaklı ES-D3 hücrelerinin yaklaşık% 20'si GFP pozitifti. GM-CSF'yi vey...

Tartışmalar

Bu çalışma, ekozomla zenginleştirilmiş EV'lerin bağışıklık modülatörü etkilerini incelemek için sunulabilen bağışıklık uyarıcı protein GM-CSF'yi taşıyan ekzozom bakımından zenginleştirilmiş EV'ler üretmek için son derece verimli bir yöntem göstermektedir. Çeşitli çalışmalar ekzomların bağışıklık düzenleyici ve anti-tümör fonksiyonları sergilediğini göstermektedir22. Bu nedenle, GM-CSF'yi ifade eden ESC'lerden gelen ekzozomlar da bağışıklık yanı...

Açıklamalar

Kavitha Yaddanapudi, Chi Li ve John W. Eaton ABD patent başvurusunda "Mühendislik embriyonik kök hücre türevli ekzozomları ve kullanım yöntemlerini içeren kompozisyonlar" sundular.

Teşekkürler

İletim elektron mikroskop görüntülerini elde eden Arkadiusz Slusarczyk ve Kentucky Biyomedikal Araştırma Altyapı Ağı'na (KBRIN, P20GM103436) minnettarız. Bu çalışma kısmen NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 ve CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) ve Free to Breathe Research Grant (K.Y.) hibeleri ile desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alkaline phosphate, Calf IntestinalNew England BiolabsM0290SDephosphorylating DNA plasmid
anti-Annexin V mAbSanta Cruz Biotechnologyclone H-3, sc-74438Western blot, RRID:AB_1118989
anti-CD81 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone B-11, sc-166029Western blot, RRID:AB_2275892
anti-cytochrome c mAbSanta Cruz Biotechnologyclone A-8, sc-13156Western blot, RRID:AB_627385
anti-Flotillin-1 mAbSanta Cruz Biotechnologyclone C-2; sc-74566Western blot, RRID:AB_2106563
anti-GAPDH pAbRockland600-401-A33SWestern blot, RRID:AB_11182910
anti-mouse IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31430Western blot, RRID:AB_228307
anti-Oxphos COX IV-subunit IV mAbThermo Fisherclone 20E8C12 A21348Western blot, RRID:AB_221509
anti-protein disulfide isomerase (PDI) pAbEnzoADI-SPA-890Western blot, RRID:AB_10616242
anti-rabbit IgG, goat, peroxidase-conjugatedThermo Fisher31460Western blot, RRID:AB_228341
BCA (bicinchoninic acid) assayThermo Fisher23223Determining protein concentrations
Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%GenscriptM42015Western blot
Carbenicillin, Disodium SaltThermo Fisher10177012Selecting E. coli colonies
Centrifuge, Avanti J-26 XPIBeckman CoulterLow speed centrifugation
Centrifuge rotor, JA-10Beckman Coulter09U1597Low speed centrifugation
Centrifuge bottle, Nalgene PPCOThermo Fisher3120-0500PKLow speed centrifugation
Cu grids with carbon support filmElectron Microscopy SciencesFF200-CuAcquiring electron microscopy images
EcoRINew England BiolabsR0101Digesting DNA plasmid
Enhanced chemiluminescence detection systemThermo Fisher32106Western blot
FACScalibur flow cytometerBecton DickinsonExamining GFP levels of ES-D3 cells
Fetal bovine serumATCCSCRR-30-2020Medium for ES-D3 cells
Fisherbrand Sterile Cell Strainers; Mesh Size: 40μmThermo Fisher22-363-547Filtering ES-D3 cells for FACS sorting
Gelatin (0.1%)Thermo FisherES006BCulturing ES-D3 cells
GM-CSF ELISA kitThermo Fisher88733422Determining GM-CSF concentrations
KnockOut Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumThermo Fisher10-829-018Medium for ES-D3 cells
Leukemia Inhibitory FactorThermo FisherESG1106Medium for ES-D3 cells
L-glutamineVWRVWRL0131-0100Medium for ES-D3 cells
Lipofectamine 2000 transfection reagentThermo Fisher11668019Transfecting ES-D3 cells
Microplate reader, PowerWave XSBioTekDetermining GM-CSF concentrations
MoFlo XDP high-speed cell sorterBeckman CoulterIsolating single ES-D3 cell clones
NEB 5-alpha Competent E. coliNew England BiolabsC2988JGenerating GM-CSF expression plasmid
NeomycinThermo Fisher10-131-035Selecting ES-D3 clones
Non-essential amino acidsThermo FisherSH3023801Medium for ES-D3 cells
Non-fat dry milkThermo FisherNC9022655Western blot
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher31985062Transfecting ES-D3 cells
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Acquiring electron microscopy images
Penicillin/streptomycinVWRsc45000-652Medium for ES-D3 cells
Plasmid pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFPAddgene37270Generating GM-CSF expression plasmid
PVDF membranesMillipore EMDIPVH00010Western blot
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106Generating GM-CSF expression plasmid
QIAquick Gel Extraction Kit (50)QIAGEN28704Generating GM-CSF expression plasmid
Quick Ligation KitNew England BiolabsM2200SGenerating GM-CSF expression plasmid
Transmission electron microscopeHitachiHT7700Acquiring electron microscopy images
TrypsinVWR45000-660Culturing ES-D3 cells
Ultracentrifuge, OptimaTM L-100 XPBeckman CoulterHigh speed centrifugation
Ultracentrifuge rotor, 45TiBeckman Coulter09U4454High speed centrifugation
Ultracentrifuge polycarbonate bottleBeckman Coulter355622High speed centrifugation
UranyLess staining solutionElectron Microscopy Sciences22409Acquiring electron microscopy images

Referanslar

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Sakthiswary, R., Raymond, A. A. Stem cell therapy in neurodegenerative diseases: From principles to practice. Neural Regeneration Research. 7 (23), 1822-1831 (2012).
  3. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  4. Aguayo-Mazzucato, C., Bonner-Weir, S. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews: Endocrinology. 6 (3), 139-148 (2010).
  5. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  6. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Current Biology. 28 (8), R435-R444 (2018).
  8. Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Control Release. 244 (Pt B), 167-183 (2016).
  9. Lindenbergh, M. F. S., Stoorvogel, W. Antigen Presentation by Extracellular Vesicles from Professional Antigen-Presenting Cells. Annual Review of Immunology. 36, 435-459 (2018).
  10. Kunigelis, K. E., Graner, M. W. The Dichotomy of Tumor Exosomes (TEX) in Cancer Immunity: Is It All in the ConTEXt?. Vaccines (Basel). 3 (4), 1019-1051 (2015).
  11. Becher, B., Tugues, S., Greter, M. GM-CSF: From Growth Factor to Central Mediator of Tissue Inflammation. Immunity. 45 (5), 963-973 (2016).
  12. Conti, L., Gessani, S. GM-CSF in the generation of dendritic cells from human blood monocyte precursors: recent advances. Immunobiology. 213 (9-10), 859-870 (2008).
  13. Higano, C. S., et al. Integrated data from 2 randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 3 trials of active cellular immunotherapy with sipuleucel-T in advanced prostate cancer. Cancer. 115 (16), 3670-3679 (2009).
  14. Yan, W. L., Shen, K. Y., Tien, C. Y., Chen, Y. A., Liu, S. J. Recent progress in GM-CSF-based cancer immunotherapy. Immunotherapy. 9 (4), 347-360 (2017).
  15. Dranoff, G., et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (8), 3539-3543 (1993).
  16. Tremml, G., Singer, M., Malavarca, R. Chapter 1, Unit 1C 4, Culture of mouse embryonic stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2008).
  17. Kirsch, P., Hafner, M., Zentgraf, H., Schilling, L. Time course of fluorescence intensity and protein expression in HeLa cells stably transfected with hrGFP. Molecules and Cells. 15 (3), 341-348 (2003).
  18. Zeng, X., et al. Stable expression of hrGFP by mouse embryonic stem cells: promoter activity in the undifferentiated state and during dopaminergic neural differentiation. Stem Cells. 21 (6), 647-653 (2003).
  19. Yaddanapudi, K., et al. Vaccination with embryonic stem cells protects against lung cancer: is a broad-spectrum prophylactic vaccine against cancer possible?. PLoS One. 7 (7), e42289 (2012).
  20. Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods. 33 (2), 95-103 (2004).
  21. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Chapter 3, Unit 3 22, Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , (2006).
  22. Zhang, X., et al. Exosomes for Immunoregulation and Therapeutic Intervention in Cancer. Journal of Cancer. 7 (9), 1081-1087 (2016).
  23. Bunggulawa, E. J., et al. Recent advancements in the use of exosomes as drug delivery systems. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 81 (2018).
  24. Schlesinger, S., Lee, A. H., Wang, G. Z., Green, L., Goff, S. P. Proviral silencing in embryonic cells is regulated by Yin Yang 1. Cell Reports. 4 (1), 50-58 (2013).
  25. Dranoff, G. GM-CSF-based cancer vaccines. Immunological Reviews. 188, 147-154 (2002).
  26. Park, Y. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In Vitro. Development and Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
  27. Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods in Molecular Biology. 690, 31-56 (2011).
  28. Yaddanapudi, K., et al. Exosomes from GM-CSF expressing embryonic stem cells are an effective prophylactic vaccine for cancer prevention. OncoImmunology. 8 (3), 1561119 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmasSay 177ekzozomh cre d veziklinembriyonik k k h creGM CSFimm n uyar ckanser

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır