Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması

Özet

Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.

Özet

Primer miyoblastlar iskelet kasının farklılaşmamış çoğalan öncüleridir. Onlar kültürlü ve kas öncüleri olarak çalışılmış veya kas gelişiminin daha sonraki aşamalarında ayırt etmek için indüklenen. Burada sağlanan protokol, genç yetişkin fare iskelet kas ekstrandan mıyoblast hücrelerinin son derece çoğalan popülasyonunun izolasyonu ve kültürü için sağlam bir yöntem tanımlanmaktadır. Bu hücreler farklı fare modellerinin iskelet kasının metabolik özelliklerinin yanı sıra eksojen DNA ile transfeksiyon veya viral ekspresyon vektörleri ile transdüksiyon gibi diğer downstream uygulamalarında da yararlıdır. Bu hücrelerin farklılaşma ve metabolik profil düzeyi maruz kalma uzunluğuna ve miyoblast farklılaşmasını sağlamak için kullanılan ortamın bileşimine bağlıdır. Bu yöntemler fare kas hücre metabolizması ex vivo çalışması için sağlam bir sistem sağlar. Daha da önemlisi, in vivo modellerinaksine, burada açıklanan yöntemler genişletilebilir ve tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde çalışılabilir bir hücre popülasyonu sağlar.

Giriş

Genellikle genel metabolik sağlığın bir göstergesi olarak atıfta bulunulsa da, birden fazla çalışma, yaşlı erişkinlerde vücut kitle indeksi (VKİ) sürekli mortalite yüksek risk ile ilişkili olmadığını göstermiştir. Bugüne kadar, bu popülasyonda azaltılmış mortalite ile tutarlı olduğu gösterilen tek faktör kas^kütlesi1 artmıştır. Kas dokusu vücuttaki insülin duyarlı hücrelerin en büyük kaynaklarından birini temsil eder, ve bu nedenle genel metabolik homeostaz^bakımındakritik 2 . Egzersiz yoluyla iskelet kas dokusunun aktivasyonu hem lokal insülin duyarlılığı hem de genel metabolik sağlık artışlar ile ilişkilidir³. In vivo modelleri kas fizyolojisi ve entegre metabolizma üzerinde kas fonksiyonunun etkisi eğitimi için gerekli iken, miyotüplerin birincil kültürleri hayvan çalışmalarının karmaşıklığını azaltan bir sistem sağlar.

Doğum sonrası kaslardan elde edilen miyoblastlar, çok sayıda tedavi ve büyüme koşullarının etkisini son derece tekrarlanabilir bir şekilde incelemek için kullanılabilir. Bu uzun ve myoblast izolasyon ve kültür için çeşitli yöntemler^4,5,6,7,8,9tarif edilmiştir kabul edilmiştir. Bu yöntemlerden bazıları yenidoğan kasları kullanmak ve miyoblastlar nispeten düşük sayıda verim^5,8, büyük ölçekli çalışmalar için çeşitli hayvanlar gerektiren. Ayrıca, miyoblastların kültüre getirilmesinde en yaygın kullanılan yöntemler, diğer hücre türlerine göre daha az yapışık olan miyoblastlar için zenginleştirmek için "ön kaplama" yöntemini kullanır. Burada açıklanan alternatif zenginleştirme yönteminin, son derece çoğalan miyoblast popülasyonunu zenginleştirmek için çok daha verimli ve tekrarlanabilir olduğunu gördük. Özetle, bu protokol, genç erişkin kas eksperlerinden son derece çoğalan miyoblastların kültür ortamına büyüme yoluyla izolasyonuna olanak sağlamaktadır. Miyoblastlar tekrar tekrar hasat edilebilir, birkaç gün içinde, hızla genişletilmiş, ve miyotüpler içine ayırt etmek için indüklenen. Bu protokol, spontan seğirme miyotüpleri sevese doğru sağlam bir şekilde ayıran çok sayıda sağlıklı miyoblast hücresi üretir. Çeşitli genotiplere sahip farelerin primer miyotubelarında metabolizma ve sirkadiyen ritimleri incelememizi sağladı. Son olarak, 96 kuyulu plakalarda oksijen tüketim oranlarının ölçümlerini kullanarak miyotüplerin oksidatif metabolizma çalışmaları için hazırlanmasına yönelik yöntemleri de sunuyoruz.

Protokol

Bu protokol Scripps Research'ün hayvan bakım yönergelerine uyar.

1. Kas Dokusu Ekstremitelerinin Toplanması ve İşlenmesi

1. Diseksiyondan bir gün önce, tüm diseksiyon ekipmanlarını (forsepsler, jiletler ve makaslar) sterilize edin ve gerekli tüm ortamları hazırlayın: fosfat tamponlu salin (PBS), MB Kaplama ortam (DMEM'in 12,5 mL'si, 12,5 mL HAMS F12, 20 mL ısı yalıtımlı fetal sığır serum (FBS), amniyotik sıvı orta takviyesi 5 mL ve Kaplama Çözeltisi (DMEM 24 mL, HAMS F12 24 mL, kollajen 1.7 mL, matrigel 1 mL).
2. Diseksiyon günü, her kas için kaplama solüsyonu ile bir 6 cm çanak kat diseksiyon edilecek. Her plakanın yüzeyine 2 mL Kaplama Çözeltisi ekleyin, yüzeyde eşit bir kat oluşturmak için hafifçe sallayın ve plakaları 1 saat boyunca 4 °C'de çözeltiyle kuluçkaya yatırın.
3. Kaplama Çözeltisini plakalardan çıkarın ve stok çözeltisine geri dönün.
   NOT: Kaplama Çözeltisi altı aya kadar yeniden kullanılabilir ve 4 °C'de saklanmalıdır.
4. Bağlanmamış kollajen ve matrigel kaldırmak için PBS 2 mL ile iki kez plakaları durular.
5. Diseksiyon sırasında plakaları 37 °C doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
6. Plastik bir torba ya da steril 15 cm çanak içine kalın emici kağıt 2-3 yaprak yerleştirerek nemli bir hazne hazırlayın ve steril su ile kağıt yüzeyini ıslatmak için bir pipet kullanın.
7. Sterilize etmek için 5 dakika boyunca UV ışığı altında oda yerleştirin.
8. İstenilen kasları 4 ila 8 haftalık bir fareden ayırın. Kas dokusunu sterilize etmek için, 40 μg/mL gentamicin içeren PBS'de hafifçe durulayın.
   NOT: Kuadriseps ve gastroknemius kasları için, plaka başına bir kas plaka. Soleus için, plantaris ve EDL, bir tabakta her iki bacak kasları birleştirir.
9. Kası steril 10 cm kaplamasız Petri kabına aktarmak için steril çömleler kullanın. 0.5-1.0 mL kaplama ortamını kas üzerine, doku nemli ama yüzer değil gibi ekleyin (Şekil 1A).
10. Kasları hafifçe küçük parçalara (yaklaşık 1-3 mm³⁾dilimlemek için steril bir neşter veya jilet kullanın.
    NOT: En iyi sonuçlar için kas dokusu işleme en aza indirmek için önemlidir.
11. Kas parçalarını önceden kaplanmış 6 cm'lik bir plakanın yüzeyine aktarmak için forceps veya pipet kullanın. Çok yavaşça doku üzerinde Kaplama Media ek bir 0.8 mL bindirme. Doku parçalarını nemli tutmak için yeterli ortam olmalı ancak yüzer olmamalıdır(Şekil 1B).
12. Kas parçalarını içeren 6 cm'lik tabakları nemli haznenin içine yerleştirin ve 48 saat(Şekil 1C)için bir kuluçka makinesine (37 °C, %5 CO₂₎dönün.
    NOT: Kas parçalarının miyoblast büyümesine izin vermek için plaka yüzeyine yapışması hayati önem taşır. Plakaları/hazneyi en az 48 saat hareket ettirin.
13. 48 saat sonra, kas parçalarının bağlı olduğundan emin olmak için plakaları dikkatlice kontrol edin. Kaplama Media 2 mL ile bindirme, parçaları çıkarmak için değil dikkat.
    NOT: Plakalarda gözle görülür bir kontaminasyon veya enkaz varsa, kas parçalarını dikkatlice yıkayın. Plaka 2 mL PBS / gentamicin çözeltisi plaka kenarında ve ucu hafifçe kas dokusu üzerinde yıkamak için. PBS'yi çıkarın ve yıkama adımını tekrarlayın. İkinci yıkamanın ardından, Kaplama Media'nın 2 mL'lik kaplamasını tamamlayın.
14. Miyoblastları hasat etmeden önce plakaları 37 °C'lik kuluçka makinesinde 3 gün (orijinal diseksiyondan 5 gün) kadar saklayın. Miyoblastların büyümesini her gün kontrol edin.
    NOT: Kas ekstremitelerinden çıkan hücrelerin görünümü değişken ve heterojen olacaktır. Birincil miyoblastlar küçük, yuvarlak ve parlak hücreler olarak görünür. Ancak, bu aşamada ki görünümlerine göre tanımlamak ne gerekli ne de güvenilirdir (Şekil 2).

2. Hasat Outgrowing Myoblasts

1. Hazırlamak ve önceden Sıcak Myoblast Media (DMEM 17.5 mL, HAMS F12 17.5 mL, FBS 10 mL, amniyotik sıvı orta takviyesi 5 mL), tripsin, ve PBS / gentamisin. Coat bir T25 şişesi kas grubu başına Kaplama Solüsyonu ile hasat ediliyor ve adım 1.2'de açıklandığı gibi (Bkz. Tablo 1).
2. Kaplama Media çıkarın ve yavaşça PBS / gentamicin 2 mL ile kas ekstremite durulayın. PBS'yi hızlı bir şekilde çıkarın (bir seferde bir tabak durulayın ve plakanın bu adımda PBS'de olmasına izin vermeyin).
3. 1 mL PBS/gentamicin'i hafifçe ekleyin ve tabağı 37 °C kuluçka makinesine 1 dakika yerleştirin.
4. PBS/hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpte toplamak için P1000 pipet kullanın.
5. Tabağa 1 mL tripsin ekleyin ve 3 7 °C'lik kuluçka makinesine 3 dk. Tripsin/hücreleri toplayın ve PBS koleksiyonuyla birleştirin. Santrifüj tüpüne 8 mL Myoblast Media ekleyin ve karıştırmak için hafifçe ters çevirin.
6. Kas plakalarına 2 mL Kaplama Solüsyonu'nu hafifçe kaplayın ve 37 °C inkübatöre geri dönün.
7. 200 x g3 dakika için bir santrifüj içinde hücreleri içeren santrifüj tüpler spin .
8. Hücre peletinden kaçınmak için dikkatli olmak için ~ 1 mL supernatant aspire. Myoblast Media'yı yavaşça ekleyin (tablo 1'ebakınız) ve hücreleri önceden kaplanmış şişeye aktarın ve 37 °C'lik kuluçka makinesine yerleştirin. Bu P0 hasadı. Mikroskop altında gözlenirse çok az hücre olabilir(Şekil 3).
9. Yukarıda açıklanan hasadı her gün üç defaya kadar tekrarlayın. Üçüncü hasattan sonra ekseleri atın.

3. Çoğalan Miyoblastların Genişlemesi ve Zenginleşmesi

NOT: P0 hasadı heterojen (~%60 miyoblast) olacaktır. Sonraki 2 pasajseçici miyoblastlar hasat pbs kullanın. Daha yapışık hücrelerin çoğu geride bırakılacak ve hızla çoğalan miyoblastlar 2 pasaj içinde ≥95% saf olacaktır. Miyoblastlar kurulduktan sonra, spontan farklılaşmayı önlemek için düşük yoğunlukta tutulmalıdır.

1. Bölüm 2'den ~40-50% konfluent hücrelerden oluşan her T25 şişesi için, 5 mL Kaplama Çözeltisi ile bir Adet T75 şişesi katlayın ve 4 °C'de 1-4 saat boyunca yerleştirin.
2. Kaplama Çözeltisini şişelerden çıkarın ve stok çözeltisine geri dönün. Şişeleri 2 mL PBS/gentamicin ile iki kez durulayın ve 37 °C inkübatöre yerleştirin.
3. P0 myoblast T25 şişelerinden medya aspire. Hücreleri 2 mL sıcak PBS/gentamisin ile kısa bir süre durulayın. Şişeden PBS'yi aspire edin.
   NOT: Bu adımın amacı (3.3) bakteriyel kontaminasyon olasılığını azaltmaktır. Hızlı ve nazik bir şekilde yapılırsa, miyoblast kaybına neden olmamalıdır. İstenirse miyoblast korumasını en üst düzeye çıkarmak için atlanabilir.
4. Miyoblastiçeren her şişeye 2 mL sıcak PBS (tripsin değil) pipet. PBS'li şişeleri 37 °C'lik kuluçka makinesine 3 dakika yerleştirin.
   NOT: Miyoblastlar PBS ile şişelerden kolayca ayırılmalıdır. Bu adımda tripsin yerine PBS kullanmak miyoblast popülasyonunun diğer hücre tipleri ile kontaminasyonunu azaltmak için çok önemlidir.
5. Hücreleri 37 °C'lik kuluçka makinesinden çıkarın ve hücreleri yerinden çıkarmak için şişelerin yan tarafına sıkıca dokunun. Serbestçe yüzen miyoblastlar için hafif bir mikroskop altında kontrol edin.
6. Mataraları bir doku kültürü başlığına dik olarak yerleştirin ve tüm hücrelerin yerinden edilmesini sağlamak için 10 mL Myoblast Media ile şişelerin altını 2-3 kez durulayın.
7. Hücre/ortam karışımını 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Santrifüj 3 dk 200 x g.
8. Hücre peletönlemek için dikkatli olmak, yaklaşık 1 mL ortam aspire. Yavaşça santrifüj tüp için Myoblast Media uygun bir hacim ekleyin ve yavaşça karıştırın.
9. Hücre karışımını yeni T75 şişelerine dağıtın. Her yeni T75 şişesine 10 mL Myoblast Media ekleyin. Hücreleri dağıtmak ve bir gecede 37 °C inkübatöre yerleştirmek için şişeleri yatay olarak hafifçe sallayın.
10. İki gün sonra, PBS ile bir kez daha geçiş, üç T75 şişeiçine her T75 şişesi bölme.
    NOT: Miyoblastların %50-60'tan fazla konfluent olmasına izin vermeyin, çünkü bu onların ayırt edici bir başlangıç yapmasına ve prolifaterif kapasiteyi kaybetmesine neden olur.
11. Ek geçişler için tripsin kullanın. PBS verimleri >%95 miyoblastlarla iki kez geçiş; saflığı daha da geliştirme girişimleri daha da kötü farklılaşmaya yol açma eğilimindedir.

4. Primer Miyoblastların Miyotüplere Farklılaşması

1. Kaplamalı plakalar üzerindeki Myoblast Media'daki P2 plakalı (veya daha sonraki geçit) miyoblastlar (önerilen kaplama ve kaplama hacimleri ve hücre sayıları için Tablo 1'e bakınız). İki veya üç gün sonra, hücreler %70-80 birleştiğinde, ortamı Farklılaşma Ortamına (24 mL DMEM, 24 mL HAMS F12, 1,5 mL ısı inaktive at serumu, 0.5 mL İnsülin-Selenyum-Transferrin) değiştirin.
2. Primer miyoblastların miyotüplere farklılaşması sırasında farklılaşma ortamını her gün değiştirin. Farklılaşma genellikle Gün 4-5 tarafından tamamlanır ve kendiliğinden seğirme uzatılmış, erimiş hücreler tarafından işaretlenir. 6 gün içinde farklılaştırılmış miyotüpler üzerinde deneyler yapın. Genellikle hücreler farklılaşmayı başlattıktan beş veya altı gün sonra test edilir.

5. 96 kuyulu Plakalarda Miyoblastlarda veya Miyotubelarda Oksijen Tüketim Oranının Ölçülmesi

