Koroner Anjiyoplasti Sonrası Kardiyovasküler Prognozda Koroner Progenitor Hücreleri ve Çözünür Biyobelirteçler

Özet

Koroner anjiyoplasti sonrası kardiyovasküler prognozu etkileyen majör advers kardiyovasküler olayların gelişimi koroner hasar ve vasküler onarım ın boyutundan etkilenir. Yeni koroner hücresel ve çözünür biyobelirteçlerin kullanımı, vasküler hasar ve onarım reaktif, MACE ve prognoz gelişimini tahmin etmek için yararlıdır.

Özet

Majör advers kardiyovasküler olaylar (MACE) koroner iskemik yaralanmaya bağlı koroner anjiyoplasti geçiren hastaların kardiyovasküler prognozunu olumsuz etkiler. Koroner hasarın boyutu ve vasküler onarım mekanizmaları MACE'lerin gelecekteki gelişimini etkileyen faktörlerdir. Plak özellikleri ve koroner arter kompleksi gibi içsel vasküler özellikler MACE'ler için prognostik bilgi göstermiştir. Ancak, intrakoroner sirkülasyon biyobelirteçlerinin kullanımı, koroner hasar ve onarımı içeren dinamik mekanizmaları daha yakından yansıttığı için MAC'lerin erken teşhisi ve prognozu için uygun bir yöntem olarak öne sürülmemiştir. Anjiyoplasti sırasında koroner sirkülasyon biyobelirteçlerinin belirlenmesi, mononükleer progenitor hücrelerinin alt popülasyonlarının sayısı (MpCs) yanı sıra inflamasyon yansıtan çözünür moleküllerin konsantrasyonu gibi, hücre yapışması, ve onarım, sağlar gelecekteki gelişmelerin değerlendirilmesi ve MACE'lerin prognozu 6 ay sonrası koroner anjiyoplasti. Bu yöntem, çEL'lerin tahmini ve hastaların risk tabakalaşması için uygulanabilecek kardiyovasküler prognoz üzerindeki etkisi ile ilgili periferik kan dolaşımı biyobelirteçlerinden daha iyi performans ve çevirisel yapısı ile vurgulanmıştır. anjiyoplasti geçiren koroner arter hastalığı ile.

Giriş

Koroner anjiyoplasti ve stent, koroner arter hastalığı (CAD) olan hastalar için bir kurtarma prosedürünü temsil eder. Ancak kardiyovasküler ölüm, miyokard infarktüsü, koroner restenoz ve anjin veya dekompanse kalp yetmezliği atakları da dahil olmak üzere majör advers kardiyovasküler olaylar (MACE) koroner girişimden aylar sonra ortaya çıkabilir ve bu da hastaneye planlanmamış ziyaretlere yol açabilir. MAC'ler dünya çapında yaygındır ve morbi-mortaliteleri1'dir.

Koroner iskemik yaralanma erken vasküler yanıt ve reparative mekanizmaları onların farklılaşma yeteneği ve / veya anjiyo-reparative potansiyeli nedeniyle MPC'lerin mobilizasyonu içeren yanı sıra hücreler arası yapv molekülleri (ICAM), matris metalloproteinases (MDP) ve reaktif oksijen türleri gibi çözünür moleküllerin üretimi, hücre adezyonu yansıtan, doku remodeling, ve okside okside edici. Plak özellikleri ve koroner arter karmaşıklığı gibi içsel vasküler özellikler MACE'leri tahmin etmek için kullanılmış olsa da, bazı çalışmalar koroner endotel'de meydana gelen yaralanma ve onarım mekanizmalarına bağlı biyobelirteçlerin koroner anjiyoplasti^2,3,4,5'egönderilen CAD'li hastalarda kardiyovasküler olayların erken teşhisi ve prognozu için çok yararlı olabileceğini ileri sürmüştür.

CAD yaralanma ve onarım altında yatan mekanizmaları anlamak sürekli ilgi intrakoroner sirkülasyon biyobelirteçleri çalışmaya araştırmacılar motive etti, koroner örnekleme daha yakından vasküler hasar yansıtır çünkü ve onarım⁶. Ancak, insan çalışmalarında koroner biyobelirteçlerin karakterizasyonu kıt olmuştur^7,8,9. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı koroner sirkülasyon MpC'ler ve çözünür moleküllerin miktarını belirlemek için bir yöntem tanımlamak için, hem vasküler yaralanma ve onarım yansıtan, ve bu biyobelirteçler MACE ve koroner anjiyoplasti uygulanan CAD hastalarının klinik prognoz ile ilişkili olup olmadığını göstermek için. Bu yöntem damar hasarına en yakın yerleri örnekleme ile elde edilen vasküler ilgili, sirkülasyon mpc'leri ve çözünür moleküllerin kullanımına dayanmaktadır. Ayrıca alt ekstremite iskemi, inme, vaskülit, ventromboz ve vasküler yaralanma ve onarım içeren diğer yaralanmalar için klinik çalışmalar için yararlı olabilir.

Protokol

Bu protokol, insan araştırmaları etik komitesinin kurumsal yönergelerini karşılamaktadır.

1. Koroner Anjiyografi, Ultrason ve Kan Örneği

1. Koroner girişimden önce temel klinik ve demografik bilgi isteyin. Bireyin verilerini toplayın: yaş, cinsiyet, mevcut sigara durumu, vücut kitle indeksi (VKİ), yüksek tansiyon, dislipidemi, diabetes mellitus, ilaçlar, ve mevcut koroner anjiyografi endikasyonu.
2. Radyal bir yaklaşım kullanarak kalp kateterizasyonu ile koroner anjiyografi yapın. Bu işlem uzman kardiyologlar tarafından hemodinamik odasında floroskopi kılavuzu altında yapılmalıdır.
   NOT: Değerli gemileri tanımlayın. Bu çalışmada değerli damarlar 1.5 mm'den büyük kesitli arterler ve %50'den fazla lümen darlığı olarak tanımlanmıştır.
3. İntravasküler ultrason kateterini ilgi bölgesine ilerletin ve görüntüleri kaydedin. En küçük ışık alanını bulmak ve ölçmek için uygun yazılımı kullanın.
4. Plak en yakın yerden 10 mL kan toplamak için bir koroner kateter kullanın.
5. Hasta taburcu olduktan sonra, çalışma bitiş noktalarını takip etmek için periyodik tıbbi değerlendirmeler planlayın. Telefon lateması mümkün değilse veya doktor ziyareti 2 aydan uzun bir süre gecikirse, çalışmanın bitiş noktalarını doğrulamak için yetkili bir kişi (önceden tasarlanmış) isteyin.
   NOT: Aşağıdaki macelerden herhangi birini düşünün: 1) kardiyovasküler ölüm, 2) yeni miyokard enfarktüsü, 3) 24 saat içinde planlanmamış bir tıbbi ziyaret isteyen kararsız anjina, 4) koroner anjiyografi ile gösterildiği gibi stent restenozis, 5) dekompanse ataklar klinik dikkat gerektiren kalp yetmezliği.

2. Sirkülasyon MPC'lerinin Belirlenmesi (Şekil 2)

1. Toplama dan 1 saat içinde kan süreci. Toplanan kanın 6 mL'sini 15 mL konik bir tüpe aktarın ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS), pH = 7,4 ile 1:1 (v/v) seyreltin.
2. Üç test tüpüne 2 mL yoğunluk gradyan ortamı ekleyin. Dikkatle yoğunluk gradyan orta içeren her test tüpü içine seyreltilmiş kan üç eşit hacimli aliquots aktarın.
   NOT: Yoğunluk gradyan orta ve seyreltilmiş kanın toplam hacmi test tüpü maksimal kapasitesinin dörtte üçünü geçmemelidir.
3. Santrifüj 1.800 x g, 4 °C için 30 dk. Katmanlar arasındaki arayüzdeki bandı yeni bir tüpe aktarın. 1.800 x g,6 dk için 4 °C'de 2 mL PBS ve santrifüj ekleyin. Pelet MPC'leri içerecektir.
4. Peleti birkaç kez yıkayın. Önceki çözeltiyi aspire edin ve taze PBS'de hücre peletini nazikçe yeniden askıya alın. Sonraki yıkıntılar için, santrifüj 1.800 x g, 4 °C 2 dk. İşlemi 6x tekrarlayın.
5. PBS 1 mL hücre pelet resuspend. Hücre süspansiyonunun 20 μL'sini %0,4 trypan mavisi ile karıştırın, seyreltilmiş 1:1 (v/v). Bir hemositometre bir damla uygulayın ve bir ışık mikroskobu altında lekesiz hücreleri saymak.
6. MPCs tayini devam edin. Etiket 5 mL akış sitometri tüpleri ve tüp başına 1 x 10⁶ hücre dışarı aliquot. Karşılık gelen isotip uyumlu kontrol antikorlarını hazırlayın. Santrifüj 1.800 x g, 4 °C 6 dakika için ve supernatant atın.
7. 1x PBS (pH = 7.4), 2 mM ethylenediamamintetraasetik asit (EDTA) ve %0.05 büyükbaş serum albumin (BSA) içeren bir antikor kuluçka çözeltisinin 100 μL'lik bir kısmını seyreltilmiş primer antikor ekleyin. 10 s için resuspend ve 4 °C'de 20 dakika kuluçka, ışık korumalı. Protokol bu adımda PBS'de %4 paraformaldehitteki lenfositlerin sabitlenmesi ve 4 °C'de 24 saate kadar numunelerin depolanması ile duraklatılabilir.
   NOT: Bu protokolde kullanılan primer antikorların son konsantrasyonları CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50 idi.
8. Santrifüj 1.800 x g, 4 °C 2 dk ve supernatant atın. 1x PBS 'nin 500 μL'sinde (pH = 7.4), 2 mM EDTA'da yeniden askıya alın.
9. Akış sitometri analizini yapın. Arka plan boyama kurmak için isotype uyumlu kontrol antikorları kullanın. Daha sonra, seçerek fsc / SSC arsa yayılmış lenfositler, artık granülositler dışlamaya çalışırken, hücresel enkaz, ve diğer parçacıklar, genellikle alt bulunan, arsa sol ayarı. Bu dağılım %100 olarak kabul edilir.
10. Ortak immünoffenotip CD45⁺ ve CD34⁺ile hücrelerin yüksek sayıda içeren bir kapı kullanın. Çift pozitif immünofenotipleri için, daha önce CD45⁺, CD34⁺tanımlayan bir kapı kdr (VEGFR-2)^{+ ,}CD133⁺veya CD184⁺eklenmesi ile kullanın. MPC alt popülasyonlarını belirli hücre yüzey ibelirteçlerine göre tanımlayın. Geçitli olayların yüzdesi olarak bildirin.
11. MPC'lerin ana alt popülasyonlarını tanımlayın. Bu çalışmada ana immünfenotipleri CD45⁺CD34⁺CD133⁺, CD45⁺CD34 + CD45⁺CD184⁺, CD45⁺CD184⁺CD433⁺CD184⁺, CD45⁺CD34⁺KDR⁺, CD45⁺CD34 + CD34 + KDR^+CD133+ve CD45⁺CD34⁺KDR⁺CD14.
    NOT: Kullanılan hücre yüzeyi belirteçleri CD45 (lenfositler), CD34 (endotel ve/veya vasküler hücreler), KDR (VEGFR-2, endotel hücrelerinin membran belirteci), CD133 (endotel progenitor hücreleri) ve CD184 (hematopoetik kök hücreler ve endotel hücreleri) idi.

