Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

Özet

Bu protokol, Drosophila larva fototaktik davranışını araştırmak için ışık noktası bir test sunar. Bu testte, ışık stimülasyonu olarak bir ışık noktası oluşturulur ve larva ışıktan kaçınma işlemi kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi tarafından kaydedilir.

Özet

Drosophila melanogaster larvaları, yem leme aşamasında açık ışıktan kaçınma davranışı gösterir. Drosophila larva fototaksiler hayvan kaçınma davranışı çalışma için bir model olarak kullanılabilir. Bu protokol larva fototaktik davranışını araştırmak için bir ışık noktası teşp. Deneysel kurulum iki ana bölümden oluşur: ışık noktasını oluşturan bir görsel stimülasyon sistemi ve larva ışıktan kaçınma işlemini kaydeden kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi. Bu teşbit, larvanın ışık noktasını girmeden, karşılaşmadan önce ve ışık noktasından ayrıldıktan sonra izlenmesini sağlar. Yavaşlama, duraklama, baş dökümü ve tornalama gibi larva hareketinin ayrıntıları bu yöntemle yakalanabilir ve analiz edilebilir.

Giriş

Drosophila melanogaster larvaları, yem leme aşamasında açık ışıktan kaçınma davranışı gösterir. Drosophila larva fototaksis, özellikle son 50 yıl içinde¹,^{2,3,4,5,6,7 soruşturma altında olmuştur ,8}. Son yıllarda, 1) larva ışık kaçınma aracılık birçok nöronlar tespit edilmiştir olmasına rağmen^{4,5,9,10,11,12} ve 2) sinapsçözünen larva görme sisteminin komple konektom¹³kurulmuştur , larva fototaksis altında yatan nöral mekanizmalar büyük ölçüde belirsiz kalır.

Larva fototaksilerinin incelenmesinde bir takım davranışsal tahliller kullanılmıştır. Bunlar büyük ölçüde iki sınıfa ayrılabilir: biri uzaysal ışık gradyanlarını, diğeri de zamansal ışık gradyanlarını içeren. Uzamsal ışık degrade ssays için, arena ışık ve karanlık bölümlerin eşit sayıda ayrılır. Arena açık ve koyu yarıya bölünebilir^2,4 veya açık ve koyu dörtlü^14,15, hatta bir dama^tahtası7 gibi alternatif ışık ve karanlık kareler ayrılabilir . Genellikle, agar plakaları mekansal ışık gradyan tsay için kullanılır, ancak alternatif ışık ve karanlık bölümlere bölünmüş tüpler de kullanılabilir^10,14.

Tahlillerin eski versiyonunda, ışık aydınlatması genellikle larvaların altından kaynaklanır. Ancak, yeni versiyonlarda aydınlatma büyük ölçüde yukarıdan kaynaklanır, çünkü larva gözleri (örneğin, bolwig'in düşük veya orta ışık yoğunluklarına duyarlı organları¹⁶⁾opak sefaopharyngeal iskelette bulunan ve açıklıkları olan üst cephe. Bu da larvaları üst cephe yönlerden gelen ışığa karşı daha duyarlı hale^getirir. Zamansal ışık degrade syon için, ışık yoğunluğu arenada mekansal olarak düzgündür, ancak yoğunluk zamanla değişir. Temporal kare dalga ışığına ek olarak (örn. yanıp sönen açık/kapalı veya güçlü/zayıf ışık^3,7), yoğunlukta doğrusal bir rampaya uyan zamansal değişen ışık da larvaların şiddetini ölçmek için⁸ zamansal olarak değişen ışık uyarıcı.

Fototaksit tsay üçüncü bir türü yön ışık scape navigasyon, 45 °⁷bir açıyla yukarıdan aydınlatma içerir. Kane ve ark.⁷çalışmalarından önce, larva sayısı, dönüş sıklığı ve iz uzunluğu gibi kaba parametreler larva fototaksis tahlillerinde hesaplanmıştır. Bu aynı grubun çalışmalarından bu yana, larva fototaksisleri için yüksek zamansal çözünürlüklü video kaydının analizi ile, fototaksis sırasında larva hareketinin ayrıntılı dinamikleri (yani larva gövdesinin farklı kısımlarının anlık hızları, yön başlığı, dönüş açısı ve buna karşılık gelen açısalhız) 7 analiz edilmiştir. Böylece larva fototaksisi davranışının daha fazla ayrıntısı keşfedilebilmiştir. Bu tahlillerde larvalar gruplar halinde test edilir, böylece grup etkileri dışlanmaz.

Bu protokol, bireysel ışık stimülasyonuna larva davranışsal yanıtların araştırılması için bir ışık noktası teşpiği sunar. Ana deneysel kurulum görsel stimülasyon sistemi ve kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi oluşur. Görsel stimülasyon sisteminde, bir LED ışık kaynağı larva test edildiği bir agar plaka üzerinde yuvarlak 2 cm çapında ışık noktası oluşturur. Işık yoğunluğu bir LED sürücüsü kullanılarak ayarlanabilir. Görüntüleme sistemi, kamera için aydınlatma sağlayan üç adet 850 nm kızılötesi LED'e ek olarak larvanın davranışını yakalayan bir kızılötesi kamera içerir. Kameranın merceği, görsel stimülasyon sisteminden gelen ışığın kameraya girmesini engellemek için 850 nm bant geçiş filtresi ile kaplanırken, kızılötesi ışığın kameraya girmesine izin verilir. Böylece görüntülemede görsel uyarılmanın girişime karışması önlenmiş olur. Bu testte, ışık tan önce, sırasında ve girdikten sonra dahil olmak üzere bir süre içinde bireysel larvaların hızlı tepkilerinin davranış detayları kaydedilir ve analiz edilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Drosophila larvalarının hazırlanması

1. Haşlanmış mısır unu (73 g), agar (5,6 g), soya küse (10 g), maya (17,3 g), şurup (76 mL) ve sudan (1000 mL) oluşan standart ortam hazırlayın.
2. 12 h/12 h açık/koyu çevrimli bir odada standart ortamda tüm sinekleri 25 °C'de kaldırın.

2. Agar plakalarının hazırlanması

1. %1.0 agar çözeltisi hazırlayın. Bir denge ile 500 mL beher agar 3 g tartın, sonra distile su 300 mL ekleyin. Suyun buharlaşmasını önlemek için kırıcının üzerine folyo bir kağıt yerleştirin. Kaynamaya bir mikrodalga içinde beher ısı.
2. Kabı alın ve bir cam çubuk ile iyice karıştırın, sonra kaynatın bir mikrodalga fırında ısı. Sıvı tamamen şeffaf ve sıvı olana kadar tekrarlayın.
   NOT: Son sıcak agar çözeltisi hava kabarcıkları ücretsiz olmalıdır; aksi takdirde, agarın plakaya dökülmesi, agar plakasının düzensiz ve ezik yüzeyine neden olur ve bu da sonraki larva davranış testini etkileyecektir. Agar çözeltisinin konsantrasyonu çok yüksek veya düşük olmamalıdır. Konsantrasyon çok yüksekse, agar plakası üzerindeki ışık dağınıkyansıması güçlü olacak ve ışık/karanlık sınırı bulacaktır. Konsantrasyon çok düşükse, larvalar tabakta iz bırakır. Bu hataların her ikisi de daha sonra protcol video işleme engelleyecektir.
3. Sıcak agar çözeltisini yavaşça petri kabına (çap 15 cm) dökün, ta ki alt kısım agar tabakasıyla eşit olarak kaplanana kadar (~4 mm kalınlığında) ve oda sıcaklığında (RT) agar çözeltisi katılaştırılanana kadar.
4. Agar plakası taze olarak hazırlanırken kullanılmalıdır. Değilse, yüzeye bir su tabakası dökün ve daha sonra kullanılmak üzere 4 °C'de buzdolabında saklayın.

3. Görsel stimülasyon sisteminin kurulması

1. LED ışık kaynağını seçin: 470 nm'de harmanlanmış LED mavi ışık veya sıcak beyaz ışık.
   NOT: Işık kaynağı, başka bir dalga boyundaki LED ışıkla değiştirilebilir. Bu denemede, mavi ışık LED bir örnek olarak kullanılır.
2. Rulo alüminyum folyo veya siyah karton kalın bir parça (opaklık sağlamak) 3 cm çapında mavi-ışık LED benzer bir çapa sahip uzunluğu 12 cm açık bir silindir oluşturmak için. Silindirin üst ucunun mavi ışıklı LED'in ön ucunu kaplamasına izin verin. Orta daki küçük yuvarlak delikli (0,5 cm çapında) siyah bir karton ile alt ucunu kapatın. Bu ışık kaynağı sistemi kurulumu oluşturur.
3. Hazırlanan ışık kaynağını bir kliple demir çerçeveye sabitleyin ve LED ışığının masaüstüne doğru yandığından emin olun. Silindiri hafifçe yatırın. Silindir düzlemi ile dikey düzlem arasındaki açı yaklaşık 10°dir (Bkz. Şekil 1). 470 nm mavi LED ışığını yüksek güçlü LED sürücüsünün "LED1" fişe bağlayın. Sürücü açın, kanal 470 nmseçmek için sürücünün sağ üst köşesinde düğmesini açın, sonra LEDtıklatın. Daha sonra, ekran "√" görüntülendiğinde, masaüstünde mavi bir ışık noktası görünür.
   NOT: Silindir küçük yuvarlak deliğe ek olarak ışık sızdırıyorsa, sızıntı yapan parçalarüzerinde siyah bant kullanılması ve sadece deliğin ışığın içinden geçebilmesini sağlaman önerilir.
4. Tamam'ı tıklatın ve ışığın yoğunluğunu ayarlamak için düğmesini çevirin. Daha yüksek bir ışık yoğunluğu50 mA için knob döndürün. Işığın tayfını bir spektrometre ile ölçün ve kaydedin.
5. Işık noktasının çapını 2 cm'ye ayarlamak için ışık kaynağının konumunu yukarı ve aşağı hareket ettirin. Masaüstü daha iyi bir kontrast etkisi için siyah olmalıdır.
6. Deneysel ihtiyaçlara göre ışık yoğunluğunu seçmek için düğümü döndürün. Spottaki maksimum ve minimum ışık gücünü ölçmek, kaydetmek, üç kez ölçmek ve ortalama değeri almak için standart fotodiyahtod güç sensörüne sahip kompakt bir güç ölçer konsolu kullanın.
   NOT: Belirli bir dalga boyunun ışığının ışık yoğunluğunu ölçmek için fotodiyahit güç sensörü kullanılması ve beyaz ışığın ışık yoğunluğunu ölçmek için termal güç sensörü kullanılması önerilir.
7. Ölçülen ışık gücünü sensörün alanına bölerek ışık noktasındaki ışık yoğunluğunu hesaplayın.
   NOT: Örneğin, adım 2,6'da ölçülen ışık gücü 20 pW ve sensörün alanı 0,81 mm²ise, ışık yoğunluğu 24,69 pW/mm² 'dir (20 pW'yi 0,81 mm^2'yeböler).

4. Görüntüleme sisteminin kurulumu

1. Masaüstündeki ışık noktasının yaklaşık 10 cm üzerinde demir şarjörlü yüksek çözünürlüklü bir web kamerayı kenetleyin(Şekil 1).
2. Kamera lensinin masaüstüne doğru yönünü ayarlayın. Usb arabirimi aracılığıyla kamerayı bilgisayara bağlayın.
3. Kameranın hemen altına masaüstüne bir agar plakası yerleştirin.
4. Windows 7 ile bilgisayarda "Amcap9.22" yazılımını açın ve ışık noktası AMcap penceresinde otomatik olarak gösterilir. Işık noktasının pencerenin merkezine yakın olduğundan emin olmak için kamerayı hafifçe sola veya sağa hareket ettirin. Kameranın ışık yolunu engellemediğinden emin olun. Işık noktası tam ve yuvarlak olmalıdır.
   NOT: Yazılım http://amcap.en.softonic.com/ bulunabilir.
5. Kameranın hemen altında 5-7 mm'lik bir klipsle 850 nm ± 3 nm bant geçiş li filtreyi düzeltin.
   NOT: Filtrenin çapı yaklaşık 2,5 cm ve kamera merceği çapı 1 cm'den azdır, böylece filtre kameranın görüş alanını kaplayabilir. Kameranın altındaki filtreyle, ışık noktası AMcap penceresinde görülmemelidir.
6. Agar plakasının etrafına üç kızılötesi ışık üreten LED (merkezi dalga boyu = 850 nm) eşit olarak yerleştirin. Her LED, agar plakasının kenarından yaklaşık 5 cm uzakta olmalı ve LED'in lens yüzü agar plakasına doğru 70° aşağı doğru bir açıyla olmalıdır. LED'leri AC-to-DC dönüştürücü ile güce bağlayın.
   NOT: Çeşitli deneysel denemelerde alanın parlaklığının tutarlılığını sağlamak ve daha sonra video işlemeyi kolaylaştırmak için kızılötesi ışık LED'lerinin konumlarını ve açılarını düzeltmek daha iyidir.
7. Bilgisayar ve aygıt arasına siyah bir tahta koyun. Bilgisayar ekranıışığının denemeyi etkilemesini önlemek için bilgisayar ekranının parlaklığını ayarlayın.
   NOT: Işığın dalga boyunu veya yoğunluğunu ölçerken ortamı karanlık tutun.

5. Görüntüleme parametrelerinin ayarlanması

1. AMcap yazılımının menüsünde Seçenekler | Video Cihazı | Yakalama biçimive yakalanan videopiksel boyutunu ayarlayın 800 x 600 ve kare hızı 60 fps.
2. Filtreyi kameranın altından çıkarın, kameranın altına bir cetvel koyun ve ölçek çizgisini net ve video görüş alanının genişliğine paralel hale getirmek için kamera odağı ayarlayın.
3. Capture'e tıklayın | Kurulum | Kaydetme yolunu seçmek için video yakalama, Kaydet'i Başlat'ıtıklatın, 600 piksele karşılık gelen gerçek mesafeyi kaydedin ve her pikselin gerçek uzaklık oranını hesaplayın.