1. Her kuyuda 25 μL kaplama çözeltisi içeren 96 kuyulu plakalar. Herhangi bir kabarcıkları kaldırmak için 1 dk için 58 x g plakaları santrifüj.
2. 4 °C'de 1-4 saat kaplama çözeltisi içinde plakaları kuluçkaya yatırın. Kaplama çözeltisini çıkarmak için çok kanallı pipet kullanın ve 25 μL soğuk PBS/gentamisin'de üç kez yıkayın. Hiçbir kabarcıklar sıkışıp olduğundan emin olmak için bu yıkar en az bir santrifüj.
3. Her kuyuya 40 μL Farklılaştırma Ortamı ekleyin. Kabarcıkları önlemek ve ortam tek düze bir tabaka almak için yüzey gerilimini kaldırmak için 58 x g 1 dakika boyunca hiçbir hücre ile kaplı plaka üzerinde medya santrifüj.
4. Her kuyuya 40°L ek bir ortamda asılı olan hücreleri ekleyin. 58 x gtekrar spin .
   NOT: Kaplama tutarlılığı en iyi sonuçlar için önemlidir ve iyi başına kaplanmış hücre sayısı her deneysel kurulum için optimize edilmelidir, ve büyük olasılıkla ~ 10,000-25,000 miyoblastlar aralığında olacak 96-iyi plaka iyi başına farklılaşma medya plakalı.
5. Farklılaşma sırasında medyayı günlük olarak hafifçe değiştirin. Ortamı aspire etmeyin, daha çok bir pipet ile kaldırın, hücreleri sökme veya havaya maruz önlemek için arkasında küçük bir hacim bırakarak. Örneğin, aynı anda 80 μL yerine üç tekrar için bir seferde 50 μL değiştirin.
6. Koşul başına 8-15 kuyu kullanın. Hücreler tek tip bir miyotüpler tabakası oluşturmuyorsa bazı kuyuları atlamak gerekebilir.
   NOT: Onlar buharlaşma için son derece duyarlı olduğu için plaka kenarlarında kuyular atlayın. Sistematik hatalardan kaçınmak için deneysel çoğaltmalar için plaka kurulumünü değiştirin.
7. Tam farklılaşmadan sonraki 1-2 gün içinde farklılaştırılmış miyotüplerde istenilen titreyi yapın (Diferansiyasyonun başlangıcından itibaren 4-6. gün). Oksijen tüketim oranlarının ölçülmesi için önerilen aletler ve reaktifler Malzemeler Tablosu'ndalistelenmiştir.

Sonuçlar

Sağlanan protokolün Bölüm 1'inden sonra, standart bir ışık mikroskobu altında görülebilecek eksplants'lerden çıkan birincil hücreler sağlamalıdır(Şekil 2). Heterojen bir hücre popülasyonu dışarı büyüyen ve her kas dokusu ekstrüzyon çevreleyen görülecektir. Miyoblastlar küçük, yuvarlak, parlak küreler olarak görünür. Protokolün 2. Protokolün 3. Protokolün Bölüm 4'ü takip ederek daha fazla d...

Tartışmalar

İskelet kası metabolik homeostazın kurulması ve bakımı için hayati önem taşımaktadır^11. Kas fizyolojisi çalışması, bireyler arası değişkenlik ve özellikle insan çalışmaları söz konusu olduğunda örnek almada güçlük nedeniyle karmaşıktır. Kültürlü primer miyotüpler kas fizyolojisi birçok özelliği recapitulate gösterilmiştir, kalsiyum homeostaz dahil¹², hasarlı kas dokusunun rejenerasyon⁵, egzersiz yanıt metabo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coating Solution:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL
Collagen	Life Technologies	A1064401	1.7 mL
Matrigel	Fisher	CB40234A	1 mL
Plating Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 12.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Myoblast Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 17.5 mL
Heat Inactivated FBS	Life Technologies	16000044	10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 min
Amniomax	Life Technologies	12556023	5 mL
Differentiation Media:
DMEM	Gibco	10569010	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL
HAMS F12	Lonza	12-615F	Always add gentamicin (1:1,000 by volume) prior to use; 24 mL
Heat Inactivated Horse Serum	Sigma	H1138	1.5 mL
Insulin-Selenium-Transferrin	Life Technologies	41400045	0.5 mL
Other Materials:
PBS	Gibco	14040133
Gentamicin	Sigma	G1397
TrypLE	Gibco	12604013
DMSO	Sigma	472301	Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells
Forceps	Any
Razor Blades	Any
Scissors	Any
Whatman paper	VWR	21427-648
60 mm plate	VWR	734-2318
10 cm plate	VWR	25382-428 (CS)
T25 Flasks	ThermoFisher	156367
T75 Flasks	ThermoFisher	156499
Centrifuge Tubes (15 mL)	BioPioneer	CNT-15
Oxygen Consumption Rates:
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent	Seahorse XFe96 Analyzer	Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent	102416-100	96-well plates for use in XFe96 Analyzer
Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit	Agilent	103015-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate	Agilent	102720-100	components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below
Palmitic acid	Sigma	P5585-10G	for measurement of fatty acid oxidation
Carnitine	Sigma	C0283-5G	for measurement of fatty acid oxidation
Etomoxir	Sigma	E1905	for measurement of fatty acid oxidation
BSA	Sigma	A7030	used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation