Kümelenme Sonucu Desorpsiyon/İyonlaşma Kütle Spektrometresi Yoluyla Karmaşık Moleküllerin ve Yüzeylerdeki Reaksiyonlarının Analizi

Özet

Nötr SO₂ kümeleri düşük kinetik enerji (< 0.8 eV/constituent) bir iyon kapanı kütle spektrometresi kullanılarak kütle spektrometresi ile daha fazla analiz için peptidler veya lipidler gibi karmaşık yüzey moleküllerini desorb için kullanılır. Özel bir numune hazırlama gerekli değildir ve reaksiyonların gerçek zamanlı gözlemi mümkündür.

Özet

Nötr SO₂ Kümeleri (DINeC) tarafından indüklenen Desorpsiyon/İyonizasyon, karmaşık moleküllerin kütle spektrometresi (MS) ve yüzeylerdeki reaksiyonları için çok yumuşak ve verimli bir desorpsiyon/iyonizasyon tekniği olarak kullanılmaktadır. DINeC, düşük küme enerjisinde numune yüzeyini etkileyen SO₂ kümelerinden oluşan bir ışını temel adatır. Küme yüzeyetkisi sırasında, bazı yüzey molekülleri desorbed ve etkileyen kümede dissolvation yoluyla iyonize; bu çözülme aracılı desorpsiyon mekanizmasının bir sonucu olarak, düşük küme enerjisi yeterlidir ve desorpsiyon işlemi son derece yumuşaktır. Hem yüzey adsorbatları hem de yüzeyin oluşturduğu moleküller analiz edilebilir. Peptidler ve proteinler gibi karmaşık moleküllerden berrak ve parçalanmasız spektrumelde edilir. DINeC özel numune hazırlama gerektirmez, özellikle hiçbir matris uygulanmamalıdır. Yöntem, örneklerin bileşimi hakkında nicel bilgi verir; bir monolayer% 0.1 gibi düşük bir yüzey kapsama molekülleri tespit edilebilir. H/D değişimi veya termal ayrışma gibi yüzey reaksiyonları gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir ve reaksiyonların kinetikleri çıkarılabilir. Küme ışını üretimi için darbeli bir meme kullanan DINeC, iyon kapanı kütle spektrometresi ile verimli bir şekilde birleştirilebilir. DINeC prosesinin matrissiz ve yumuşak yapısı, iyon kapanının MSⁿ yetenekleriyle birlikte karmaşık organik numunelerin ve yüzeylerdeki organik adsorbatların kimyasal bileşiminin çok ayrıntılı ve net bir şekilde analizine olanak tanır.

Giriş

Yüzeye duyarlı analiz teknikleri genellikle düşük enerjili elektronlar, atomlar veya katı numunelerle güçlü bir şekilde etkileşime giren iyonlar gibi parçacık problarına dayanır. Sonuç olarak, yüksek yüzey hassasiyeti gösterirler ve yüzey yapısı hakkında detaylı bilgi elde edilebilir^1. Ancak kimyasal bilgiler genellikle sınırlıdır. Örnek olarak, X-ışını fotoelektron spektroskopisi atom bileşimi ve belirli bir türün ortalama kimyasal ortamı hakkında nicel bilgi verebilir (örneğin, bir yüzey üzerinde adsorbe organik bir molekül karbon atomları^2). Ancak, karmaşık, yüzey adsorbed molekülleri hakkında daha ayrıntılı bilgi, ayrıntılı yapısı veya bağlayıcı siteleri gibi, standart yüzey analiz teknikleri ile elde edilmesi zordur. Öte yandan, organik moleküller aracılığı ile yüzey işlevselizasyonuna artan ilgi ile bu tür bilgilere olan ihtiyaç artmaktadır. Yüzeyde sentezin genişleyen alanları³ veya yüzey işlevselleştirmesi biyomoleküllerin^{eki ile 4,5} iki önemli örnektir. Tüm bu alanlarda, sistemleri daha iyi anlamak için substrat-adsorbat e-sorbat ve adsorbat etkileşimleri ile ilgili temel sorular araştırılır. Bu araştırmalar için, adsorbed molekülleri hakkında bilgi maksimum arzu edilir.

Kısmen, ikincil iyon kütle spektrometresi (SIMS) bu tür bilgileri verebilir. İlk olarak, SIMS son derece yüzeye duyarlıdır. İkinci olarak, püskürtülen adsorbatlar ve parçaları MS ile tespit edildikçe, atomik bileşimin çok ötesinde bilgi elde edilir. Yüzeyde adsorbe edilen kimyasal türlerin doğasına bağlı olarak, kütle^{spektrumu 6'da}gözlemlenen moleküler kütle ve parça deseni ile tanımlanabilir. Birincil iyonlar tarafından indüklenen parçalar gerçekten analiz edilen malzemenin tanımlanmasına yardımcı olabilir. Diğer taraftan, örneğin birincil iyon kaynaklı modifikasyonu (parçalanma, iyonkaynaklı reaksiyonlar, karıştırma) çok güçlüyse, numunenin orijinal durumu hakkındaki çoğu bilgi kaybolur. Böylece, SIMS parçalanma azaltmak için büyük çabalar üstlenilmiştir (örneğin, birincil iyonlar olarak yüklü moleküler kümeler kullanarak^7,8,9). Ancak, parçalanma hala büyük makromoleküller ve biyolojik örneklerin SIMS spektrumları hakim¹⁰, çeşitli alanlarda SIMS uygulamasını sınırlayan.

Alternatif olarak, nötr kümeler (DINeC) tarafından indüklenen desorpsiyon/iyonizasyonun, karmaşık moleküllerin kütle spektrometrik analizi için başarıyla kullanılan yumuşak ve matrissiz iyonizasyon yöntemi olarak gösterilmiştir^{11,12,13,14,15,16,17}. DINeC, 10³ ila 10⁴ SO₂ molekülden oluşan moleküler kümelerden oluşan bir demet üzerine kuruludur(Şekil 1). Kümeler örnek üzerinde etkilendiğinde, yüzeydeki ve yüzeydeki moleküllerle çeşitli şekillerde etkileşime girerler: birincisi, kümenin kinetik enerjisinin bir kısmı yeniden dağıtılır ve desorpsiyonaktihale sağlar. Benzer şekilde önemli olan desorbing molekülü küme-yüzey etkisi sırasında kümede çözünür^11,18,19 (Şekil 1 ve Şekil 2). Başka bir deyişle, SO₂yüksek dipol momentine dayanarak, kümeler çok verimli polar analitler için geçici bir matris olarak hizmet vermektedir. Sonuç olarak, analit moleküllerinin desorpsiyon 1 eV/molekül ve altında gibi düşük küme enerjileri yer alır. Desorpsiyon sürecinin yumuşak doğası, SO₂ kümesi yüzey etkisi sırasında ve sonrasında parçalandığında sistemin hızlı soğuması ile daha da desteklenir^11,19. Bu çeşitli yönlerin bir sonucu olarak, peptidler, proteinler, lipidler ve boyalar gibi karmaşık moleküllerin küme kaynaklı desorpsiyon molekülleri herhangi bir parçalanma olmadan ilerler^11,15; tipik kütle spektrumları, bozulmamış molekülün m/z değerindeki baskın tepe noktasını gösterir ([M+H]⁺ veya [M-H]^-, Şekil 3). Moleküldeki fonksiyonel grupların sayısına ve doğasına bağlı olarak, formun birden fazla yüklü katyonu [M + n· H]^{n+ gözlenir 11,15,18}. Biyomoleküller için iyonizasyon genellikle temel veya asidik fonksiyonel grupta bir protonun alımı veya soyutlama yoluyla gerçekleşir, sırasıyla¹¹. Örnekte su molekülleri varsa, kümedeki SO₂ molekülleri sülfürlü asit oluşturan bu su molekülleriyle reaksiyona sokabilir¹⁸. İkincisi daha fazla proton alımı (pozitif iyon modu)^13,18yoluyla iyonizasyon durumunda iyonizasyon sürecini teşvik verimli bir proton kaynağı olarak hareket edebilir.

Şekil 1: Küme kaynaklı desorpsiyon/iyonizasyon ve deneysel kurulumun şematik illüstrasyonu. Küme kaynaklı desorpsiyon/iyonizasyon yüksek vakumlu bir kapta yapılır. SO₂ kümelerinden oluşan bir demet (sarı nokta) darbeli bir memeden SO₂/He gaz karışımının süpersonik genişlemesi ile üretilir. Küme yüzeyetkisi sırasında yüzey molekülleri desorbed ve iyonize edilir. Moleküler iyonlar (kırmızı/turuncu nokta) önyargılı bir ızgara, çift iyon huni girişi ve kütle spektrometresi için iyon tuzağına octopolar iyon kılavuzları ile aktarılır. Tipik kütle spektrumları bozulmamış moleküllerin m/z değerlerinde baskın zirveler gösterir, burada: Pozitif iyon modunda M1 (turuncu) ve M2 (kırmızı). Havaya uçurma: Küme yüzey imı sırasında, desorbed molekülleri etkileyen küme veya onun parçalarından birinde çözünür. SO₂ moleküllerinin daha fazla parçalanması ve buharlaşması kütle spektrometresinde tespit edilen çıplak, bozulmamış moleküler iyona yol açar. Ayrıca bkz. Şekil 2. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kümekaynaklı bozulmayı, çözülme yoluyla gösteren moleküler dinamik simülasyonlarının anlık görüntüleri. (A) SO₂ kümesi (300 molekül) bir dipeptidin (aspartik asit-arginin, ASP-ARG) adsorbe olduğu yüzeye 1250 m / sdik ile yüzeye yaklaşır. (B) Küme yüzey iyanı sırasında küme parçalanır. Adsorbe dipeptid, küme parçalarından birinde çözünmeye yol açan çevredeki SO₂ molekülleriyle etkileşime girer. (C) Küme parçaları yüzeyden itilir. Etiketli parça (mavi daire) bu parçada desorbed olan dipeptid taşır. Bu rakam 19. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Anjiyotensin II'nin temsili kütle spektrumu ve moleküler modeli. (A) Kütle spektrumları (üst panel: pozitif iyon modu, alt panel: negatif iyon modu) anjiyotensin II örneğinden küme kaynaklı desorpsiyon/iyonizasyon dan sonra elde edilen. Örnek bir Si gofret (doğal oksit ile kaplı) üzerine ilgili çözelti damla döküm tarafından hazırlanmıştır. Ana zirveler bozulmamış biyomolekül, [M+H]⁺ ve [M-H]^-; parçalanma örüntüleri gözlenmez. Dimers ([2M+H]⁺, ok) ayrıca desorpsiyon işleminin yumuşak doğasını gösterir. Pozitif iyon sinyali, SO₂ kümelerinin etkisi yle daha yoğundur^18. (B) Uzay dolum modeli ve anjiyotensin II amino asit dizisi. Beyaz toplar hidrojen atomlarını gösterir; siyah: karbon; mavi: azot; kırmızı: oksijen. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DINeC yüksek vakum koşulları ile uyumlu katı numune her türlü uygulanabilir. Özel numune hazırlama gereklidir, özellikle hiçbir matris DINeC-MS ölçümleri öncesinde, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon aksine (MALDI) kütle spektrometresi ve ilgili teknikler^20,21uygulanmalıdır. Bu vakum odasında reaktif türlerin arka plan basıncı²² veya örnek sıcaklık gibi değişen deneysel koşullar ile numunenin kimyasal değişikliklerin gerçek zamanlı ölçümleri sağlar. DINeC-MS algılama sınırının femtomol aralığında olduğu gösterilmiştir^11. Alt monolayer rejiminde katı yüzeylere adsore edilen biyomoleküllerin analizine uygulandığında, monokatmanın %0,1'i kadar düşük bir yüzey kapsamı tespit edilebilmektedir²³. Bu kapsama rejiminde, sinyal yoğunluğu yüzey kapsama doğrusal bağlıdır ve DINeC-MS yüzey^{kompozisyonu 23}kantitatif analizi için kullanılabilir. Karışık numunelerde, kimyasal ortamın iyonizasyon olasılığı üzerinde önemli bir etkisi gözlenmedikçe örnek bileşiminin nicel bir değerlendirmesi^mümkündür(örneğin, karışık lipid/peptit örneklerinde^17). Bu SIMS açık bir tezat, hangi belirli bir türün iyonlaşma olasılığı genellikle güçlü farklı kimyasal bileşenlerin varlığı (sözde "matris etkisi"^25,26)etkilenir.

Yüzey analizine ek olarak, yüzey altı bölgesindeki kimyasal bileşim derinlik profilleme¹⁷ile incelenebilir. Mevcut kurulum ile, biyomoleküllerin küme kaynaklı desorpsiyon oranları tipik desorpsiyon oranları 10^-3 nm/s sıradadır. Karışık lipid/peptit örneklerinde 1-2 nm aralığında yüksek derinlik çözünürlüğü gözlenmiştir¹⁷.

Bir diğer uygulama alanı da DINeC-MS ile ince tabaka kromatografisi (TLC) kombinasyonudur. Konvansiyonel TLC plakaları doğrudan DINeC-MS. Pozisyona bağlı kütle spektrumları ile analiz edilebilir TLC plakalarından elde edilebilir ve böylece TLC plakalarından kütleye özgü kromatogramlar elde edilebilir^27. Esi^28,29ile birlikte TLC farklı, ayrılmış analitler hiçbir yeniden elüsyon gereklidir. TLC'nin MALDI^28,29ile kaplininin aksine DINeC-MS + TLC kombinasyonu için de matris gerekmez.

Desorpsiyon elektrosprey iyonizasyon (DESI) aynı zamanda MS uygulamaları için yumuşak bir desorpsiyon/iyonizasyon^{yöntemidir 30,31}. DINeC ve DESI arasındaki en çarpıcı farklar şunlardır: DINeC^23'ünkantitatif doğası, ultra-yüksek vakumlu (UHV) koşullarla uyumluluğu, özellikle vakumu kırmadan UHV koşullarında hazırlanan ve aktarılan numuneleri araştırma imkanı²³, ayrıca polar olmayan molekülleri verimli bir şekilde desorb etme imkanı¹⁹.

Prensip olarak, DINeC desorpsiyon / iyonizasyon kaynağı olarak kütle spektrometresi her türlü birleştiğinde olabilir. Ancak, iyon kapanı kütle spektrometresi ile kombinasyonu iki ana avantajı vardır: Birincisi, tipik bir darbeli küme ışınının darbe genişliği ve tekrarlama hızı, iyon kapanının spektral hızının yanı sıra sürekli birikim süresine de karşılık^gelmektedir. İkinci olarak, DINeC sürecinin yumuşak doğası bozulmamış moleküllerin desorpsiyonuna yol açar. Iyon kapanı kütle spektrometresi MSⁿ yetenekleri ile birlikte, bu araştırılmış^örneklerinen kapsamlı analizi için izin verir 15 .

Protokol

NOT: Protokol herhangi bir zamanda duraklatılabilir.

1. Substratların hazırlanması

1. Standart numuneler için, silikon gofretlerden (yaklaşık 0,5 ila 1 mm kalınlığında) yüzeyleri 1 x 1 cm^2'likparçalar halinde kesin.
2. Her biri 15 dakika boyunca etanol ve aseton ultrason banyosunda Si yüzeyleri temizleyin.
3. Kuru azot gazı akışında yüzeyleri kurutun.

2. Örneklerin hazırlanması

1. Standart numune hazırlama
   1. Standart numuneler için, analiz moleküllerini içeren çözümü ele alınacak bilimsel soruya göre hazırlayın. Analitkonsantrasyonu en az 1 x 10^-10 mol/L olmalıdır.
   2. Substrat taki numune çözeltisinin 5 ila 30°L'lik kısmını düşürür. Çözücünün buhar basıncına bağlı olarak, numunenin ortam koşullarında veya kurutucuda kurumasına izin verin, tüm çözücü buharlaşana ve kuru bir film oluşana kadar. Uygulanan madde miktarına bağlı olarak, filmin kalınlığı birkaç on μm (görsel muayene mümkün) ve alt-monolayer rejimi (böylece gözle tespit edilemez) monolayer arasında olabilir.
   3. Numuneleri numune tutucuya monte edin (örn. numunelere ve gerekli vakum koşullarına bağlı olarak vidalarla sıkılmış yapışkan bant veya kelepçeler kullanarak).
   4. Mümkünse, numune tutucuya mikrometre kalınlığındaan anjiyotensin II filmi gibi bir referans numunesi de monte edin.
2. Alternatif numune hazırlama
   1. Elektrosprey iyon ışını biriktirme (ES-IBD) gibi alternatif numune hazırlama şemaları vakum veya varsa ilgili bir çözeltide daldırma kaplama kullanın.
   2. Hazırlama adımlarından önce DINeC numune tutucusunda vakumiçinde hazırlanıp aktarılacak montaj numuneleri.
   3. Son hazırlık adımından sonra daldırma kaplı numunelerin kuru olduğundan emin olun.
   4. En basit hazırlık planını düşünün. Örnek olarak, vurgulayıcı mürekkesinin araştırılması için, alt tabaka yüzeyine bir nokta çizmemem.

3. Örneklerin DINeC kütle spektrometresine aktarılması

1. Ortam koşullarından alınan numunelerin tahliye edilen DINeC odasına aktarılması
   1. Yük kilidi sistemini boşaltın.
   2. Yük kilidini açın ve numune tutucuyu monte edin.
   3. Yük kilidini kapatın ve yük kilidi odasını 2 x 10^-5 mbar'ın altındaki bir basınca pompalayın.
   4. Vanayı DINeC odasına açın ve transfer çubuğu yla numune tutucuyu ana manipülatöre aktarın. Örnek tutucuyu manipülatöre takın.
   5. Transfer çubuğunu geri alın ve yük kilidi ile DINeC haznesi arasındaki vanayı kapatın.
       
2. Vakumdan alınan numunelerin tahliye edilen DINeC odasına aktarılması
   1. DINeC haznesinin CF40 flanşına bağlanabilen taşınabilir bir vakum kabı kullanın. Vakumda hazırlanan numuneleri vakum kırmadan bu kap la aktarın. Numunelerin DINeC sisteminde kullanılan manipülatörle uyumlu bir numune tutucuya monte edilmesini sağlayın.
   2. Taşınabilir vakum konteynerini CF40 flanşına takın ve konteyner ile DINeC odası arasındaki hacmi aşağı pompalayın.
   3. Basınç 2 x 10^-5 mbar'ın altına düştükten sonra, kapı vanalarını DINeC haznesine ve taşınabilir vakum kabına açın ve numuneyi 50 cm'den fazla doğrusal hareketle bir sallantı çubuğu veya başka bir aktarım sistemi kullanarak dinec odasına aktarın.
   4. Transfer sistemini geri çek ve iki kapı vanasını kapatın.

4. Gaz karışımının hazırlanması

1. İlk 10 dakika için gaz karıştırma sisteminin gaz silindirleri boşaltarak helyum yaklaşık% 3 SO₂ karışımı hazırlayın.
2. 1 bar lık bir basınca ulaşıncaya kadar silindirleri SO₂ ile doldurun.
3. Toplam 30 bar'lık bir basınca ulaşıncaya kadar silindirleri helyumla doldurun.
   DİkKAT: SO₂kullanırken, SO₂ silindirlerinin belirlenen gaz dolaplarında depolanması gibi ilgili güvenlik önlemleri her zaman yerine getirilmelidir.

5. DINeC kütle spektrometresinin hazırlanması

1. Gaz silindiri ve meme arasındaki vanayı açın. Gaz karıştırma sisteminin ana hatlarında so₂/He gaz karışımının basıncını 15 bar'a ayarlayın.
2. Manipülatörün konumunu referans örneğinin konumuna ayarlayın.
3. Katyonik kütle spektrumlarını ölçmek için, numune yi ve ızgara önyargısını sırasıyla +40 ve +7 V olarak ayarlayın.
4. Darbeli nozulu ve iyon kapanı kütle spektrometresini sürmek için harici fonksiyon jeneratörü 2 Hz'e ayarlayın. Gecikme jeneratörü ile, iyon kapanından gelen Clear trap sinyali ile darbeli meme için tetikleme sinyali arasındaki zaman gecikmeδt_n'yi 5 ms'e ayarlayın.
5. Kontrol yazılımında, ilgili düğmelere basarak veya ana diyalog penceresinin Mod sayfasında ilgili değerleri yazarak aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Scan Mode: Gelişmiş çözünürlük, Aralık: m/z 50 – 3000, Accu-time: 0.1 ms, Ortalama: 10 döngü, Polarite: katyonik kütle spektrometrelerinin ölçümü için pozitif
   NOT: Aniyonik spektrumların ölçülmesi için, numune ve ızgara önyargısının zemine göre negatif olması, Polaritenin kontrol yazılımında Negatif'e geçmesi gerekir.

6. Kütle spektrumlarının ölçümü

1. DINeC haznesinde 3 x 10^-6 mbar'ın altına bir basınç saplandıktan sonra ölçüme başlanabilir. Önce Stand by tuşuna basarak ve ardından kontrol yazılımında Çalıştır tuşuna basarak ölçümü başlatın. Oynat düğmesine basarak ölçümleri kaydetmeye başlayın.
2. Yaklaşık 300 s. Chromatogram kümesini kullanarak sinyalin zaman bağımlılığını sırasıyla m/z değerine uygulayın. Berrak tuzak sinyali ile darbeli nozulu tetikleyen sinyal arasında δt_n zaman gecikmesi ayarlayarak sinyal yoğunluğunu optimize edin.
3. Manipülatörü ölçülecek numunenin konumuna taşıyın. Numune tutucu düzlemde numune konumunu ayarlayarak sinyal yoğunluğunu optimize edin.
4. İlgi süresi içinde kütle spektrumları edinin. Deney ayrıntılarına göre haznedeki numune sıcaklığı veya arka plan basıncı gibi deneysel parametreleri değiştirin. Deneysel parametreleri değiştirerek kütle spektrumları almaya devam edin.

7. Veri değerlendirmesi

1. Ölçüm tamamlandıktan sonra, Veri Analizi programında ilgili veri kümesini yükleyin. Farenin sağ tuşu ile kromatogramdaki ilgi süresini seçin. Ortalama spektrum ayrı bir pencerede görüntülenir.
2. Spektrumu, tercih edilen bir programda daha fazla işleme için bir veri dosyası olarak dışa aktarın.

   

Sonuçlar

Aşağıda, DINeC-MS'in gerçek zamanlı uygulaması için iki örnek sunulmuştur. Şekil 4, anjiyotensin II'den elde edilen kütle spektrumunun yaklaşık 140 °C'ye ısıtıldığında ki değişimini göstermektedir. Son sıcaklığa ulaşıldığında(Şekil 4B, Şekil 4E), spektrum, H₂O varlığının(m/z = 1029) kaybını gösteren ek bir tepe ile karakterize edilir. Numuneyi bu sıcaklıkta tutarken, anjiyotensin II moleküllerinin daha fazla ayrışması(Şekil 4C),terminal amino asit birimlerinden birinin kaybı da dahil olmak üzere aspartik asit (m/z = 932' de zirve = 932, Şekil 4D). Verilerin nicel analizi altta yatan reaksiyon kinetiğinin değerlendirilmesini sağlar (Şekil 4E). Özellikle Şekil 4E, m/z = 1029'lu varlığın, yoğunluk arttıkça ve sonra azaldıkça daha küçük parçalara ayrıştırılan bir ara varlık olduğunu göstermektedir. Eşlik eden hız sabitleri böylece aynı büyüklük sırasına göredir.

İkinci örnek olarak, anjiyotensin II^22'deki hidrojen/döteryum değişiminin araştırılması Şekil 5'tegösterilmiştir. Anjiyotensin örneğinin DINeC haznesinde D₂O'ya (p_D2O = 10^-4 mbar) maruz kaldıktan sonra, anjiyotensin II'nin izotopik deseni genişletilir ve H atomlarının H değişimi gösteren daha yüksek m/z değerlerine doğru kaydırılır. Süreç ilk 60 s sırasında hızlıdır ancak deneyin devamı boyunca önemli ölçüde yavaşlar: Şekil 5B'deki izotop deseni geniş bir m/z aralığını (yaklaşık 15 m/z birimi) kapsar. Bir moleküldeki değnek liyakat teki H atomlarının sayısı olarak d deuterasyon derecesini tanımladığımızda, d = 0 ile d = 13 arasındaki d değerleri spektrumdan çıkarılabilir. Şekil 5C'deizotop deseni yine genişlik olarak küçültülür. Bu gözlem, en düşük deuterasyon dereceleriyle ilişkili zirvelerin güçlü bir şekilde azalan yoğunluğuna bağlanabilir. Şekil 5D'despektrum daha uzun tepki süreleri için gösterilir. Kapsanan m/z aralığı hemen hemen aynı kalır, ancak spektrumun kütle merkezi hala yavaş yavaş m/z değerlerini artırmaya doğru kaymaktadır. Uzun pozlama süreleri için, moleküllerin bir kısmı en yüksek deuterasyon derecesine ulaşır, d_max = 17. Karboksilik asitler veya amin grupları gibi fonksiyonel gruplara bağlı H atomlarının sayısına göre verilen değiştirilebilir H atomlarının maksimum sayısına karşılık gelir.

Spektrumun zamansal evriminden, H/D değişiminin farklı oran sabitleriyle gerçekleştiği sonucuna varılabilir. Bu gözlemin nicel bir tanımı için, zaman fonksiyonu olarak Şekil 5E'de ortalama deuterasyon derecesi çizilmiştir. Deneysel sonuçların (sembollerin) incelenmesi üç farklı rejimi ortaya koymaktadır: t < 50 s için doperatif hızlı bir artış, 50 s < t < 200 s için bir ara rejim ve t > 200 s için yavaş ama neredeyse sürekli bir artış. Deneysel sonuçlar Monte Carlo simülasyonları ile simüle edildi; reaksiyon sabitleri k_i ile psödo birinci dereceden reaksiyon kinetik moleküllerin fonksiyonel gruplarında H/D değişimi için kabul edildi²². Anjiyotensin II moleküllerinde H/D değişimi için en az üç farklı oran sabiti k_i uygulandığında, her üç rejimde simülasyonlar ve deneysel sonuçlar arasında iyi bir anlaşma elde edilebilmektedir. Şekil 5F,G'de,farklı deuterasyon dereceleri için izotop desenlerinin toplamı ile deneysel izotop desenlerinin takılmasından çıkarılan kinetikler(Şekil 5A - Şekil 5D)gösterilmiştir. Deneysel veriler ve simülasyonlar arasındaki iyi anlaşmanın yanı sıra düşük ve yüksek derecelerde deuterasyonlar için çok farklı döviz kurları açıkça görülmektedir. Heksaglisin gibi farklı oligopeptidler ile karşılaştırıldığında, hızlı döviz kurları açık fonksiyonel gruplara atfedilirken, yavaş döviz kurları peptidin omurgası^22'ninamid gruplarıyla ilişkilendirilmiştir.

Bu ilk iki örnek mikrometre kalınlığında anjiyotensin II örnekleri ile ölçülürken, Şekil 6, elektrosprey iyon ışını birikimi (ES-IBD)²³ile hazırlanan altın numunelerde anjiyotensin II alt monokatma kapsama alanından elde edilen sonuçları göstermektedir. Sinyal yoğunluğunun madde miktarına doğrusal olarak eşit olarak 3 sipariş üzerinde gözlemlendiği görülür, tespit edilen en düşük madde miktarı altın yüzeyindeki tek katmanlı anjiyotensin II moleküllerinin %0,1'ine karşılık gelir. Şekil 5'te gösterildiği gibi H/D değişim deneyleri de alt monolayer rejiminde altın üzerinde anjiyotensin II ile yapılmıştır²³.

Şekil 4: Anjiyotensin II'nin termal bozulmasının gerçek zamanlı gözlemi. (A-C) Anjiyotensin II örneğinden küme kaynaklı desorpsiyon/iyonizasyon sonrası elde edilen kütle spektrumları. (A) RT. (B) Numunede taze numune yaklaşık 140 °C'ye kadar ısıtılır. Bozulmamış molekül [M+H]⁺ile ilişkili olan m/z = 1047'deki zirveye ek olarak, m/z = 932, 1012 ve 1029'daki zirveler görünür (oklarla gösterilir). (C) İkinci zirveler artar ve numuneyi yüksek sıcaklıkta tutarken ana tepe zamanla azalır. (D) Anjiyotensin II yapısal formülü bir amino asit birimi (aspartik asit) kaybı ile m / z = 932 de zirve görünümünü yol açan parça (kahverengi braketler) gösteren. (E) Örnek sıcaklığının zamana bağımlılığı ve (A) ile (C) arasında bulunan ana zirvelerin yoğunluğu. Düz çizgiler göze kılavuzluk eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Anjiyotensin II'de H/D değişiminin gerçek zamanlı gözlemi. (A-D) DINeC-MS ile elde edilen anjiyotensin II'nin katyonik kütle spektrumları H/D değişimi nedeniyle izotop deseni genişler ve (B)'de (D)'de (D)'de (A)gösterilen izotop desenine kıyasla daha yüksek m/z değerlerine doğru ilerler. Kırmızı çizgiler veridir, kesik lisa çizgileri farklı deuterasyon dereceleri dikkate alınarak verilere uyar. (E) Denemelerden (açık nokta) çıkarılan zamanın bir fonksiyonu olarak ortalama deuterasyon derecesi d. Buna ek olarak, Monte Carlo simülasyonları ile ortaya çıkarılan zamanın bir fonksiyonu olarak d. gösterilir. Siyah kesikli eğri: bir oran sabiti dikkate alarak simülasyonlar (k₁); kırmızı eğri: üç oransabitleri dikkate alarak (k₁, k₂, k₃). (F,G) Monte Carlo simülasyonlarının (kesik çizgiler) ilgili sonuçlarıyla birlikte zamanın bir fonksiyonu olarak anjiyotensin II'nin (semboller + katı çizgiler) seçilen derecelerde göreceli sinyal yoğunlukları. Bu rakam referans 22'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: DINeC-MS'in anjiyotensin II'ye alt monolayer rejiminde altın üzerine uygulanması. (A) Altmonolayer rejiminde izole anjiyotensin II moleküllerinin kütle spektrometresi için birikintisi için ES-IBD ve DINeC-MS kombinasyonunun şematik gösterimi. (B) İki bağımsız veri kümesinden (doldurulmuş ve açık semboller) elde edilen numuneye yatırılan miktar adadaki sinyal yoğunluğunun bağımlılığı. Insets: DINeC kütle spektrumları, bir miktar maddenin yatırıldığı örneklerden elde edildiği gibi. Bu rakam 23. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bugüne kadar yapılan birçok çalışmada dinec-MS'in çeşitli maddeler üzerinde yüksek hassasiyetgösterdiği gösterilmiştir. Nitekim, bu femtomol rejiminde madde bir miktar aşağı analit ölçümleri sağlar¹¹. Bu yüksek hassasiyet nedeniyle, DINeC kütle spektrumlarında kontaminasyonu önlemek için numune hazırlama, özellikle substrat temizliği, son derece saf kimyasallarla yapılmalıdır. Birçok analiz tekniğinde olduğu gibi, boş bir alt tabakadan uygun bir arka plan ölçümü, analit ve yüzeylerinin kökeni substrat/numune hazırlamada bulunan zirvelerden ayrılmasına yardımcı olur.

Biz belirli bir analit molekülünün iyonizasyon olasılığı kuvvetle karışık örneklerde co-adsorbates veya co-bileşenlerin varlığı etkilenmez göstermiştir rağmen^17,24, iyonizasyon olasılığı maddeden maddeye değişebilir¹³. Bu nedenle, onların iyonizasyon olasılığına bağlı olarak, kirleticiler, analiz çok daha güçlü sinyalkatkıda bulunabilir gibi temiz koşullar altında çalışmak daha da önemlidir. Önceden biçimlendirilmiş iyonlar (örneğin, birçok boya molekülü örneğinde bulunduğu gibi), ya da proton alımı veya deprotonasyonuna (yani bazlar veya asitler) açık bir eğilim gösteren fonksiyonel gruplara sahip moleküller genellikle DINeC-MS'de yüksek iyonlaşma olasılığı gösterir. Analitte böyle bir fonksiyonel grup yoksa iyonizasyon olasılığı düşük olabilir. Numuneler daha sonra trifloro asit gibi iyonlaştırıcı ajanlarla tedavi edilebilir (örn. numunenin iyonlaştırıcı ajanın buhar basıncına maruz kalmasına neden olabilir).

Şekil 4 ve Şekil 5'te tartışılan temsili sonuçlar, DINeC-MS'in kütle spektrometresi yoluyla kimyasal reaksiyonların gerçek zamanlı tetkiklerinde uygulanabilirliğini göstermektedir. Şekil 6 yöntemin alt monolayer-duyarlılığını göstermektedir. Bu iki özellik birleştirilirse, yüzeylerdeki ve ürünlerindeki kimyasal reaksiyonlar gerçek zamanlı olarak takip edilebilir^23. Bu yüzeylerde makromoleküler yapıların montajı yol açan sözde "yüzey sentezi" için ilgi özellikle olabilir^{3,33,34,35,36}. Mevcut kurulumda, bu tür yüzey reaksiyonlarının gözlemi altın²³ ve diğer asil metaller gibi daha düşük reaktiviteye sahip yüzeylerde mümkündür; desorpsiyon odasındaki baz basıncı 10^-7-mbar aralığında olduğu için, silikon yüzeyler³⁷gibi yüksek reaktif yüzeylerde deneylerin yapılması daha zordur. Mevcut faaliyetler bu sınırlamayı ele almakta ve UHV uyumlu bir DINeC aygıtı oluşturulmaktadır. Reaktif yüzeylersöz konusu olduğunda, SO₂ ile substrat yüzeyi arasındaki etkileşim, yüzey adsorgirlerinin ve yüzey reaksiyonlarının ölçümlerinden önce test edilmelidir.

Küme ışını nötr olduğu için odaklanamaz. Böylece numune üzerindeki Kiriş boyutu, kullanılan kaymazın kurulumu ve deliğinin geometrisi ile verilir; numuneüzerindeki ışın çapı için tipik değerler bir ila birkaç milimetredir. Sonuç olarak, numuneyi tarayarak görüntüleme ancak çok düşük çözünürlükte mümkündür. Öte yandan, yüksek iyonizasyon olasılığı¹³tarafından verilen, DINeC verimli desorbed moleküllerinkullanır. Böylece, DINeC-MS ve iyon görüntüleme dedektörü³⁸ bir arada son derece çekici gibi görünüyor.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone rotisolv HPLC	Roth	7328.2	HPLC Gradient Grade
Copper tape
Ethanol rotisolv HPLC	Roth	p076.1	HPLC Gradient Grade
Helium	Praxair	4800086706	Purity 99.9999%
Nitrogen	Praxair	40728408	Purity 99.5 - 100%
Silicon Wafers	Active Business Company GmbH	G60007
Sulfur dioxide	Air Liquide	P1734S10R0A001	Purity 99.98%
Water rotisolv LC-MS	Roth	HN43.1	Ultra LC-MS