3. Plazmada Çözünen Biyobelirteçlerin Belirlenmesi

1. SICAM-1 ve MMP-9 konsantrasyonlarını belirlemek için enzime bağlı immünosorbent ttiki (ELISA) kullanın(Şekil 3, üst sıra).
   1. 3.000 x gkan örneklerini santrifüj, oda sıcaklığında 5 dk ve plazma toplamak.
   2. Standartları, numune tüplerini ve kontrol tüplerini etiketleyin. ELISA kitinde bulunan yıkama tamponu ile 2 kat yıkayarak, önceden kaplanmış kuyuları analiz tabağındaki önceden kaplanmış kuyuları dengeleyin.
   3. Standartları, numuneleri ve kontrolleri kuyulara aktarın. 90 dk için 37 °C'de mühür ve kuluçka.
      NOT: Kuyuların tamamen kurumasına izin vermeyin.
   4. İçeriği atın ve biotin algılama antikor ekleyin. 37 °C'de 60 dk.'da mühürleyin ve kuluçkaya yatırın.
   5. İçeriği atın ve 3x yıkayın. Plak ve inkübate sırayla streptavidin çalışma çözeltisi ile 37 °C'de 37 °C'de, ışık la korunan. Kuluçkalar arasında 3x yıkayın. Renk geliştiğinde, durdurma çözümlerini ekleyin ve bir mikroplaka ELISA okuyucuda optik yoğunluk emiciliğini okuyun.
2. Tümör nekroz faktör alfa (TNFα) ve interlökin 1 beta (IL-1β) konsantrasyonu belirlemek için bir immüno-manyetik multiksing testi kullanın(Şekil 3, alt satır).
   1. Standartları, numune tüplerini ve kontrol tüplerini etiketleyin.
   2. 30 s. Için manyetik boncuk şişeleri girdap uygun büyüklükte tüpler için boncuk süspansiyon aktarın, ve sonra çoklama test plakası kuyulara. Periyodik girdap boncukların yağışını önler.
   3. El manyetik plakayı güvenli bir şekilde takın. Boncuklar her kuyunun altında birikmesi için 2 dakika bekleyin ve hızlı bir şekilde bir lavabo veya atık konteyner üzerinde, hem el manyetik plaka yıkayıcılık ve plaka montaj ters. Kuyuların içindeki boncukları korumak için elde tutulan manyetik plakayı yıkama yıkamayı unutmayın.
   4. Her kuyuya 150 μL yıkama tamponu ekleyin ve boncukların alt tabakada birikmesine izin vermek için 30 s bekleyin. 3.2.3 adımdaki gibi içindekileri atın. Ardından, 25 μL evrensel test arabelleği (kitte sağlanan) ve ardından 25 μL hazırlanmış standartlar, numuneler ve kontroller ekleyin.
   5. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında en az 60 dakika kuluçka, ışık korumalı, sürekli 500 rpm sallayarak. Alternatif olarak, mümkünse 500 rpm sürekli sallayarak, 4 °C, ışık korumalı bir gecede kuluçka.
   6. 150 μL yıkama tamponu ekleyerek 2kat yıkayın ve 30 s bekleyin. Bekleyin 2 dakika ve bir lavabo veya atık konteyner üzerinde ters.
   7. 25 μL algılama antikor karışımı ile sırayla kuluçkaya yatırın ve ardından oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 25 μL streptavidin-PE çözeltisi, kapalı ve ışık korumalı ve 500 rpm'de sürekli titreme ile. 3.2.6 adımda açıklandığı gibi kuluçkalar arasında 2x yıkayın.
   8. Okumaları alın. 120 μL okuma arabelleği ekleyin. Plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatın, ışıkla korunun, sürekli 500 rpm'de sallayın. Okumayı çoklayıcı bir test okuyucusunda çalıştırın. Okuma parametrelerini her analyte göre ayarlayın.

Sonuçlar

Koroner anjiyografi yapılan 52 hastadan koroner, venöz sinüs ve periferik kan toplandı ve hipertansiyon ve dislipidemi prevalansı yüksek tiyatuvar ı gösterdi. Klinik takipte 11 (%21.1) MAC'ler koroner anjiyografiden 6 ay sonra meydana geldi: ölüm (n = 1), hastaneye devam gerektiren anjina (n = 6), miyokard enfarktüsü (n = 2) ve/veya kalp yetmezliği bulgusu (n = 4).

Çoğu MpC'nin temel ...

Tartışmalar

Etkilenen koroner arterden kan toplanması zor olabilir. Bazen koroner artere zar zor ulaşılabiliyor. Bu durumda venöz sinüsten örnekleme alternatif olabilir. Koroner arter ile venöz sinüste dolaşan biyobelirteçleri karşılaştıran doğrulama testleri yaptık ve anlamlı bir farklılık olmadı. Ancak, dolaşan biyobelirteçlerin performansı sadece koroner örnekleme için doğrulandı. Bu nedenle venöz sinüsten elde edilen biyobelirteçlerin performansı araştırılacak.

Kan to...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Roche	10735086001	Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer	Without brand	Without catalog number	Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes	BD Vacutainer	#367863	Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL	CRM Globe	PF1016, PF1015	The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes	KIMBLE CHASE	45060 13100	Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm