Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Özet

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Özet

Proteinlerin ubikitin (ub) ve ubiquitin benzeri (ubl) bağımlı post-translational modifikasyonları protein stabilitesini, aktivitesini, etkileşimlerini ve hücre içi lokalizasyonunu kontrol ederek hücre içinde temel biyolojik düzenleyici rolleri oynar. Hücrenin sinyallere yanıt vermesine ve çevredeki değişikliklere uyum sağlamasına olanak sağlar. Bu mekanizmalar içinde değişiklikler nörodejeneratif hastalıklar ve kanserler gibi ciddi patolojik durumlara yol açabilir. Burada açıklanan tekniğin amacı, kültürlü hücre çizgilerinden ub/ubls bağımlı PTM profillerinin hızlı ve doğru bir şekilde oluşturulmasıdır. Farklı koşullardan elde edilen farklı profillerin karşılaştırılması, örneğin bir tedavi tarafından indüklenenler gibi belirli değişikliklerin tanımlanmasına olanak tanır. Lentiviral aracılı hücre transdüksiyonu, değiştiricinin (ubiquitin veya SUMO1 veya Nedd8 gibi bir ubl) iki tag (6His ve Bayrak) sürümünü ifade eden kararlı hücre çizgileri oluşturmak için gerçekleştirilir. Bu etiketler her yerde saflaştırma ve bu nedenle hücrelerden her yerde proteinlerin izin verir. Bu iki aşamalı bir arınma işlemi ile yapılır: İlki 6His etiketi kullanılarak denatüre koşullarında gerçekleştirilir ve ikincisi bayrak etiketi kullanılarak yerel koşullarda gerçekleştirilir. Bu, daha sonra sıvı kromatografi spektrografi ve tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) teknolojisi ile tanımlanan ve yarı-nicelleştirilmiş modifiye proteinlerin son derece spesifik ve saf izolasyonuna yol açar. Excel yazılımını kullanarak MS verilerinin kolay enformatik analizi, arka plan sinyallerini ortadan kaldırarak PTM profillerinin oluşturulmasını sağlar. Bu profiller, standart biyokimya teknikleri ile doğrulanmalarından başlayarak, daha spesifik olarak incelenecek belirli değişiklikleri belirlemek için her durum arasında karşılaştırılır.

Giriş

Burada önerilen yöntem, belirli bir durumla ilişkili potansiyel değişiklikleri (tedavi, farklılaşma, vb.) belirlemek için kültürlü memeli hücrelerinden ubikitin aile üyeleri tarafından aracılık edilen PtM'leri incelemek için ayrılmıştır. Ptm'ler proteinlerin fonksiyonlarının düzenlenmesinin son adımını temsil eder^1. Nitekim, bir kez çeviri makineleri tarafından üretilen, çoğu değilse tüm proteinler kendi aktivitesini modüle PTM'ler farklı türde uğrar, moleküler etkileşimleri, ve hücre içi konumu¹. PtM bolluk arasında proteinlerin ubiquitin ailesi tarafından aracılık olanlar, ubiquitin kendisi ve tüm ubikitin benzeri, tüm hücre içi veya kısmen sitoplazmik proteinleri düzenlemek için potansiyele sahip². Kendileri protein oldukları için, her biri belirli düzenleyici işlevlerle ilişkili homojen ve heterojen çeşitli topolojilerin homojen ve heterojen zincirlerini oluşturarak birbirlerine konjuge edilebilirler^2. Bu karmaşık makineyi çözmek ve anlamak için araçlara ihtiyaç vardır. Birçok yaklaşımlar dünya çapında, kendi avantajları ve dezavantajları olan geliştirilmiştir ve burada kültürlü hücreler için uygun yüksek performanslı bir öneriyoruz.

Bu yöntemin en büyük avantajı doğruluğudur. Nitekim, izole modifiye proteinlerin saflığı son derece iki etiket (6His ve Bayrak) ve iki adım prosedürü kombinatoryal kullanımı ile geliştirilmiş ve bu nedenle tek bir etiket füzyon ub / Ubl³çok daha seçici olduğunu^,4. 6His etiketinin varlığı, tamamen inkar eden bir durumda arınmanın ilk adımını sağlar ve böylelikle ubikitin bağlayıcı etki alanları veya her yerde bulunanlara bağlanan diğer proteinler içeren proteinlerin birlikte saflaştırılmasından kaçınır. Bu teknik bir sorun ya spesifik antikorlar⁵ veya tandem ubiquitin bağlayıcı elemanları (TUBEs)⁶kullanarak ubiquitinated proteomların yakınlık saflaştırma dayalı birçok diğer yaklaşımlar tarafından karşılaşılan bir teknik sorundur . Daha da önemlisi, bu teknik her yerde belirli bir tür arınma lehine önyargılı değildir, bu bazı diğer yaklaşımlar için durum olabilir gibi, poliubiquitinations hem mono ve farklı türde tespit edildi beri⁷. Sonuç olarak, bir kez bulundu, ubiquitination bir değişiklik ilgili her yerde tam türünü belirlemek için standart biyokimyasal yaklaşımlar tarafından daha ayrıntılı olarak incelenmesi gerekecektir.

Son olarak, bu protokolün bir diğer teknik avantajı, normal hücresel davranışa müdahale etmeden etiketli değiştiriciifadelerinin makul düzeyde olan kararlı ifade hücre çizgileri oluşturan lentivirüslerin kullanımıdır.

Ubikitinasyonun önemli bir rolü proteazomal bozulma için proteinleri hedeflemek ise, şimdi potansiyel olarak en hücre içi veya kısmen hücre içi proteinler için birçok düzenleyici özelliklere sahip olduğu bilinmektedir¹. Bu fonksiyonların sayısı daha proteinler gibi birçok ubiquitin varlığı ile artar, proteinlerin hemen hemen her hücre mekanizması nı düzenleyen bir aile oluşturan¹. Onların değişiklikler hücre biyolojisi üzerinde köklü etkisi olabilir ve yol açabilir veya patolojik^durumlarakatılabilir 8 , kanser gibi⁹. Bu nedenle, araçlar bu geniş manzara keşfetmek ve yeni terapötik hedefler olarak hizmet verebilir patolojik bir durum ile ilişkili değişiklikleri belirlemek için gereklidir.

Bu protokol, ub/Ubl etiketli eksojeni ifade etmek için transeksedilmesi gerektiğinden kültürdeki hücrelere adanmıştır. Oluşturulduktan sonra, bu kararlı hücre çizgileri 2D veya 3D veya ksenogreft kültüründen Ubl profilleri oluşturmak için kullanılabilir, böylelikle PTM profilleri çalışmak için uygulanabilir farklı deneysel modellerin ufkunu genişleterek.

Protokol

1. 6His-Bayrak-Ubl ifade kararlı hücre hatları nesil

NOT: HEK-293T hücrelerinin pCCL-6HF-Ubl, pVSVG ve delta-Helper ile birlikte transfeksiyonu.

1. 0. Gün: Tohum 293T hücreleri 6-iyi plaka elde etmek için 50-70% ertesi gün biraraya.
2. 1. Gün: Lentivirüs üretimi için transfeksiyon reaktifi ve protokolü kullanarak 1 μg pCCL-6HF-Ubl veya pCCL-GFP, 1 μg pVSVG ve 1 μg delta-Helper vektörleri karışımı ile co-transfect%50-70 konfluent hücreler. Transfeksiyon 6 saat sonra, transekedilecek hücrelere karşılık gelen taze bir orta değiştirin. Bir gün sonra (transdüksiyonun başladığı gün) %10-20'lik bir kesişme elde etmek için 6 kuyuplakasına geçirilecek hücreleri tohumlayın.
3. 2. Gün: Transfeksiyondan 24 saat sonra, merceksi viral partiküller içeren ortamı geri alın ve 0,45 μm filtreler kullanarak filtre uygulayın. Gerekirse, lentiviruses ikinci bir parti üretmek için bu noktada taze orta ekleyin. Lentivirüsler içeren bir hücre transdüktör (%10-20) için orta değiştirin.
   NOT: Lentiviral ortam transdüksiyondan önce +4 °C'de birkaç gün tutulabilir veya -80 °C'de aylarca saklanabilir.
4. Hücreleri standart bir kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO₂₎24 saat ile 72 saat arasında lentivirüslerle kuluçkaya yatırın ve sonra ortamı taze standart bir tüp olarak değiştirin. Mümkünse, transdüksiyonun verimliliğini değerlendirmek için ters floresan mikroskop kullanarak GFP ifadesini kontrol edin: hücre ifade yüzdesi ve hücre başına göreceli ifade düzeyi. Floresan saptanmazsa, ifadenin transdüktör hücre türüne bağlı olarak daha uzun sürmesi nedeniyle ek 2-3 gün bekleyin.
5. GFP kontrolü pozitifse, anti-Flag antikor kullanarak immünoresans ve Batı leke tarafından 6HF-Ubl bir ifade kontrolü gerçekleştirmek için yeterli olana kadar tüm hücreleri büyümek.

2. Modifiye proteinlerin çift saflaştırılması

NOT: Tampon 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Tampon 2: 50 mM NaH₂PO_4,150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Gliserol, pH 8.0.
Tampon 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8.0.

1. Hücre lisisi: Hazır olduktan sonra kültür yemeklerini en az bir kez oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücre lisise devam edin veya alternatif olarak sıvı N_2'de flaş dondurulup -80 °C'de saklayın. Lysis için, RT'de 15 cm'lik bir tabağa 2 mL Tampon 1 ekleyin. 50 mL konik santrifüj tüplerinde (son hacim yaklaşık 20 mL) tüm lysatları kurtarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
2. Sonicate 30 s için üç kez lysate 1 dk duraklama ile ayrılmış.
3. 15 dk için 15.000 x g sonicated lysates santrifüj.
4. Supernatant'ı bir hücre süzgeci (40 μm) kullanarak yeni bir tüpe aktarın.
5. Örneklerin konsantrasyonunu belirleyin ve gerekirse aynı miktarda protein ve aynı hacim elde etmek için ayarlayın. 50 ve 100 mg (MiaPaCa-2 hücreleri için 15 cm çapında 10 tabak) arasında toplam miktarda protein kullanın.
6. Protein 1 mg başına boncuk 2 μL kullanarak, Ni^{2 +}-NTA boncuk ekleyin.
7. RT'de 2.5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün.
8. 5 dk için 500 x g boncuk pelet.
9. Boncukları 1 mL Tampon 1 ile yıkayın, numuneleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın, ardından tüpleri buzüzerinde aktarın. Sonraki tüm adımları buzda veya 4 °C'de gerçekleştirin.
10. 10 mM imidazol içeren 1 mL buz gibi Tampon 2 ile iki kez yıkayın.
11. Bağlı proteinleri eleştirmek için, 250 mM imidazol içeren 600 μL Tampon 2 ekleyin ve 4 °C'de 2 saat döndürün.
12. 1 dk. Süpernatantları yeni, önceden soğutulmuş, 1,5 mL tüplere aktarın ve 50 μL anti-Flag M2 antikor konjuge boncuk ekleyin.
13. 4 °C'de 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün, ardından 500 μL Tampon 2 ile 2 kez, 500 μL Tampon 3 ile 2 kez yıkayın.
14. Son elüsyon için, 0,1 g/μL'de bayrak peptidiçeren 100 μL Tampon 3 ekleyin ve 4 °C'de 1,5 saat döndürün.
15. 1 dk için 500 x g'da santrifüj edin ve süpernatantları yeni önceden soğutulmuş tüplere aktarın.
16. SDS-PAGE'e yüklemek için %10 (10 μL) alın ve arıtma kalitesini kontrol etmek için jelin gümüş boyamasını gerçekleştirin. Arınma iyi görünüyorsa, LC-MS/MS'den kalan %90'ı analiz edin.

3. Ub/Ubls PTM'lerinin profillerini oluşturmak ve aralarındaki önemli farklılıkları belirlemek için kütle spektrometresi verilerinin işlenmesi

NOT: MS analizinden elde edilen sonuçlar, her numunede tanımlanan her protein için toplam peptid sayısı ve en yüksek alan değerleri (TOP 3 peptid alanı^{ortalaması 10)}dahil olmak üzere birçok bilgi içerir. Bu veriler, peptit sayısı sayıları veya tepe alan değerleri veya her ikisi kullanılarak işlenebilir. Tepe alanları ile hesaplama için, bu değerler genellikle 10⁶aralığında olduğundan, aşağıdaki gibi aynı formülleri uygulamadan önce bu sıraya göre bölmek için gereklidir. Sayma metodolojisi ile elde edilen sonuçlar, her zaman olduğu gibi güçlü bir korelasyon göstermelidir. Tanımlanan her protein için aşağıdaki formülleri kullanın:
tedavi edilmeyen ubiquitin numunesinde v1 peptid değerleri (örn. Ub - ilaç)
Gemcitabine tedavi ubiquitin örnekv2 peptiddeğerleri (örneğin, Ub + ilaç)
tedavi edilmeyen kontrol GFP numunesinde k1 peptid değerleri (örn. GFP - ilaç)
Gemcitabine tedavi kontrol GFP örnek k2 peptidler değerleri (örneğin, GFP + ilaç).

1. Normalleştirme: Aşağıdaki formülleri kullanarak ubiquitin ve GFP için ilaç tedavi edilen hücreler ile tedavi edilmeyen hücreler arasındaki değerleri normalleştirin. Normalleştirilmiş v = V ve normalleştirilmiş k = K.
   V1=v1. (•v1+ (v2) / (2. •v1) ; V2=v2. (•v1+ (v2) / (2. +v2)
   K1=k1. (•k1+ (k2) / (2. (k1) ; K2=k2. (•k1+ (k2) / (2. (k2)
2. Arka planın çıkarılması: Aşağıdaki formülleri kullanarak, her iki koşulda tanımlanan her protein için belirli değerleri (V'1 ve V'2) elde etmek için kontrol örneğindeki (GFP) değerleri ubikitin örneğindeki değerlerden (GFP) çıkarın.
   V'1=V1-K1 eğer V1-K1≥0; V'1=0 ise V1-K1<0
   V'2=V2-K2 ise V2-K2≥0 ; V'2 =0 ise V2-K2<0
3. Varyasyon (Var) ubiquitination. Bir ilaç tarafından indüklenen PtM'lerin pozitif ve negatif varyasyonları için bir puan (-100 ile +100 arasında) elde etmek için, tedavi edilen ve tedavi edilmeyen numunelerin belirli değerleri arasındaki farkın, kontrol (gfp kontrolünde tanımlanan proteinleri cezalandırmak için) ve 100 ile çarpar.
   Var = (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100; -100-50'nin altındaki varyasyonlar (PTM baskısı) veya 50'nin üzerindeki (PTM indüksiyonu) genellikle anlamlı olarak kabul edilir.
4. Güven (Conf). 0 ile %100 arasında bir güven değeri elde etmek için aşağıdaki formülü kullanın:
   Conf = ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; =0 ise <0
   50'nin üzerindeki değerler genellikle kendinden emin olarak kabul edilir.
5. İndüksiyon/bastırma değerlerinin daha güzel bir dağılımını elde etmek ve hem varyasyon hem de güven parametrelerini göz önünde bulundurmak için, V Var ve C Conf'ın bulunduğu aşağıdaki formülü kullanarak Var ve Conf değerlerini çarpın
   =SI(V2>0;((V2*C2)^2)/(10^6);-(V2*C2)^2)/(10^6))
   NOT: Tepe alan değerleri genellikle peptit sayma daha doğru olduğundan, Perseus (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus) gibi verilerin yorumlanması için adanmış özel yazılım lar kullanmak mümkündür, aşağıdaki kullanım önerileri.

Sonuçlar

GFP ve 6HF-Ub ifade hücreleri oluşturmak için kültür memeli hücrelerinin transdüksiyon
Daha sonra MiaPaCa-2 hücrelerini nakletmek için kullanılacak lentivirüsler üretmek için, 70% confluent HEK-293T hücreleri üç vektör, pCCL-6HF-Ubiquitin veya GFP / Delta-Helper / pvSvG eşit miktarda transfected vardır. 24 saat üretimden sonra merceksi viral partiküller içeren ortam geri kazanılır ve süzülür. Bu noktada transfeksiyonun verimliliğini, ters bi...

Tartışmalar

Biz ana ubikitin aile üyeleri tarafından modifiye protein profilleri oluşturmak için sağlam ve güvenilir bir metodoloji geliştirdik. Nitekim, biz başarıyla ubiquitin tarafından PTMs profilleri oluşturmak için bu protokolü uyguladık, ve ayrıca SUMO ve Nedd8 tarafından, ve bir tedavi ile ilişkili değişiklikleri tespit etmek^{için 7}, belirli bir genin aşırı ifade veya nakavt yanıt olarak (veri değil gösterilen) ve çeşitli kemoterapötik ilaçlara dirençli fenotip edinilen h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag