Fiziksel ve İzotropik Genişleme Yoluyla İnsan Doku Bölümlerinin Nanoskobik Görüntülemesi

Özet

Klinik doku örneklerinin nanoölçekli görüntülemesi hastalık patogenezinin anlaşılmasını iyileştirebilir. Genleşme patolojisi (ExPath), geleneksel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun araştırılması için standart klinik doku örnekleriile uyumluluk için modifiye edilen genleşme mikroskobunun (ExM) bir versiyonudur.

Özet

Modern patolojide optik mikroskopi, klinik örneklerin mikroskobik yapılarını ortaya çıkararak hastalık tanısında önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, temel fiziksel kırınım sınırı geleneksel optik görüntüleme yaklaşımları kullanırken nanoölçekli anatomi ve ince patolojik değişikliklerin sorgulanmasını önler. Burada, hem sabit dondurulmuş hem de formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku dahil olmak üzere klinik primer doku örneklerinin ortak tiplerinin nano ölçekli optik görüntülemesi için genişleme patolojisi (ExPath) adı verilen basit ve ucuz bir protokolü tanımlıyoruz. Bölüm. Bu yöntem, doku örneklerini kimyasal olarak doku-hidrojel melezine dönüştürerek ve fiziksel olarak saf suda birden fazla pulda izole ederek optik kırınım sınırını aşar. Genişleme nedeniyle, daha önce çözülemeyen moleküller ayrılır ve böylece geleneksel optik mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir.

Giriş

Dokuların moleküler organizasyonunun üç boyutlu (3D) bir bağlamda araştırılması, biyolojik fonksiyonlar ve hastalık gelişimi hakkında yeni bir anlayış sağlayabilir. Ancak, bu nano ölçekli ortamlar, en az çözülebilir uzaklığın d α λ / NA ile tanımlandığı konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskopların (200−300 nm) çözünürlük yeteneklerinin ötesindedir. Burada λ ışığın dalga boyu ve NA görüntüleme sisteminin sayısal diyafram (NA) olduğunu. Son zamanlarda, floresan etiketli moleküllerin doğrudan görselleştirme mümkün yeni geliştirilen süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri^1,2,3, uyarılmış emisyon tükenmesi de dahil olmak üzere (STED), foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM), stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM). Bu görüntüleme teknikleri nano ölçekte biyolojik fonksiyon anlayışında devrim yarattı, ancak pratikte, genellikle pahalı ve/veya özel ekipman ve görüntü işleme adımlarına güvenirler, geleneksel optik görüntüleme, belirli özelliklere sahip floroforlar gerektirir (fotoğraf anahtarlama yeteneği ve/veya yüksek fotostabilite gibi). Buna ek olarak, doku örnekleri üzerinde 3D süper çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmek için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir.

İlk olarak 2015⁴yılında tanıtılan genleşme mikroskobu (ExM), şişme polielektrolit hidrojeline gömülü korunmuş numuneleri fiziksel olarak genişleterek nano ölçekli özellikleri (<70 nm) görüntülemede alternatif bir araç sağlar. Burada, anahtar biyomoleküller ve/veya etiketler, kimyasal işleme den sonra izotonik olarak genişletilebilen bir polimer ağa yerinde sabitlenir. Fiziksel genişleme toplam etkin çözünürlüğü arttırdığından, ilgi molekülleri geleneksel kırınım sınırlı görüntüleme sistemleri kullanılarak çözülebilir. Özel sentezlenmiş floresan etiketlerin polimer ağına bağlı olduğu orijinal protokolün yayınlanmasından bu yana⁴, proteinleri (protein tutma ExM veya proExM) doğrudan bağlamak için yeni stratejiler kullanılmıştır^{5, 6},^7,8,9 ve RNA^9,10,11,12 hidrojel için, ve yineleme ile fiziksel büyütme artırmak genişleme¹³ veya adapte jel^{kimyası 8,14,15}.

Burada proExM'in genleşme patolojisi (ExPath)¹⁶olarak adlandırılan ve klinik patoloji biçimleri için optimize edilmiş uyarlanmış bir versiyonunu salıyoruz. Protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE), hemaoksilin ve eozin (H&E) lekeli ve cam slaytlara monte edilmiş taze dondurulmuş insan doku örnekleri dahil olmak üzere klinik örnekleri ExM ile uyumlu bir duruma dönüştürür. Proteinler daha sonra hidrojele sabitlenir ve mekanik homojenizasyon yapılır (Şekil 1)¹⁶. Numunelerin 4 kat lineer genişlemesi ile çok renkli süper çözünürlükte (~70 nm) görüntüler, sadece ~300 nm çözünürlüğe sahip geleneksel konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir ve diğer süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri ile de kombine edilebilir.

Protokol

1. Stok Reaktifleri ve Çözümlerinin Hazırlanması

1. Jelling çözeltisi bileşenlerini hazırlayın.
   NOT: Çözelti konsantrasyonları g/mL (w/v yüzde) olarak verilmiştir.
   1. Aşağıdaki stok çözeltileri yapın: %38 (w/v) sodyum akrilat (SA), %50 (w/v) akrilamid (AA), %2 (w/v) N,N′-methylenebisacrylamide (Bis) ve %29.2 (w/v) sodyum klorür (NaCl). Bileşikleri iki kat deiyonize suda çözün (ddH₂O). Tablo 1'deki tutarları referans olarak kullanın; hazırlanan çözümler gerektiğinde hacim olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Örneğin, %38 (w/v) SA çözeltisinin 10 mL'sini yapmak için, mezun olmuş 10 mL silindire 1,9 g SA ekleyin ve 5 mL'lik bir hacme DDH₂O ekleyin.
   2. Tablo 1'degösterildiği gibi 1,06x konsantrasyonda 9,4 mL monomer çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Bu başlatıcı, hızlandırıcı ve inhibitör eklenmesinden sonra 1x konsantrasyonu neden olacaktır. Monomer stoku 4 °C'de 3 aya kadar veya uzun süreli depolama için -20 °C'de saklanabilir.
   3. Aşağıdaki stok çözümlerini ddH₂O'da ayrı ayrı hazırlayın: Inhibitörün %0,5'ini (w/v) 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametipiperidin-1-oxyl (4HT), jelleşmeyi engelleyen jelleşmeyi engelleyerek jelleşmeyi engelleyerek dokulara % 10 (v/v) amonyum persülfat (APS) ile radikal oluşumu hızlandıran başlatıcı tetrametilenedediamin (TEMED) ve jelleşme sürecini başlatan %10 (w/v) APS.
      NOT: 4HT ve TEMED stok çözümleri 1 mL aliquots olarak hazırlanabilir ve en az 6 ay -20 °C'de saklanabilir. APS'nin uzun süreli depolamadan sonra etkinliğini kaybettiği ve jelling'den hemen önce küçük miktarlarda (<0.1 mL) olarak en iyi şekilde hazırlandığı tespit edilmiştir.
2. 1 M Tris pH 8 (25 mL DDH₂O) 25 mL 1 M Tris pH 8 (3.03 g Tris baz 3.03 g) birleştirerek sindirim tamponu (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] nonionic süraktif, 0.8 M NaCl) hazırlayın , 2.25 g niyonik yüzey aktif madde ve NaCl 23.38 g. Toplam 500 mL hacim için ddH₂O ekleyin.
   NOT: Çözelti gerektiği gibi yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir ve 4 °C'de saklanabilir. Proteinaz K (ProK) sindirim adımıhemen önce eklenecektir.
3. 20 mM sodyum sitrat çözeltisini 2,941 g sodyum sitrat tribasic dihidrat ile 500 mL ddH₂O birleştirerek ve oda sıcaklığında (RT) pH'ı 8,0'a ayarlayarak hazırlayın. Gerektiğinde stok hacmini ölçeklendirin.
4. 6-((akriloyl)amino)heksanoik asit, succinimidyl ester (akriloyl-X, SE; AcX), demirleme bileşeni. AcX'i 500 μL'lik susuz dimetil sülfoksitte (DMSO) 10 mg/mL'lik son konsantrasyonda çözün.
   NOT: Çözelti -20 °C'de 20°L aliquots'ta kurutulmuş bir ortamda saklanabilir.
5. İmmünoboyama için ticari olarak kullanılabilen tamponlar kullanmıyorsanız, engelleme tamponu hazırlayın. %5 (v/v) normal hayvan serumu ve %0,1 (w/v) niyonik yüzey aktif maddeden 1x fosfat tamponlu salin (PBS) bir engelleme tamponu kullanın ve ikincil antikorların ana hayvanına göre serumu seçin. Örneğin, keçide yetiştirilen antikorlar için 500 mL bloke tamponu hazırlamak için 25 mL keçi serumu, 0,45 g niyonik yüzey aktif madde ve 1x PBS ile 500 mL'lik bir hacim birleştirin.

2. ExPath için Arşivlenmiş ve Taze Hazırlanmış Klinik Doku Slaytlarının Hazırlanması

1. Dokuyu ExPath uyumlu bir biçime dönüştürün. Numunenin nasıl hazırlandığına bağlı olarak aşağıdaki dört adımdan birini (2.1.1−2.1.4) seçin: FFPE slaytlar, lekeli FFPE slaytlar veya optimum kesme sıcaklığı (OCT) çözeltisinde sabitlenmemiş veya sabit dondurulmuş doku slaytları.
   NOT: Bunlar patoloji örnekleri için standart kurtarma adımlarını temel alınmaktadır ve ExPath protokolüne özgü değildir.
   1. FFPE klinik örnekleri
      1. %95 etanol, %70 etanol ve %50 etanol olmak üzere 30 mL hazırlayın. 30 mL ksilen, %100 etanol ve ddH₂O ölçün.
      2. Slaydı 50 mL konik konik bir konik olarak yerleştirin ve 15 mL ksilen ekleyin. Tüpü kaplayın ve yaklaşık 60 rpm'de bir orbital shaker üzerine yatay olarak yerleştirin ve her çözelti için 3 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Kalan 15 mL xylene ile tekrarlayın.
      3. %100 etanol, %95 etanol, %70 etanol, %50 etanol ve xilen yerine ddH₂O ile tekrar adım 2.1.1.2.
   2. Lekeli ve monte edilmiş kalıcı slaytlar
      1. 100 mm Petri kabına kaydırıve ksilen ile kaplayın. Bir jilet kullanarak kapak kayslipini dikkatlice çıkarın. Kapak kolayca kaldırılmazsa, kapak kayması gevşeyene kadar kaydırağı ksilene geri döndürün.
      2. FFPE örnekleri için adımları kullanarak işlem (adım 2.1.1.1−2.1.1.3).
         NOT: H&E lekeli slaytlarda genleşme işlemi sırasında lekeler ortadan kalkar.
   3. OCT çözeltisinde düzeltilmemiş dondurulmuş doku slaytları
      1. 10 dakika boyunca -20 °C'de asetondaki dokuyu düzeltin.
      2. Numuneleri 1x PBS çözeltisi ile her biri 10 dakika boyunca 3 kez RT'de yıkayın.
   4. Daha önce sabit, dondurulmuş klinik doku slaytlar
      1. OCT çözeltisini eritmek için slaytları RT'de 2 dakika kuluçkaya yatırın.
      2. Numuneyi RT'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez 1x PBS çözeltisi ile yıkayın.
2. Biçim dönüştürmeden sonra tüm numunelerde antijen alımı için ısıl işlem yapın.
   1. Isıya dayanıklı bir kapta 20 mM sitrat çözeltisi (RT'de pH 8) ekleyin, örneğin slayt boyama kavanozu gibi.
      NOT: Slayta monte edilen dokuyu kapsayacak kadar çözüm olmalıdır (standart bir slayt boyama kavanozu için 50 mL).
   2. Sitrat çözeltisini mikrodalgafırında 100 °C'ye ısıtın ve kaydırağı çözeltiye yerleştirin. Kabı hemen bir kuluçka odasına aktarın ve 60 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slaytlar Petri yemeklerine yerleştirilebilir ve 1x PBS ile kaplanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.
3. Standart immünofloresan (IF)/immünohistokimya (IHC) boyama protokollerini kullanarak numuneyi lekeleyin.
   NOT: Spesifik primer ve sekonder antikor konsantrasyonları ve boyama süreleri üretici tarafından önerilen konsantrasyonlara veya belirli deney için optimizasyona bağlıdır.
   1. Bir hidrofobik kalem doku kapsayacak şekilde gerekli çözelti hacmini en aza indirmek için slayt üzerinde doku bölümü (ler) etrafında bir sınır çizmek için kullanın. Slaytı, kaydırağa sığacak kadar büyük bir tabağa yerleştirin. Standart 3 inç lik bir slayt için 100 mm Petri kabı kullanın.
      NOT: Hidrofobik kalem, numunenin polimerizasyonuna veya sindirim sürecine engel olmaz.
   2. Nonspesifik bağlanmayı azaltmak için 37 °C'de 1 saat, RT'de 2 saat veya 4 °C'de 1 saat boyunca bloke edici tamponile dokuyu kuluçkaya yatırın.
   3. Hazırlanan blokaj tamponu (veya diğer tercih edilen boyama tamponu) uygun miktarda istenilen konsantrasyona birincil antikorları seyreltin. En az 3 saat RT veya 37 °C'de veya gece boyunca 4 °C'de birincil antikor solüsyonu olan dokuları kuluçkaya yatırın.
      NOT: Örnekler, dokunun kurumasını önlemek için nemlendirilmiş bir kapta (nemli silme ile Petri kabı gibi) yerleştirilmelidir. Tipik olarak, antikorlar kullanılan doku büyüklüğüne ve antikora bağlı olarak 200−500 μL tamponda 1:100−1:500'e seyreltilmiştir.
   4. RT'de 10 dakika boyunca 3 kez hazırlanmış bloke tamponu (veya diğer tercih edilen yıkama tamponu) ile dokuyu yıkayın.
   5. Seyreltik sekonder antikorlar (ve 300 nM 4′,6-diamidino-2-fenilindole [DAPI] istenirse), hazırlanan engelleme tampon (veya diğer tercih edilen boyama tampon) yaklaşık 10 g/mL konsantrasyon. Sekonder antikor çözeltisindeki dokuyu RT veya 37 °C'de en az 1 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Zamanlama, kullanılan antikorlar ve doku kalınlığına bağlı olarak ayarlanabilir. Siyanür boyaları içeren sekonder antikorlar (Cy3, Cy5, Alexa 647) ön polimerizasyon uygulandığında ExM protokolü ile uyumlu değildir. Önerilen boyalar Alexa 488 (yeşil), Alexa 546 (turuncu/ kırmızı) ve Atto 647N veya CF633 (uzak kırmızı) içerir. DAPI genişleme işlemi sırasında yıkandığından, genişlemeden sonra yeniden uygulanmalıdır.
   6. Rt'de her biri 10 dakika boyunca 3 kez hazırlanan engelleme tamponu (veya diğer tercih edilen yıkama tamponu) ile dokuyu yıkayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slaytlar Petri yemeklerine yerleştirilebilir ve 1x PBS ile kaplanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.
   7. Geleneksel geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskobu veya tercih eki diğer görüntüleme sistemini kullanarak floresan görüntüleme yapın.
      NOT: Bu adım, genişleme öncesi ve sonrası görüntüleri karşılaştırarak genişleme faktörlerini kullanarak biyolojik uzunluğu belirlemek için gereklidir. Genişleme sonrası görüntülemeyi kolaylaştırmak için, kolayca tanımlanabilir ilgi alanları seçilmeli ve hem düşük hem de yüksek büyütmede görüntüler toplanmalıdır.

3. Numunelerin Yerinde Polimerizasyonunda

1. Numuneyi demirleme çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
   1. Aldehit olmayan fiksatiflerle sabitlenmiş numuneler için 1x PBS'deki AcX stok çözeltisini 0,03 mg/mL konsantrasyona veya aldehit fiksatiflerle sabitlenmiş numuneler için 0,1 mg/mL'ye seyrelterek demirleme çözeltisini (genellikle 250 μL doku bölümünü kapsayacak kadar yeterlidir) hazırlayın , AcX ile reaksiyona daha az ücretsiz aminler var.
   2. 100 mm Petri kabına kaydırığı yerleştirin ve pipet bağlantı çözeltisini dokunun üzerine yerleştirin. RT'de en az 3 saat veya 4 °C'de bir gece kuluçka.
2. Jelling çözeltisi içinde örnekleri kuluçkaya yatırın.
   1. Jelleç çözeltisinin en az 100 kat fazla hacmini hazırlayın. 200 μL başına, sırayla aşağıdakileri birleştirin: 188 μL monomer çözeltisi, 4 μL %0,5 4HT stok çözeltisi (1:50 seyreltme, nihai konsantrasyon: %0,01), 4 μL %10 TEMED stok çözeltisi (%1:50, nihai konsantrasyon 0.2%)ve 4 μL %10 APS stok çözeltisi (1:50 seyreltme, son konsantrasyon %0.2.
      NOT: Jelling çözeltisi kullanılmadan hemen önce yapılmalıdır. Çözelti 4 °C'de tutulmalı ve erken jellemesini önlemek için APS çözeltisi en son eklenmelidir.
   2. Doku bölümünden fazla çözeltiyi çıkarın ve kaydırağı 100 mm'lik petri kabına yerleştirin. Numuneye taze, soğuk jelleçözelti sürün ve karışımı dokuya 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırArak çözeltinin dokuya difüzyonuna izin verin.
3. Jelleme çözeltisini bozmadan, numunenin etrafındaki slaytta bir oda(Şekil 2A) oluşturun.
   1. Bir elmas bıçak kullanarak kapak cam parçaları ince keserek jelleştirici odası için spacers olun.
      NOT: Görüntüleme sonrası genişlemeyi kolaylaştırmak için, spacers doku üzerinde boş jel miktarını azaltmak için doku örneğine kalınlığı yakın olmalıdır. Standart klinik numuneler için 1,5 cam (5−10 μm) kullanılabilir. Kapak cam parçaları kalın numuneler için istiflenebilir.
   2. Su damlacıkları (~10 μL) kullanarak dokunun her iki tarafındaki boşlukları sabitleyin.
   3. Dikkatlice slayt üzerine bir kapak cam kapak yerleştirin, doku üzerinde hava kabarcıkları bindirme önlemek için emin olun(Şekil 2B).
4. Numuneyi 37 °C'de nemli bir ortamda (nemli mendil ile kapalı petri kabı gibi) 2 saat kuluçkaya yatırın.
   NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Slayt haznesi 4 °C'de kapalı bir Petri kabının içinde saklanabilir.

4. Örnek Sindirim

1. Bir jiletkapağının altına yavaşça kaydırarak ve kapak kaymasını jel yüzeyinden yavaşça kaldırarak jelhazonun kapağını çıkarın. Hacmi en aza indirmek için doku etrafında boş jel kırpın. Örnek saydam olacağından, jelhomojenizasyondan sonra jelin yönünü izlemek için jeli asimetrik olarak kesin.
   1. Kullanmadan önce ProK'u sindirim tamponunda (son konsantrasyon 4 U/mL) 1:200 ile seyreltin. Jeli tamamen batırmak için yeterli çözelti hazırlayın; dört kuyulu plastik hücre kültür plakasının tek bir kuyusu, kuyu başına en az 3 mL gerektirir.
   2. Numuneyi 60 °C'de 3 saat boyunca sindirim tamponu içeren kapalı bir kapta kuluçkaya yatırın. Numune sindirim sırasında slayttan ayırmazsa, numuneyi nazikçe çıkarmak için jilet kullanın.
      NOT: Numune, numunenin kurumasını önlemek için sindirim tamponuna tamamen batırılmalı ve filmle kapatılmış kapalı bir kapta (küçük bir kaydırak kutusu, plastik kuyu, Petri kabı vb.) yerleştirilmelidir.

5. Örnek Genişletme ve Görüntüleme

1. Numuneyi istenilen görüntüleme sistemiyle uyumlu ve tamamen genişletilmiş jeli barındıracak kadar büyük bir kapta 1x PBS'ye aktarmak için yumuşak bir boya fırçası kullanın. Doku, ters bir sistemde görüntüleme veya görüntüleme, görüntüleme nin görüntülenmesi durumunda örnek lebirlikte aşağı ya da görüntüleme nin dik bir sistemde görüntülenmesi durumunda, görüntüleme amacından numuneye olan uzaklığı en aza indirgemede olduğundan emin olun. Gerekirse yumuşak bir boya fırçası kullanarak jeli çevirin.
   NOT: Bir LED'den yan aydınlatma, onları sıvı içinde görünür hale getirmek için kullanılabilir. Standart 6 kuyulu bir plaka, önceden genişletilmiş çapı 0,6 cm'den az olan numuneleri barındırabilir. Ters bir sistemde görüntüleme için cam alt kuyu plakası kullanılmalıdır.
2. Numuneleri 10 dakika boyunca RT'de 1x PBS'de yıkayın. İstenirse, sindirim işlemi DAPI lekesini yıkayınca numuneyi 300 nM DAPI ile yeniden lekeleyin. Rt'de 20 dakika boyunca 1x PBS'de seyreltilmiş 300 nM DAPI ile PBS ve lekeyi çıkarın ve ardından RT'de 1x PBS ile 10 dk yıkayın.
   NOT: Numuneler 1x PBS ile kaplanabilir ve bir sonraki adıma geçmeden önce 4 °C'de saklanabilir.
3. Numuneleri genişletmek için PBS'yi değiştirin ve RT'de 10 dakika boyunca her biri için 3−5 kez ddH₂O (en az 10 x son jel hacmi) hacmi fazlalığıile yıkayın.
   NOT: ³ veya⁴ yıkamadan sonra numunenin genişlemesi platoya başlanmalıdır. Depolama için, bakteri üremesini önlemek için, ddH₂O ile takviye edilebilir 0.002%−0.01% sodyum azit (NaN_3). Bu durumda, son genişleme faktörü geri döndürülen% 10 azalır.
4. Geleneksel geniş alan mikroskobu, konfokal mikroskobu veya tercih eki diğer görüntüleme sistemini kullanarak floresan görüntüleme yapın.
   NOT: Jellerin sürüklenmesini önlemek için, fazla sıvı kuyudan çıkarılabilir. Jeller de 1.5−2% düşük erime agarose ile hareketsiz olabilir. Çözelti hacminin 2−4 katı bir kapta suda 1,5−2%(w/v) az erimiş agarose hazırlayın. Çözeltiyi 40 °C'lik bir su banyosunda veya mikrodalgafırında 10−20 s ısıtın ve çözeltiyi eritin. Pipet jel kenarlarında erimiş agarose. Agarose'un RT veya 4 °C'de sertlemesine izin verdikten sonra, dehidratasyonu önlemek için numuneye su ekleyin.

Sonuçlar

Protokol başarıyla uygulanmışsa(Şekil 1),numuneler mekanik homojenizasyondan sonra düz ve saydam bir jel olarak görünür (Şekil 3A) ve suda 3−4.5x faktörüile genişleyebilir (Şekil 3B), kullanılan son genleşme faktörü ve görüntüleme sistemine bağlı olarak ~70 nm etkin bir çözünürlük sağlayarak^5,16.

Tartışmalar

Burada, ffpe, H&E vitray ve cam slaytlar üzerinde taze dondurulmuş numuneler de dahil olmak üzere patolojide kullanılan klinik biyopsi örneklerinin en yaygın türlerine uygulanabilen proExM^5'in bir varyantı olan ExPath^{protokol16'yı}sıyoruz. Biçim dönüştürme, antijen alımı ve örneklerin immünboyamı ExPath'e özgü olmayan yaygın olarak kullanılan protokolleri izler. Orijinal proExM protokolü aksine⁹, ExPath sindirim tampon EDTA da...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-hydroxy-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	Inhibitor
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acetone	Fischer Scientifc	A18-500
Acrylamide	Sigma Aldrich	A8887
Acryloyl-X, SE (AcX)	Invitrogen	A20770
Agarose	Fischer Scientifc	BP160-100
Ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit	Sigma Aldrich	HPA001873
Anti-Collagen IV antibody produced in mouse	Santa Cruz Biotech	sc-59814
Anti-Vimentin antibody produced in chicken	Abcam	ab24525
Aqua Hold II hydrophobic pen	Scientific Device	980402
Breast Common Disease Tissue Array	Abcam	ab178113
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	Nuclear stain
Diamond knife No. 88 CM	General Tools	31116
Ethanol	Pharmco	111000200
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1
FFPE Kidney Sample	USBiomax	HuFPT072
Forceps
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A	Biotium	20020
Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633	Biotium	20121
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind Staining Medium	Active Motif	15253	Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice.
MAXblock Blocking Medium	Active Motif	15252	Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice.
MAXwash Washing Medium	Active Motif	15254	Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice.
Micro cover Glass #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 106
Micro cover Glass #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma Aldrich	M7279
Normal goat serum	Jackson Immunoresearch	005-000-121	For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies.
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish	Thermo Fisher	167063	Multi-well plastic culture dish
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL Conical	Thermo Fisher	339651
Nunc 50 mL Conical	Thermo Fisher	339653
Orbital Shaker
Paint brush
pH Meter
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution	Fischer Scientifc	BP399-1
Plastic Petri Dish (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinase K (Molecular Biology Grade)	Thermo Scientific	EO0491
Razor blade	Fischer Scientifc	12640
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
Sodium acrylate	Sigma Aldrich	408220
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S6191
Sodium citrate tribasic dihydrate	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris Base	Fischer Scientifc	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Wheat germ agglutinin labeled with CF640R	Biotium	29026
Xylenes	Sigma Aldrich	214736