6. Işıktan kaçınma davranışının video kaydı

1. Tüm deneylerde 25,5 °C'lik bir sıcaklığı koruyun. Gerekirse bir klima ile oda sıcaklığını kontrol edin. Nemlendirici ile nemi sürekli %60'ta tutun.
2. "Lightarea1" adlı ışık nokta konumunun kısa bir videosunu izleyin. Ardından, kamera lensini kapatmak için 850 nm ± 3 nm filtreyi geri taşıyın.
   NOT: Larva davranışı kaydedilirken kamera lensi 850 nm ± 3 nm filtre ile kaplanır, böylece ışık noktası videoda gösterilmez. Işık noktası daha sonra Matlab ile larvalar ile videolar yeniden inşa edilebilir. Kameranın konumunu değiştirmeyin ve her pikselin oranını adım 4.3'te ölçülen gerçek mesafeye değiştirmekten kaçının.
3. Deneysel cihazdan uzakta bir ışığı (örn. bir oda ışığı) açın. Larvalar gözlerle açıkça görülebildiği sürece ışığı mümkün olduğunca alçaltın. Bir kaşıkla kültür ortamı ndan larvaları alın, üçüncü yıldız larvasını nazikçe seçin ve damıtılmış suyla temizleyin. Açlıktan kaynaklanan müdahaleleri önlemek için larvayı teker teker yıkamaya dikkat edin. Tek bir deney de en az 20 larva gerektirir.
4. Larvayı 3.3 adımda kameranın altına yerleştirilen agar plakasının ortasına aktarın. Bir fırçayla larvadan fazla suyu hafifçe çıkarın veya lensin altındaki ışığın yansımasını önlemek için larvadan su çıkarmak için lekeleme kağıdı kullanın. Oda nın ışığını kapatın ve larvanın karanlık ortamda 2 dakika boyunca alışmasını bekleyin.
5. Kızılötesi ışık oluşturmak için LED ışığını açın ve larvayı plakanın ortasına doğru hafifçe fırçalayın. Larva düz sürünmeye başladığında, larvanın ışık noktasına doğru yönelmesi için plakayı döndürün. Baştan düz sürünerek sürüntin, aksi takdirde ışık noktasına erişim elde edemeyebilir.
6. Capture'e tıklayın | Kurulum | Kaydetme yolunu seçmek için video çekimi, ardından kaydetmek için Kaydı Başlat'ı tıklatın. Larvanın ışık noktasına doğru sürünmesine izin verin, ışık noktasına girin ve görüş alanının neredeyse dışına çıkana kadar ışık noktasını bırakın. Kaydı Durdur'utıklatın. Larva yaklaşmadan önce ışık noktasından uzaklaşıyorsa, doğrudan Kaydı Durdur'utıklatın.
7. Filtreyi kameradan uzağa taşıyın. "Lightarea2" adlı ışık noktasının konumunu kısa bir video alın ve ışık noktası konumunun değişmediğinden emin olmak için "lightarea1" ile karşılaştırın. Belirgin bir konum değişikliği gözlenirse, verileri atın.

7. Veri analizi

1. Daha önce açıklandığı gibi¹⁷ görüntü işleme yöntemlerini kullanarak videolardan hayvan gövdesi kontur ve hareket parametrelerini ayıklamak için SOS¹⁷kullanın.
   NOT: Larva hareket hızını ölçmek için headSpeed (larva kafasının hızı), kuyruk Hızı (larva kuyruğunun hızı), orta Hız (iskelet hattının larva orta noktasının hızı) ve cmSpeed (larva merkez hızı) gibi parametreler kullanıldı. HeadTheta (baş-orta nokta ve orta nokta-kuyruk çizgileri arasındaki açı) ve headOmega (headTheta değişen hızı) gibi parametreler larva vücut bükme ve bükme açısal hızını ölçmek için kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Protokole göre, ışık noktası teşbi, 12 h/12 h ışık/karanlık çevrimi olan bir odada standart ortamda 25 °C'de yükseltilen üçüncü yıldız larvasının ışık kaçınma davranışını araştırmak için kullanılmıştır. Tek bir w¹¹¹⁸ larva sıcanda 25.5 °C'de ışık noktası testi kullanılarak test edilmiştir. 460 nm LED tarafından üretilen ışık noktasının ortalama ışık yoğunluğu 0,59 μW/cm²idi. Larva giriş ve ışık nokta çıkarken tüm süreç kayd...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, Drosophila larvalarının ışıktan kaçabilme yeteneğini test etmek için ışık noktası testini sunuyor. Bu teşbit, larvaların girilmeden önce, karşılaşma sırasında ve ışık noktasını terk ettikten sonra davranışlarının izlenmesini sağlar. Larva hareketinin ayrıntıları yakalanabilir ve analiz edilebilir. Işık nokta sıcazarlığı çok basittir ve güçlü pratiktedir. Tüm cihazın maliyeti yüksek değildir. Deneyde, LED ışığı ışık kaynağı olarak kullanılır....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120? Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%