JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolün amacı, DNA origami nanoyapılar üzerinde moleküler motor toplulukları oluşturmak ve toplam iç yansıma floresan mikroskopisi kullanarak topluluk hareketliliğini gözlemlemektir.

Özet

Sitoskelet motorları ökaryotik hücrelerde mitoz, kargo taşımacılığı, hücresel hareketlilik ve diğerleri dahil olmak üzere çok çeşitli fonksiyonlardan sorumludur. Bu işlevlerin çoğu, motorların topluluklar halinde çalışmasını gerektirir. Bireysel sitoskeletel motorların mekanizmaları hakkında bilgi zenginliğine rağmen, motor topluluklarının mekanizmaları ve ortaya çıkan davranışları hakkında nispeten daha az bilgi sahibi dir. motor numarasını, konumunu ve yapılandırmayı değiştirme. Yapısal DNA nanoteknolojisi ve DNA origamisinin özel tekniği, motor toplulukların iyi tanımlanmış mimarilerinin moleküler yapılışı sağlar. Yük yapılarının şekli, motorların tipi, sayısı ve yapısıüzerindeki yerleşimleri kontrol edilebilir. Burada, bu toplulukların üretilmesi ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanılarak gözlemleme için ayrıntılı protokoller salıyoruz. Bu teknikler özellikle sitoskelet motorlar için uygulanmış olsa da, bu yöntemler görevlerini yerine getirmek için kompleksler halinde biraraya gelen diğer proteinleriçin genelleştirilebilir. Genel olarak, motor proteinlerin iyi tanımlanmış topluluklar oluşturmak için DNA origami yöntemi acil hareketli davranış yol mekanizmaları diseksiyon için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

Dynein ve kinesin ökaryotik hücrelerde sayısız fonksiyonlardan sorumlu sitoskeletal motor proteinlerdir1. ATP hidroluzunun kimyasal enerjisini verimli bir işe dönüştürerek, bu motorlar çeşitli hücre içi kargoları taşımak ve dağıtmak için mikrotübüller üzerinde transren. Ayrıca mitoz bölünmeile ilişkili büyük hücre içi yeniden düzenlemeleri koordine, onlar konumlandırma ve kromozomların ayrılmasına katkıda bulunan düzenlenmiş kuvvetler sergiler. Yapısal, biyokimyasal ve biyofiziksel tahliller, tek molekül gözlemleri de dahil olmak üzere, bireysel düzeyde bu motorların mekanizmaları ortaya koymuştur (öncekiçalışmalardaiyi gözden 2,3,4). Ancak, motorların görevlerinin çoğu, benzer ve karma motor tiplerinde küçük topluluklar halinde çalışmalarını gerektirir. Nispeten daha az bu toplulukların faaliyet ve nihai acil hareketlilik koordine mekanizmaları hakkında anlaşılmaktadır5,6. Bu bilgi boşluğu, kısmen, motor türü ve kopya numarası gibi denetlenebilir özelliklere sahip topluluklar oluşturmadaki güçlüklerden kaynaklanmaktadır. Son on yılda, DNA origami moleküler inşaat teknikleri bu sorunu çözmek için istihdam edilmiştir. Mikrotübül bazlı motorlar için, bu araştırmaların bazı örnekleri sitoplazmik dinamin topluluklarının tek molekülgözlemleri içerir-17,8,9, intraflagellar dynein11, çeşitli kinesin motorları12,13, ve hem dyneins ve kinesin karışımları7,14,15. Burada,maya7,16,17, 18,19,20, motorların saflaştırma ve oligonükleotid etiketleme ayrıntıları nı sağlamak katlanır ve tunable uyum ile segmentli DNA origami saflaştırma8, ve şasi yapıları itici maya motorların görüntüleme7,18.

In vitro tek molekül gözlem için motor toplulukları inşa üç birincil çaba gerektirir. Bunlardan ilki, DNA origamisine bağlanmaya uygun motor yapılarının ekspresyonu, saflaştırılması ve etiketlenmesidir. İkincisi, tanımlanmış DNA origami yapılarının üretimi ve saflaştırılmasıdır (genellikle "şasi" olarak adlandırılır). Ve üçüncüsü ise motorların şasi yapısına çekimi ve ardından toplam iç yansıma floresansı (TIRF) mikroskopisi kullanılarak gözlemlenmesidir. Burada, maya Saccharomyces cerevisiae7,16,17,18arındırılmış rekombinant mikrotübül bazlı motorlar için bu süreç için kurulan protokoller sağlamak, 19. DNA origami tabanlı motor topluluklar hem rekombinant kinesin15 ve dynein7,8,18 yapılar bu maya ifade sistemi16 üretilen kullanılarak araştırılmıştır ,17,18,19. Bu protokol, galaktoz indüklenen organizatör tarafından kontrol edildikleri ve saflaştırma (ZZ ve TEV proteaz bağlayıcısı) ve DNA oligo çekimi (SNAPtag) için aynı protein etiketlerine kaynaşmış olmaları göz önüne alındığında, bu yapılar için geçerlidir.

Belirli maya suşları belirli motor yapılar üretmek. Örneğin, kargo uyumunun rolünü incelemek için kullanılan dynein, RPY10847,8'denarındırıldı. Genel olarak, ekspresyon ve arınma için uygun genetik modifikasyonlar ile motor yapıları içeren suşlar, bu motorların kullanımını yayınlayan laboratuvarlardan istenebilir. Mutasyonlar veya etiketler gibi yeni özelliklere sahip yapılar lityum asetat dönüşümü21 ve ticari kitleri gibi rekombinant genetik teknikler kullanılarak yapılabilir. Tek moleküllü çalışmalar için mayamodi motor proteinleri oluşturmak için ayrıntılı protokoller yayınlanmıştır19. SNAPtag'a kaynaşmış motorlara ek olarak, motorları etiketlemek için kullanılan oligolar SNAP substratı benzilguanine (BG) konjuge edilmelidir; daha önce yayınlanan protokoller oluşumu ve BG-oligo conjugates arıtma açıklar18. Burada açıklanan genel strateji de aktin bazlı motorlar için istihdam edilmiştir (örnekler için önceki çalışmalara bakın22,23,24), ve diğer organizmalar ve ifade sistemlerinden arındırılmış motorlar (önceki bakınız örnekler için çalışır7,9,10,11,12,13,14).

Polimerize mikrotübüller (MTs) bu deneylerde iki farklı prosedürde kullanılmaktadır. Fonksiyonel motorların MT arinatifliği diğer fonksiyonel gruplarla etiketlenmeyen MT'ler gerektirirken, motor-topluluk hareketliliği TIRF tsayı biotin ve floroforlarla etiketlenmiş MT'ler gerektirir. Her durumda, MTs denatürasyonu önlemek için taxol ile stabilize edilir. MT yakınlık saflaştırma adımı, yüksek MT afinitesine sahip hareketli olmayan motorları kaldırmak için kullanılır, çünkü bu motorlar bir şasiye konjuge edilirse topluluk hareketliliğini değiştirebilir. Bu işlem sırasında, aktif motorlar MT'leri bağlar ve çözeltide kalır, sıkı bağlayıcı motorlar MT peletinde aşağı doğru döner. Bu, şasi üzerindeki tüm motorların aktif bir popülasyondan olmasını sağlamaya yardımcı olur.

Dna origami yapıları çeşitli sitosiskelet motor toplulukları çalışma için kullanılmıştır. Topluluk taşımacılığının mekanistik anlayışı arttıkça, deneylerde kullanılan DNA origami yapıları karmaşıklık içinde büyümüştür. Prensip olarak, herhangi bir yapı motorlar ve floroforlar için tek iplikli DNA eki siteleri içerecek şekilde modifiye edilmesi koşuluyla bu amaca uyarlanabilir. Belirli şasi tasarımları ve özellikleri motor topluluklarının acil davranışı hakkında belirli soruları araştırmak için yararlı olabilir. Örneğin, sert çubuklar kopya numarası nın dyneins ve kinesin takımları tarafından ulaşımı nasıl etkilediği ne kadar temel bilgi geliştirmek için kullanılmıştır7,15,18, ve 2D platformlar miyozin topluluğu nu incelemek için kullanılmıştır actin ağları nın navigasyon22. Değişken veya sabit esnekliğe sahip yapılar, motorlar arasındaki elastik bağlantının rollerini anlamak ve adımlama senkronizasyonunun hareketliliği nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılmıştır8,24. Daha yakın zamanlarda, küresel yapılar motor-parça bağlama geometrik kısıtlamaları hareketlilik25dinamiklerini nasıl etkilediğini içgörü kazanmak için kullanılmaktadır.

Bu protokolde, değişken rijitliğe sahip parçalı şasi üzerinde topluluk deneyleri için belirli adımlar sunuyoruz. Şasi üzerindeki bağlama siteleri bazen "kulplar" olarak adlandırılırken, bu kolları bağlayan tamamlayıcı DNA dizilerine "antihandles" denir. Bu şasi üzerindeki motor sayısı, segmentlerin oligo etiketli motorlarda antihandle oligo'ya tamamlayıcı olarak genişletilmiş sap zımbaları içerdiği ne göre belirlenir. Farklı segmentlerde farklı tutamaç dizilerinin kullanılması, farklı tipteki motorların şasi üzerindeki belirli konumlara bağlanmasına olanak tanır. Burada ayrıntılı şasi 7 sıralı sert segmentleri oluşur, her biri oluşan 12 çift iplikli DNA helikler 2 eşmerkezli halkalar8düzenlenmiş . Rijit segmentler motor tutamaçları içerir ve "bağlayıcı" zımbaların yokluğuna veya varlığına bağlı olarak esnek tek iplikli DNA veya çift iplikli DNA olabilecek bölgeler aracılığıyla bağlanır. Şasi yapısının uygunluğu böylece bu "bağlayıcı" zımbaların varlığı veya yokluğu ile belirlenir. Daha fazla bilgi ve belirli DNA dizileri8için önceki raporlara bakın. Buna ek olarak, birden fazla yöntem şasi26arındırmak için kullanılabilir. Rate-zonal gliserol gradyan santrifüj yöntemi27 burada açıklanmıştır.

Protokol

1. Galaktose indüklenen bir organizatör tarafından kontrol edilen motor proteinlerin büyümesi, ekspresyonu ve hasadı

  1. Maya-pepton-dekstroz (YPD) kültür plakası ve steril aşıçubuğu kullanılarak, 30 °C'de 3-4 gün boyunca dondurulmuş maya ve kuluçka makinesi istenir.
  2. Kültür büyüme günü 1: Öğleden sonra, 1 "çapı cam kültür tüpü için% 2 dekstroz ile YP kültür medya 10 mL ekleyin ve plaka tek bir koloni ile aşılamak. Bir gecede 30 °C'de hızla dönen bir silindir tamburda büyüyün.
  3. 2. Gün: Öğleden sonra, 10 mL'lik kültürü %2 raffinose ile 50 mL YP kültür ortamı içeren 250 mL'lik bir şişeye aktarın. Bir orbital shaker üzerinde 250 rpm sallayarak 30 °C'de bir gecede kuluçka.
  4. 3. Gün: Öğleden sonra, 60 mL'lik kültürü %2 galaktoz içeren 1 L YP kültür ortamı içeren 3 L'lik bir şişeye aktarın. Bir orbital shaker üzerinde 250 rpm sallayarak 30 °C'de bir gecede kuluçka.
  5. 4. Gün: Sabahın ortasından itibaren kültürün optik yoğunluğunu (OD) her 2 saatte bir 600 nm'de izleyin. Kültür Bir OD 1.5 ve 2 arasında olduğunda, hücreleri hasat için aşağıdaki adımları ile devam edin. Bu OD aralığının dışında hasat, OD 1.5'den önce düşük hücre sayımı veya OD 2'nin üzerindeki hücresel quiescence ve protein yıkımı nedeniyle verimi azaltabilir.
  6. Hücre kültürünü santrifüj şişelerine dönüştürün ve ~6200 x g'de 4 °C'de 8 dk. Süpernatant'ı dökün ve atın.
  7. Çift distile H2O (ddH2O) ile şişedeki hücre peletini yeniden askıya alın.
  8. Hücreleri 4 °C'de ~6200 x g'de 8 dk.
  9. Hücre peletinin viskozitesine bağlı olarak, pipetleme için yeterli bir çözelti sıvısı oluşturmak için 2 mL ddH2O'ya kadar ekleyin.
  10. 10 mL'lik pipetle donatılmış motorlu pipet denetleyicisi kullanarak, hücre bulamacını bir seferde bir damla sıvı nitrojene yavaşça dağıtın. Bu maya hücrelerinin dondurulmuş pelet üretecek.
  11. Dondurulmuş hücreleri arındırmaya hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

2. Maya hücrelerinden motor proteinlerin saflaştırılması

  1. Hücre lisisi ve çözünür protein ekstraksiyonu
    1. Saf etanolde 0,1 M PMSF'lik yeni bir çözeltinin 1 mL'sini hazırlayın. PMSF'yi sulu tamponlara eklemek için bekleyin, suda kararsız olduğu için; ayrıca, kullanımdan sonra 20 dakika (suda PMSF yaklaşık yarı ömrü) kadar suya maruz kalmaktan kaçının.
    2. 5x lysis tamponunun 5x stoğundan takviyelerle buz üzerinde 50 mL 4x lysis tampon hazırlayın, ancak tampon maya peletine uygulanmadan hemen önce PMSF eklemeyin.
    3. Sıvı azot dondurulmuş maya peletleri, sıvı nitrojenle önceden soğutulmuş bıçak tipi kahve öğütücüsi ile ince bir toz haline getirin.
      NOT: Bu protein ekstraksiyonu genellikle maya kültürünün 2 L'sinden alınan hücre peleti ile başlar. Maya kültürünün başlangıç miktarı aşağıda 2.2.2 ve 2.3.1 adımlarında IgG boncuk ve DNA oligolarının hacimlerine orantılı ayarlamalarla yukarı veya aşağı ayarlanabilir.
    4. Aliquot 15 mL dtt ve Mg-ATP ile 4x lysis tampon buz ve 2 mM son konsantrasyonelde etmek için tampon PMSF eklemek, takviyeleri ile 4x lysis tampon hazırlanması tamamlayarak.
    5. Önceden soğutulmuş ~ 100 mL cam kabı içine maya tozu toplamak buz üzerinde. Tampon nihai konsantrasyonu 1x geçmez böylece toz içine takviyeleri ile 4x lysis tampon küçük bir hacim ekleyin. Tipik olarak, maya tozu her 10 mL için tampon ~ 1,5 mL ekleyin.
    6. Kabı 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirerek tozu sıvı faza hızlıbir şekilde eritin ve spatula kullanarak sürekli karıştırın.
    7. Erimeden hemen sonra lysate kabını buza yerleştirin, 50 mL konik bir tüp kullanarak lysate hacmini tahmin edin ve tamponun nihai konsantrasyonunun ~1x olması için takviyelerle daha fazla 4x lysis tamponu ekleyin. Tipik olarak, maya kültürünün 2 L 1x lysis tampon içeren lysate toplam 25-35 mL verimleri.
    8. Lysat'ı buz üzerindeki santrifüj şişelerine eşit olarak dağıtın. Şişeleri her çift arasında en fazla 0,01 g'lık bir kütle farkıyla dikkatlice dengeleyin ve her şişenin şişe çökmesini önlemek için gereken minimum hacmin üzerinde olmasını sağlar. 4 °C'de 25 dk için ~290.000 x g'de santrifüj.
    9. Buz üzerinde 50 mL konik tüp içinde çözünür proteinler içeren supernatant toplamak ve hücre enkaz ve büyük organeller içeren pelet atın. Sonraki adımlarda kullanılan yerçekimi akış sütunu tıkayabilir gibi supernatant herhangi bir bulutlu kısımları toplama kaçının. SDS-PAGE analizi için supernatant 10 μL kaydedin.
  2. IgG afinite arınma
    1. Yukarıdaki dönüş sırasında, buz üzerinde veya soğuk bir odada bir yerçekimi akışı kromatografi sütunu ayarlayın.
    2. Giriş noktasının çapını büyütmek için bir jiletle kesilmiş P-1000 pipet ucu kullanarak kolona %50 IgG afinite boncuk bulamacı 200 μL aktarın. Hücre kültürü peletinin 2 L'den fazla veya daha az arındırılması durumunda, boncuk bulamacının hacmini en az 100 μL hacimle orantılı olarak ayarlayın.
    3. Aliquot başka bir 15 dtt ve Mg-ATP ile 4x lysis tampon mL ve 2mM son bir konsantrasyon elde etmek için tampon PMSF ekleyin. DDH2O ekleyerek buz üzerindeki 4x tamponu 1x'e seyreltin.
    4. Takviyeleri ile 1x lysis tampon 5 mL ile boncuk 2x yıkayın.
    5. Takviyeleri ile 1x lysis tampon 200 μL boncukre askıya alın.
    6. Santrifüjden elde edilen protein özüne boncuk süspansiyonunu ekleyin ve karışımı 4 °C'de 1 saat boyunca hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın.
    7. Kuluçka sırasında, 25 mL yıkama tamponu (tablo 1'deayrıntılı tarif) buz üzerinde ve 50 mL 1x TEV tampon (tablo 1'deayrıntılı tarif) buz üzerinde hazırlayın.
    8. 1 saat kuluçkadan sonra, lysat-boncuk karışımını buz üzerinde veya soğuk odada, yukarıdaki adım 2.2.2'de kullanılan kromatografi sütunundan süzün. SDS-PAGE analizi için akış tan 10 μL tasarruf edin.
    9. Kalan motora bağlı boncukları buz da 5 mL yıkama tamponu ile yıkayın. SDS-PAGE analizi için ilk yıkamanın 10 μL'sini kaydedin.
    10. 1x TEV tampon 5 mL ile bir kez buz üzerinde boncukyı yıkayın. Arabelleğe sütundan tamamen boşalmasını bekleyin.
  3. DNA oligonükleotidleri ve TEV dekoltesi ile etiketleme
    1. Kromatografi sütununu kurulumdan çıkarın ve sütunun alt kısmını kaplayın. Aynı kolon içinde, 10-15 dakika oda sıcaklığında saflaştırılmış BG-oligo (RT) içeren 100 μL 1x TEV tampon 100 μL motor boncuklar inkübe. Hücre kültürü peletinin 2 L'den fazla veya daha az arındırıcı ise, 1x TEV tampon hacmini ve saflaştırılmış BG-oligos hacmini orantılı olarak ayarlayın. Motor etiketleme verimini ve oranını artırmak için gerekirse üreticinin talimatlarına göre kuluçka süresini artırın, ancak daha uzun kuluçka süreleri de RT'deki protein denatürasyonuna bağlı olarak işlevsiz motorların oranını artırabilir.
    2. Kuluçkanın her dakikasında boncukları yavaşça askıya alın.
    3. Etiketli motor boncukları 4x 1x TEV tamponunun 4 mL'si ile yıkayın. Son yıkamanın sütundan tamamen boşalmasını bekleyin.
    4. Sütunun alt kısmını kaplayın, 1x TEV Tampon'un 200 μL'inden fazla olmayan motor boncuklarını yeniden askıya alın ve 2 mL yuvarlak alt mikrosentrifuge tüpüne aktarın.
    5. Süspansiyonu 16 °C'de 16 °C'de ,1 saat hafif dönüşlerle ~ 0,3 ünite TEV proteaz ile kuluçkaya yatırın. Tüp, boncukların temas ettiği tüpün toplam yüzey alanını en aza indirecek şekilde monte edilmelidir.
    6. Tüpün alt kısmında karışımı konsantre etmek için soğuk bir odada 30 s için 21.130 x g bir mikrosantrifüj tüp santrifüj.
    7. Hala soğuk odada, bir spin sütun ve santrifüj için karışımı aktarmak için kesilmiş bir P-1000 pipet ucu kullanın 21,130 x g 30 s. TEV-cleaved içeren filtrasyon toplamak, saf motorları. TEV protease filtrat yanı sıra motorlar olacak.
    8. SDS-PAGE çözümlemesi için filtratTan 10 μL tasarruf edin. Aliquot tirf deneyleri için 2 μL veya mikrotübül afinite saflaştırma için 50 μL hacimlerinde kalan filtrat. Flaş sıvı nitrojen aliquots dondurma ve -80 °C'de saklayın.
    9. SDS-PAGE çözümlemesi için filtrede kalan boncukları 1x TEV arabelleğinde yeniden askıya alın. Yukarıdaki adım 2.3.4'teki gibi 1x TEV arabelleği ile aynı hacimde kullanın.

3. Mikrotübül (MT) polimerizasyonu

  1. TIRF tahlilleri için tubulin karışımlarının hazırlanması
    1. Soğuk bir odada, ayrı ayrı her tür lyophilized tubulin eritin (etiketsiz sığır tubulin, biyotinylated tubulin, ve floresan tubulin) reconstitution tampon (tarifi Tablo 2ayrıntılı) son konsantrasyon yapmak için 10 mg /mL. 10 dakika buz üzerinde oturalım.
      1. Aşağıdaki bileşenleri karıştırın ve soğuk odada 10 dakika buz üzerinde oturalım (son konsantrasyonlar parantez içinde belirtilir): 18 μL sığır tubulin (~8.2 mg/mL), 2 μL biyotinylated tubulin (~0.9 mg/mL) ve 2 μL floresan tubulin (~0.9 mg/mL).
    2. 3 μL tubulin karışımı ve flaş dondurma sıvı azot içinde hazırlayın. Karışımları -80 °C'de saklayın.
  2. Motorların MT afinite arınması için tubulin hazırlanması
    1. Soğuk bir odada, 10 mg/mL son konsantrasyonyapmak için reconstitution tampon lyophilized sığır tubulin çözünür. 10 dakika buz üzerinde oturalım.
    2. 3 μL tubulin karışımı ve flaş dondurma sıvı azot içinde hazırlayın. Karışımları -80 °C'de saklayın.
  3. Tubulinin MT'lere polimerizasyonu
    1. -80 °C'lik dondurucudan 3 μL tubulin aliquot çıkarın ve tüpün altını tutarak sıvı faza çok hızlı ve kısa bir süre çözülün. Hemen buz ve en az 3 dakika kuluçka yerleştirin.
    2. Yavaşça katman 3 μL 2x polimerizasyon karışımı (tarif Tablo 2ayrıntılı ) tubulin çözeltisinin üstüne. Tüpü hafifçe hareket ettirerek karıştırın, ancak kesme kuvvetleri MT çekirdekasyonunu ve uzamayı bozabileceğinden pipetleme ile karıştırmayın.
    3. Karışımı 37 °C'de 30 dk su banyosunda kuluçkaya yatırın.
    4. 6 μL RT 1x BRB80'i eklerle (Tablo 2'deayrıntılı olarak tarif) üzerine hafifçe katlayın ve hareket ettirerek karıştırın. Pipetleme ile karıştırmayın.
    5. Karışımı en az 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    6. MT yakınlık arınma devam, ya da TIRF tahlilleri yapıyorsanız, daha uzun MTs oluşturmak için rt bir gecede karanlıkta MTs kuluçka.
    7. RT karanlıkta haftalarca polimerize MT'leri saklayın.

4. Mikrotübül (MT) afinite arınma

  1. Polimerize edilmemiş tübülinlerin santrifüj ile uzaklaştırılması
    1. % 60 gliserol yastık yapmak için aşağıdaki bileşenleri karıştırın: 1x BRB80 (takviyeleri olmadan; tarifi Tablo 2ayrıntılı), 20 μM Taxol (DMSO çözünmüş), 1 mM DTT, ve 60% gliserol.
    2. Gliserol yastığının 60 μL'sini ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Daha önce yastığın üzerine polimerize edilmiş etiketsiz MT'lerin 12°L'lik kısmını hafifçe katlayın. MT'lerin kesilmesini önlemek için, kesme pipet ucu kullanarak aktarın.
    3. Karışımı 15 dakika boyunca 22 °C'de ~97.300 x g'de santrifüj edin. Spinden sonra, fazla tubulinler üst sıvı tabakada kalırken, MT'ler alt tabakada bir pelet oluştururlar. Pelet çıplak gözle görülemeyebilir gibi, pelet bulmak için spin önce tüpün dış kenarını işaretleyin.
    4. Gliserol yastığının üzerindeki sıvı katmanı (~12 μL) dikkatlice çıkarın ve SDS-PAGE analizi için 10 l tasarruf edin.
    5. Sıvı tabaka ile yastık arasındaki arabirimi 20 μL 1x BRB80 ile hafifçe durulayın. 20 μL durulamayı çıkarın ve atın.
    6. Gliserol yastığını (~60 μL) dikkatlice çıkarın ve SDS-PAGE analizi için 10 μL tasarruf edin. MT peletrahatsız değil dikkatli olun.
    7. Peleti 60 μL 1x BRB80 ile hafifçe durulayın (Tablo 2'deayrıntılı olarak anlatıldı). MT peletrahatsız değil dikkatli olun. Durulama çözeltisini atın.
    8. Taxol destekli lysis tamponunun 24 μL'lik MT peletini (Tablo 3'teayrıntılı olarak belirtilen tarif) kesme pipet ucu kullanarak yeniden askıya alın.
  2. Fonksiyonel motorların MT tabanlı afinite kromatografi silerek saflaştırılması
    1. Mayadan arındırılmış -80C dondurucudan saflaştırılmış iki 50 μL motorun aliquotlarını çıkarın ve sıvı faza hızla çözülün. Hemen buza yerleştirin.
    2. Belirtilen sırada yeni bir ultracentrifuge tüpüne aşağıdaki bileşenleri ekleyin ve karışımı 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın: (1) mayadan arındırılmış motorların 100 μL'si, (2) 29 μL 5x ATP/Taxol karışımı (Tablo 3'teayrıntılı tarif ), sonra (3) 12 μL saflaştırılmış MTs tranl bir kesme pipet ucu ile sferred.
    3. Karışımı ~97.300 x g ve 22 °C'de 15 dakika santrifüj edin. Spinden sonra, fonksiyonel motorlar süpernatant kalır, ve MTs bir pelet oluşturmak, onlara bağlı olmayan fonksiyonel motorlar ile birlikte.
    4. Supernatant toplayın, 2 μL aliquots flaş dondurma, ve -80 °C'de saklayın.
    5. SDS-PAGE analizi için supernatant 10 μL kaydedin. SDS-PAGE analizi için 1x BRB80'in 141 μL'inde peleti yeniden askıya alın. Daha önce ayrıntılı olarak saflaştırılmış motorların konsantrasyonu ölçmek için standart bir eğri oluşturmak için actin gibi protein standartlarını kullanın17.
    6. 6.1.3 adımda motorları şasiye çekerken bu konsantrasyon bilgilerini kullanın.

5. Parçalı DNA origami şasisinin imalatı

  1. Şasi oluşumu
    1. Daha önce yayınlanmış tablolarda listelenen elyaf oligonükleotidleri Tris tamponunda 250 μM'de ıslak 96 kuyu plakasında8 veya kuru olarak sipariş edin ve tris tamponuyla 250 μM'ye yeniden askıya alın.
    2. Her çekirdek zımbasının 5 μL'sini karıştırarak çekirdek zımbalarından oluşan bir havuz oluşturun (Bkz. Driller-Colangelo 20168'dekiTablo S1).
    3. Her bağlayıcı zımbasının 5 μL'ini karıştırarak bağlayıcı zımbalarından oluşan bir havuz oluşturun (Bkz. Driller-Colangelo 20168'dekibağlayıcı zımba tablosu).
    4. Her florofor sapı zımbasının 5 μL'ini karıştırarak florofor bağlama zımbalarından oluşan bir havuz oluşturun (Bkz. Driller-Colangelo 20168'dekiflorofor saplı tablo).
    5. 50 μL katlama reaksiyonlarını aşağıdaki bileşenlerle karıştırın: 1x Katlanır tampon; 100 nM 8064 iskele; 600 nM çekirdekli zımba havuzu; 600 nM florofor elyaf havuzu; 9 μM florofor iplikçik (Bkz. Driller-Colangelo 20168'deflorofor antihandle table ); her motor bağlama alanı için, 4,2 μM genişletilmiş sap iplikçikleri veya 600 nM iplikçikler istenilen şekilde kulpsuz (Driller-Colangelo 20168'dekimotor sapı/antihandle zımba tablosuna bakınız); 600 nM bağlantı cının istenilen8; ek 6 mM MgCl2; ve su.
    6. Aşağıdaki programı kullanarak bir termal döngüiçinde katlayın: 80 °C'ye hızlı ısıtma, tek derecelik artışlarla 75 dk üzerinde 65 °C'ye kadar soğutulması, daha sonra tek derecelik artışlarla 17,5 saat üzerinden 30 °C'ye kadar ek soğutma.
    7. 0.5x TBE tampon % 2 agarose jel üzerinde tsay katlama kalitesi (tarifi için Tablo 4 bakınız) 11 mM MgCl2 ve DNA jel lekesi ile desteklenmektedir (Malzemeler Tablosubakınız). 0.5x TBE tampon çalıştırın 11 mM MgClile takviye 70 V için 60-90 dk. Aşırı ısınma ve şasi yapılarının sonraki denatürasyon önlemek için bir buz suyu banyosu veya soğuk bir odada çalıştırın jeller.
    8. Adım 5.1.7'de kullanılan DNA jeli lekesi için uygun koşulları kullanarak jeli görüntüleyin.
  2. Şasinin saflaştırılması
    1. Arınmadan bir gün önce öğleden sonra, 80 μL'lik her birini %45, %40, %35, %30, %25 ve %15 gliserol 1x origami katlanır tamponda hafifçe katmanlayarak gliserol gradyanları oluşturun (tarif için Tablo 4'e bakınız). Katmanlar arasındaki sınırlar biraz görünür olmalıdır.
    2. Bir gecede 4 °C'de degradeleri inkübün.
    3. Ertesi sabah, 1x origami katlanır tampon% 45 gliserol ekleyin katlanmış şasi çözeltisi için 10% gliserol nihai konsantrasyon. Santrifüj tüpündeki degradenin üst kısmında hafifçe ve katmanla karıştırın.
    4. 4 °C'de 130 dk için 243.000 x g'de şasi ile degradeyi döndürün.
    5. Üstten alt ayönde tüpten 50 μL kesir toplayın.
    6. 11 mM MgCl2 ve DNA jeli lekesi ile takviye 0.5x TBE tampon% 2 agarose jel döküm.
    7. Jel üzerinde her fraksiyonun 5 μL yük ve 0.5x TBE tampon ile takviye jel 11 mM MgCl2 için 90-120 dk 70 V. Bir buzlu su banyosu veya soğuk bir odada aşırı ısınma ve şasi yapılarının sonraki denatürasyon önlemek için jeller çalıştırın.
    8. Adım 5.2.6'da kullanılan DNA jeli lekesi için uygun koşulları kullanarak jeli görüntüleyin.
    9. Dahil edilmemiş zımbalardan arınmış şekilde katlanmış monomerik yapılar sergileyen gelecekteki deneyler için kesirleri seçin.
    10. 260 nm'de UV emilimi gibi uygun spektroskopik yöntemler kullanılarak seçilen fraksiyonların sayısallaştırılmış konsantrasyonları. 6.1.3 adımda motorları şasiye çekerken bu konsantrasyon bilgilerini kullanın.

6. Slayt adak odaları yapma

  1. Bir cam slayt için çift taraflı bant iki şeritler yapıştırarak ve üstüne bir coverslip yerleştirerek bir slayt deneme odası olun. Oda, iki bant şeridi ile çevrili, kapak ve cam kaydırak arasında sıkışmış dar bir alandır. Şekil 1, ispon odasını göstermektedir.
  2. Slaytı çözeltilerle hazırlarken, bir taraftan herhangi bir sıvıyı odaya aktamak için bir pipet kullanın ve diğer taraftaki sıvıakışını toplamak için bir filtre kağıdı şeridi kullanın.

7. Motor-topluluk hareketlilik TIRF teşir

  1. Motorların DNA şasisine çekimi
    1. Buz üzerinde, Taze hazırlamak 1 mL Her DTT takviyeli BRB80, Taxol takviyeli lysis tampon, ve kazein-Taxol takviyeli lysis tampon (yemek tarifleri Tablo 5ayrıntılı ). Her tamponun 200 μL'sini bir RT tüpüne aktarın.
    2. Hala buz üzerinde, 4x enerji ve 4x çöpçü karışımları hazırlamak için soğuk kazein-Taxol takviyeli lysis tampon kullanın (yemektarifleri Tablo 5 ayrıntılı ).
    3. 10 μL ~300 nM saflaştırılmış motorlar ve 15-30 dakika boyunca buz üzerinde 5 μL ~10 nM DNA şasisi. Bu kuluçka süresi için motorların bu konsantrasyonlarının şasinin motor bağlama alanlarını doygunlaştırdı.
      NOT: motor doluluk% 100 değil, büyük olasılıkla bireysel şasi yapılarında stochastically eksik kolu zımba nedeniyle8,28.
    4. Kuluçka sırasında, rt Taxol destekli lysis tamponu ile biotin ve florofor etiketli MTs 100x seyreltmek ve aşağıda belirtilen prosedürü izleyerek boyut dışlama sütun kromatografisi için uygun bir jel filtrasyon reçine hazırlamak.
  2. Fazla motorların motor şasi konjugatlarından boyut dışlama kolon kromatografisi ile çıkarılması
    1. 50 mL konik bir tüpte, jel filtrasyon reçinin 2x'inin 5 mL'sini 45 mL ddH2O ile yıkayın. Her yıkama için, konik tüp su ile reçin karıştırın ve 1 dk. supernatant atın ve reçine kaydedin 460 x g karışımı spin.
    2. Reçiden 2x'i 45 mL 1x lysis tamponu ile yıkayın (Tablo 5'teayrıntılı olarak anlatılan tarif) yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak.
    3. Yıkanmış recinin 1:1 oranında 1x lysis tamponunda yeniden askıya alınması, böylece resenin tamponda ~%50 bulamaç haline gelmesi. Yıkanmış reşin en az 1 ay 4 °C'de saklanabilir.
    4. Reçine süspansiyonunun 800 μL'sini bir spin sütununa aktarın. 5 dk. Yerçekimi akışı ile aşırı tampon drenaj. 1.000 x g2 s spin ile kalan tampon çıkarın . Son reşin hacmi 350-400 μL civarında olmalıdır.
    5. Motor-şasi karışımını kazein-Taxol destekli lysis tamponuyla 50 μL'lik son bir hacme seyreltin. Seyreltilmiş karışımı reçine dolu spin sütununa aktarın.
    6. Spin sütununu 6 s için 1.000 x g'de santrifüj edin (bu süre ivmelenme ve yavaşlama süresini kapsıyor). Filtratat kaydederek saf motor şasi konjugatlarını toplayın ve fazla motorları koruyan kolonu atın.
  3. Görüntüleme için slaytların hazırlanması
    1. Akış 13 μL 1 mg/mL biyotinylated sığır serum albumini (biotin-BSA) bir slayt tahsin odasına. BSA'nın cama bağlanmasını sağlamak için 2 dk kuluçka.
    2. Odanın bir tarafındaki tamponda akarak ve fazla sıvıyı filtre kağıdı şeridi kullanarak diğer taraftan uzaklaştırarak 20 μL RT DTT destekli BRB80 ile 2x'lik hazneyi yıkayın.
    3. 0.5 mg/mL streptavidin 20 μL akış. BSA biotin streptavidin bağlanmasını sağlamak için 2 dk için kuluçka.
    4. Odayı 2x RT Taxol destekli lysis tamponunun 20 000'i ile yıkayın.
    5. Seyreltilmiş MT'lerin 20 μL'inde kesme pipet ucu yla hafifçe akar. MTs ve streptavidin biotin arasında bağlayıcı izin vermek için 2 dk için kuluçka.
    6. 2x'i RT kazein-Taxol destekli lysis tamponunun 20 000'i ile yıkayın. Kazein tüm oda nüfuz sağlamak için 2 dk için kuluçka.
    7. Saflaştırılmış motor şasisi 5x ila 10x tek moleküllü koşullara (~10-100 pM) soğuk kazein-Taxol destekli lysis tamponu ile seyreltin. Son bir motor-şasi karışımı üretmek için aşağıdaki bileşenleri karıştırın: 10 μL motor-şasi seyreltme, 5 μL 4x enerji karışımı ve 5 μL 4x çöpçü karışımı.
    8. Son motor-şasi karışımının 20 μL'lik kısmını tahlil slayt odasına akıtın ve TIRF mikroskopisine ilerleyin.
  4. Görüntüleme ve veri toplama
    1. Bir TIRF mikroskobu ile hemen slayt görüntü. Genellikle, her slayt 30 ila 60 dakika arasında kullanılabilir kalır.
    2. MT kanalında hareketsiz bir görüntü ve şasi kanalında bir film edinin. Bu protokoldeki motorlar için kare hızı 0,5 fps ve pozlama süresi 200 ms olan 10 dk film uygundur.
    3. Şasi film, ImageJ veya benzer bir görüntü işleme yazılımı29her MT için bir kymograph oluşturmak . Kymograph30'dakipistlerin yamaçları ve yatay uzaklıklarını ölçerek motor şasi topluluklarının hızlarını ve uzunluklarını analiz edin.

Sonuçlar

Motorların ve şasi yapılarının başarılı arınmaları jel elektroforezi ile titreştirilmiştir. SDS-PAGE analizi, 2.3.7 adımda toplanan son filtrasyon ~350 kDa pozisyonunda net ve keskin bir bant gösterdiğinden, mayadan(Şekil 2)dynein'in başarılı bir şekilde çıkarını doğruladı. Beklendiği gibi, bu dynein bant akan ve istenmeyen proteinler kaldırıldı yıkama yoktu, ve hangi dynein cleaved boncuklar. Gözlem, IgG arınma ve TEV proteaz...

Tartışmalar

DNA origami moleküler inşaat teknikleri tanımlanmış mimarileri, motor numaraları ve türleri ile motor topluluklar oluşturmak için benzersiz bir yol sağlar, nasıl acil davranış belirli motor yapılandırmaları31ortaya çıkar çalışmaları sağlayan. Yapısal ve hücresel çalışmalar ekipler halinde çalışan sitoskeletal motorların örneklerini açıklığa kavuşturmaya devam ettikçe, topluluklar halindeki motorların biyofiziksel ve biyokimyasal mekanizmalarını izole etme ...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

K. Chau, J. Morgan ve A. Driller-Colangelo'ya parçalı DNA origami şasisinin tekniklerine katkıda bulunanlara teşekkür ederiz. Ayrıca Reck-Peterson ve Shih laboratuvarlarının eski üyelerine bu tekniklerin orijinal gelişimine yararlı tartışmalar ve katkılar için teşekkür ederiz. J. Wopereis'e ve Smith College Mikroskobu ve Görüntüleme Merkezi'ne ve L. Bierwert'e ve Smith College Moleküler Biyoloji Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bir TIRF mikroskobu satın alınması için NSF MRI programını minnetle kabul ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL Round Bottom TubeUSA Scientific1620-2700
Biotin labeled tubulin protein: porcine brain, >99% pureCytoskeleton.comT333P-A
Biotin-BSASigmaA8549-10MG
Bottle Assembly, Polycarbonate, 250 mL, 62 x 120 mmBeckman Coulter356013
Bottle, with Cap Assembly, Polycarbonate, 10.4 mL, 16 x 76 mmBeckman Coulter355603
Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC30VV00
IgG Sepharose 6 Fast Flow, 10 mLGE Healthcare17096901
Micro Bio-Spin Chromatography Columns, emptyBio-Rad7326204EDU
P8064 ScaffoldTilibit2 mL at 400nM
Poly-Prep Chromatography ColumnsBio-Rad731-1550
ProTev ProteasePromegaV6101
Scotch Double Sided Tape with Dispenseramazon.comN/A
Sephacryl S-500 HRGE Healthcare17061310
StreptavidinThermo Fisher434302
SYBR Safe DNA stainInvitrogen
Tubulin protein (>99% pure): porcine brainCytoskeleton.comT240-B
Tubulin, HiLyte 647Cytoskeleton.comTL670M-A
Ultra-Clear Centrifuge TubesBeckman Coulter344090

Referanslar

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112 (4), 467-480 (2003).
  2. Cianfrocco, M. A., DeSantis, M. E., Leschziner, A. E., Reck-Peterson, S. L. Mechanism and regulation of cytoplasmic dynein. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31 (1), 83-108 (2015).
  3. Roberts, A. J., Kon, T., Knight, P. J., Sutoh, K., Burgess, S. A. Functions and mechanics of dynein motor proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (11), 713-726 (2013).
  4. Hancock, W. O. The Kinesin-1 Chemomechanical Cycle: Stepping Toward a Consensus. Biophysical Journal. 110 (6), 1216-1225 (2016).
  5. McLaughlin, R. T., Diehl, M. R., Kolomeisky, A. B. Collective dynamics of processive cytoskeletal motors. Soft Matter. 12 (1), 14-21 (2016).
  6. Hancock, W. O. Bidirectional cargo transport: moving beyond tug of war. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 615-628 (2014).
  7. Derr, N. D., et al. Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science. 338 (6107), 662-665 (2012).
  8. Driller-Colangelo, A. R., Chau, K. W. L., Morgan, J. M., Derr, N. D. Cargo rigidity affects the sensitivity of dynein ensembles to individual motor pausing. Cytoskeleton. 73 (12), 693-702 (2016).
  9. Torisawa, T., et al. Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nature Cell Biology. 16 (11), 1118-1124 (2014).
  10. Urnavicius, L., et al. Cryo-EM shows how dynactin recruits two dyneins for faster movement. Nature. 554 (7691), 202-206 (2018).
  11. Toropova, K., Mladenov, M., Roberts, A. J. Intraflagellar transport dynein is autoinhibited by trapping of its mechanical and track-binding elements. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 461-468 (2017).
  12. Furuta, K., Furuta, A., Toyoshima, Y. Y., Amino, M., Oiwa, K., Kojima, H. Measuring collective transport by defined numbers of processive and nonprocessive kinesin motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (2), 501-506 (2013).
  13. Rogers, A. R., Driver, J. W., Constantinou, P. E., Kenneth Jamison, D., Diehl, M. R. Negative interference dominates collective transport of kinesin motors in the absence of load. Physical Chemistry Chemical Physics. 11 (24), 4882-4889 (2009).
  14. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  15. Roberts, A. J., Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Reconstitution of dynein transport to the microtubule plus end by kinesin. eLife. 3, e02641 (2014).
  16. Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
  17. Gennerich, A., Reck-Peterson, S. L. Chapter 4, Probing the force generation and stepping behavior of cytoplasmic Dynein. Methods in Molecular Biology. , 63-80 (2011).
  18. Goodman, B. S., Reck-Peterson, S. L. Engineering defined motor ensembles with DNA origami. Methods in Enzymology. 540, 169-188 (2014).
  19. Rao, L., Hülsemann, M., Gennerich, A. Combining Structure-Function and Single-Molecule Studies on Cytoplasmic Dynein. Single Molecule Analysis. Methods in Molecular Biology. 1665, (2018).
  20. Qiu, W., Derr, N. D., et al. Dynein achieves processive motion using both stochastic and coordinated stepping. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (2), 193-200 (2012).
  21. Gietz, R. D. Yeast Transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG Method. Yeast Genetics. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1205, (2014).
  22. Hariadi, R. F., Cale, M., Sivaramakrishnan, S. Myosin lever arm directs collective motion on cellular actin network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4091-4096 (2014).
  23. Krementsova, E. B., Furuta, K., Oiwa, K., Trybus, K. M., Ali, M. Y. Small teams of myosin Vc motors coordinate their stepping for efficient cargo transport on actin bundles. The Journal of Biological Chemistry. 292 (26), 10998-11008 (2017).
  24. Hariadi, R. F., et al. Mechanical coordination in motor ensembles revealed using engineered artificial myosin filaments. Nature Nanotechnology. 10 (8), 696-700 (2015).
  25. Hu, J. J., Morgan, J., Yang, Y., Lin, C., Derr, N. D. Spherical DNA Origami as a Programmable Cargo Structure for Investigating the Emergent Motility of Dynein and Kinesin Ensembles. Biophysical Journal. 116 (3), 408A (2019).
  26. Wagenbauer, K. F., et al. How We Make DNA Origami. Chembiochem. 18 (19), 1873-1885 (2017).
  27. Lin, C., Perrault, S. D., Kwak, M., Graf, F., Shih, W. M. Purification of DNA-origami nanostructures by rate-zonal centrifugation. Nucleic Acids Research. 41 (2), e40 (2013).
  28. Ke, Y., Voigt, N. V., Gothelf, K. V., Shih, W. M. Multilayer DNA origami packed on hexagonal and hybrid lattices. Journal of the American Chemical Society. 134, 1770-1774 (2012).
  29. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  30. Reck-Peterson, S. L., Derr, N. D., Stuurman, N. Imaging single molecules using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  31. Derr, N. D. Interactions of Multiple Dynein Motors Studied Using DNA Scaffolding. Handbook of Dynein. , (2019).
  32. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 152sitoiskeletdinaminkinesinmolek ler motorlarDNA origamitek molek l y ntemleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır