Antibiyotik Direnci Platformu Kullanarak Antibiyotik Dereplication

Özet

Biz antibiyotik dereplication için izojenik antibiyotiğe dirençli Escherichia coli bir kütüphane kullanan bir platform açıklar. Bakteri veya mantarlar tarafından üretilen bir antibiyotiğin kimliği, kendi direnç genini ifade eden E. coli'nin büyümesi ile ortaya çıkarılabilir. Bu platform ekonomik açıdan etkili ve zaman etkindir.

Özet

Doğal ürün özleri yeni antibiyotikler için arama ana zorluklardan biri ortak bileşiklerin yeniden keşfi. Bu zorluğu gidermek için, bilinen bileşikleri tanımlama işlemi olan çoğaltma, ilgi örnekleri üzerinde gerçekleştirilir. Analitik ayırma ve kütle spektrometresi gibi dereplik yöntemleri zaman alıcı ve kaynak yoğun. Dereplik sürecini iyileştirmek için antibiyotik direnci platform (ARP) geliştirdik. ARP, Escherichia coli içine tek tek klonlanmış yaklaşık 100 antibiyotik direnci geninin yer aldığı bir kütüphanedir. Bu suş toplama antibiyotik dereplication için bir maliyet-etkin ve kolay yöntem de dahil olmak üzere birçok uygulama vardır. Süreç, katı ortam içeren dikdörtgen Petri kaplarının yüzeyinde antibiyotik üreten mikropların fermantasyonunu içerir ve böylece ikincil metabolitlerin orta yoluyla salgılanmasına ve yayılmasına olanak tanır. 6 günlük fermantasyon döneminden sonra mikrobiyal biyokütle çıkarılır ve petri kabına ince bir agar-bindirme ilave edilip pürüzsüz bir yüzey oluşturur ve E. coli indikatörlerinin büyümesini sağlar. ARP suşları koleksiyonumuz daha sonra antibiyotik içeren Petri kabının yüzeyine sabitlenir. Plaka bir sonraki bindirme yüzeyinde E. coli büyüme sağlamak için bir gecede kuluçka. Sadece belirli bir antibiyotiğe (veya sınıfa) direnç içeren suşlar bu yüzeyde büyür ve üretilen bileşiğin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu yöntem, bilinen antibiyotik üreticilerinin belirlenmesi nde ve yeni bileşikler üretenleri belirlemek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır.

Giriş

1928 yılında penisilin keşfinden bu yana, çevresel mikroorganizmalardan elde edilen doğal ürünler antimikrobiyal bileşiklerin zengin bir kaynak olduğu kanıtlanmıştır^1. Doğal ürün antibiyotiklerin yaklaşık % 80'i Streptomyces ve diğer aktinomycetes cinsinin bakterilerinden elde edilirken, geri kalan %20'si mantar türleri tarafından üretilmektedir^1. Klinikte β-laktamlar, tetrasiklinler, rifamycins ve aminoglikozitler gibi en yaygın antibiyotik iskelelerinden bazıları başlangıçta mikroplardan izole edilmiştir². Ancak, çoklu ilaca dirençli (MDR) bakterilerin yükselişi nedeniyle, antibiyotik mevcut panel tedavide daha az etkili hale gelmiştir^3,4. Bunlar arasında "ESKAPE" patojenleri (yani vankomisindirençli enterokoklar ve β-laktam dirençli Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, ve Enterobacter sp.), dünya sağlık örgütü 3 gibi büyük halk sağlığı yetkilileri nin en yüksek risk ile ilişkili olduğu düşünülen bakterilerin bir alt kümesi olan^3,4,5. Bu MDR patojenlerinin ortaya çıkması ve küresel yayılması yeni^{antibiyotikler}için sürekli bir ihtiyaç^3,4,5sonuçları . Ne yazık ki, son yirmi yılda mikrobiyal kaynaklardan yeni antibiyotiklerin keşfi giderek zor olduğunu göstermiştir⁶. İlaç keşfi için mevcut yaklaşımlar biyoaktif bileşiklerin yüksek iş gücü tarama dahil, doğal ürün özü kütüphaneler de dahil olmak üzere, belirli bir zamanda test edilecek özleri binlerce izin². Ancak, bir kez antimikrobiyal aktivite tespit edilir, bir sonraki adım aktif bileşeni tanımlamak ve bilinen veya gereksiz bileşikler⁷içeren ortadan kaldırmak için ham özü içeriğini analiz etmektir^{7 ,8}. Bu süreç, dereplication olarak anılacaktır, önlemek ve / veya önemli ölçüde bilinen^{antibiyotiklerin}yeniden keşfi harcanan zamanı azaltmak için hayati önem taşımaktadır 7^,9. Doğal ürün ilaç keşfi gerekli bir adım olmasına rağmen, dereplication kötü üne sahip zahmetli ve kaynak yoğun¹⁰.

Beutler ve ark. ilk dönem "dereplication" icat beri, geniş çabalar bilinen antibiyotiklerin hızlı belirlenmesi için yenilikçi stratejiler geliştirmek için yapılmıştır^11,12. Bugün dereplik için kullanılan en yaygın araçlar yüksek performanslı sıvı kromatografisi, kütle spektrometresi ve nükleer manyetik rezonans tabanlı algılama yöntemleri^11,13gibi analitik kromatografik sistemleri içerir. Ne yazık ki, bu yöntemlerin her biri pahalı analitik ekipman ve sofistike veri yorumu kullanımını gerektirir.

Hızla özel ekipman olmadan yapılabilir bir dereplication yöntemi geliştirmek için bir girişim, biz antibiyotik direnç platformu (ARP)¹⁰kurdu. ARP antibiyotik adjuvants keşfi için kullanılabilir, bilinen direnç mekanizmalarına karşı yeni antibiyotik bileşiklerin profilleme, ve aktinobakteriler ve diğer mikroplardan elde edilen özlerde bilinen antibiyotiklerin derepifasyonu. Burada antibiyotik derepyonu uygulamasına odaklanıyoruz. ARP en sık yeniden keşfedilen antibiyotiklere karşı etkili bireysel direnç genleri ifade izojenik Escherichia coli suşları bir kütüphane kullanır^14,15. E. coli kütüphanesi ikincil bir metabolit üreten organizmanın varlığında büyüdüğünde, bileşiğin kimliği, ilişkili direnç^geniniifade eden E. coli suşlarının büyümesi ile ortaya çıkarılabilir 10 . ARP ilk rapor edildiğinde, kütüphane 16 antibiyotik sınıfına direnç kazandıran >40 genden oluşuyordu. Orijinal dereplication şablonu derepifasyon işlemi sırasında antibiyotik alt sınıf ile ilgili bilgi sağlamak için antibiyotik sınıfı başına direnç genlerinin bir alt kümesini kapsayacak şekilde tasarlanmıştır. Bugün, ARP 18 antibiyotik sınıflarına direnç veren >90 genlerden oluşmaktadır. Direnç genleri bizim geniş koleksiyonu kullanarak, ikincil bir dereplik şablonu geliştirilmiştir ve minimal antibiyotik direnç platformu (MARP) olarak bilinir. Bu şablon, gen artıklığını ortadan kaldırmak ve sadece dereplicated metabolitin ilişkili olduğu genel antibiyotik sınıfı ile ilgili bilgi sağlamak için oluşturuldu. Ayrıca, MARP şablonu hem wildtype ve E. coli BW25113(E. coli BW25133ΔB ΔBΔtolC)bir hiperpermeable / efflux eksik suşu sahip, Sadece ARP orijinal cisimleşme ile karşılaştırıldığında, hiperpermeable suş kullanır. Bu benzersiz yönü dereplik sırasında ek fenotipler oluşturur, Gram-negatif bakterilerin dış membran çapraz bir bileşikler yeteneği gösteren. Burada, ARP ve/veya MARP ile çoğaltma yaparken izlenecek sağlam bir protokolü açıklar, izlenecek en kritik adımları vurgular ve çeşitli olası sonuçları tartışırız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. E. coli Kütüphanesi Gliserol Stoklarının Hazırlanması (Agar Eğimlerinden)

1. ARP/MARP E. coli suşlarını lysogeny suyu (LB) agar eğimlerinden LB agar ve uygun seçilebilir marker içeren Petri kaplarına doğru çizgileyin(Tablo 1).
2. Tek bir koloni ile uygun seçilebilir marker içeren LB 3 mL aşılayarak E. coli suşlarının her biri için kültürler hazırlayın. Havalandırma (250 rpm) ile 37 °C'de bir gecede büyüyün.
3. 800 μL kültür ve 200 μL steril% 80 gliserol bir 1.8 mL cryovial birleştirin. Tüpleri 3−4 kez ters çevirerek karıştırın ve -80 °C'de saklayın.

2. ARP/MARP Dondurulmuş Stok Kütüphanesi Plaka Hazırlama

1. Bölüm 1'de hazırlanan gliserol stoklarında lb agar ve uygun seçilebilir marker içeren yeni bir Petri yemeği setine arp/MARP suşları çizgi. 37 °C'de bir gecede büyüyün.
2. Aseptik tekniği kullanarak, pipet 500 μL katyon, steril bir rezervuardan 96 derinliğindeki kuyu plakasının her kuyusuna Mueller Hinton suyu (MHB) ayarladı.
3. Adım 2.1'de hazırlanan plakalarla, 96 derin kuyu plakasını ARP/MARP haritasına uygun olarak aşılamak için aplikatör çubuğu kullanın (Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2). Her kuyuya uygun seçilebilir işaretçinin eklenmiştir. Derin kuyu plakayüzeyine nefes alabilen bir sızdırmazlık membranı yerleştirin ve bir gecede 37 °C 'de (250 rpm) kuluçkaya yatırın.
4. ARP/MARP haritasına atıfta bulunarak kontamine kuyu olmadığından emin olun. Kirlenmişse tekrarlayın. Çok kanallı pipettor kullanarak, derin kuyu plakasının her kuyusundan 100 μL'lik steril 96 kuyulu yuvarlak alt plakaya aktarın. Birden çok dondurulmuş stok kitaplık plakası oluşturmak için bu adımı yineleyin.
   NOT: Dondurulmuş stok kütüphanesi plakası kontaminasyonu durumunda 2.1−2.4 adımlarını tekrarlamamak için bir seferde en az 5 kütüphane plakası hazırlamak en iyisidir.
5. Her kuyuya 100 μL steril %50 gliserol pipetleme ve yavaşça yukarı ve aşağı borulama tarafından karıştırın arp / MARP dondurulmuş stok kütüphane plakaları yapma bitirmek.
6. Plakaları steril alüminyum contalarla kaplayın ve her kuyunun ayrı ayrı mühürlenmesini sağlayın.
7. Plakaları numaralandırın ve belirli bir zamanda yeni şablonlar aşılamak için yalnızca bir dondurulmuş stok kitaplık plakası ayırın. Dondurulmuş stok kitaplık plaka kontaminasyon durumunda yedek olarak geri kalanı tutun.
8. Plaka kapağını alüminyum contanın üzerine yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.

3. Tohum Kültürü ve Çoğaltma Plakası Hazırlama

1. Bir aplikatör çubuğu kullanarak, 3 mL'lik Streptomyces antibiyotik ortamını (SAM) (veya test edilen organizma için diğer uygun ortam) steril cam boncuk içeren bir test tüpünde (miselyumun parçalanması için) aşılayın. dereplicated. Streptomyces için, yavaşça bir koloninin yüzeyinden sporları kazımak.
2. Aynı ahşap aplikatör çubuğunu kullanarak, Bennett'in agarını içeren bir Petri kabında sterilite kontrolü yerleştirin.
3. Tohum kültürünü 30 °C'de 6 gün (250 rpm) havalandırma ile kuluçkaya yatırın ve sterilite kontrol plakasını 6 gün boyunca 30 °C'de inkübedin.
   NOT: SAM ve Bennett'in medya tarifleri için Tablo 2'ye bakın. Yukarıdaki talimatlar çoğu aktinomisit için uygundur. Diğer bakteri ve mantarlar için gerekli olan büyüme ortamını değiştirin.
4. Bir serolojik pipet içine sıcak Bennett's agar 23 mL aspire tarafından dereplication plakaları hazırlayın ve dikdörtgen Petri çanak(Tablo Malzeme)yüzeyinde eşit dağıtmak , önlemek için pipet içinde orta kalan bırakarak hava kabarcığı oluşumu.
   NOT: Plaka dökmek için kullanılan yüzeyin düz olduğundan emin olun ve agar çok fazla soğumadan önce bu adımı gerçekleştirin; düz bir yüzey sonraki aşamalarında kütüphane sabitleme için zorunludur.
5. Orta plakanın tüm alanlarını kaplayana kadar plakayı yavaşça döndürün ve agar tamamen ayarlanana kadar onu rahatsız etmeyin.
6. Dikdörtgen Petri çanak kapağını bir izleme şablonu olarak kullanarak nitroselüloz membran levhaları(Malzeme Tablosu)hazırlayın, böylece yapraklar çoğaltma plakasının yüzeyine uyun. Çarşafları kesin ve steril bir kese içinde otoklavlayın.
   NOT: Bu membran organizmaların yüzeyinde sporulate sağlar, ikincil metabolitleri aşağıdaki ortama atılır iken. Bir kez büyüdü, membran dereplik için temiz bir yüzey sağlamak için kaldırılır. Membran kağıdının Bennett'in agarının yüzeyine ne kadar yakın olduğu ne kadar yakınsa, çoğaltma sonucu o kadar temiz dir.
7. 6 günlük kuluçkadan sonra kirletici madde bulunmadığından emin olmak için sterilite kontrol plakasını kontrol edin. Kirlenmezse, dikdörtgen Petri kabının kapağını ve bilacı kültürünün 200°L'lik kısmını Bennett'in agarının yüzeyine çıkarın.
8. Eşit steril bir pamuk lu bez kullanarak tüm plaka yüzeyine kültür yayıldı.
9. Petri kabının yüzeyinde kültürün üstüne adım 3.6 hazırlanan nitroselüloz membran yerleştirin. Petri kabının alt kenarına membran Alt kenarı hizalayarak başlayın ve yavaş yavaş plaka üst kenarına alt kenarından membran uygulayın.
10. Membran-agar arayüzü arasında oluşmuş olabilecek hava kabarcıklarını düzeltmek için steril pamuklu bir bez kullanın, membranın agara floş olmasını sağlamak.
11. Kapağı dikdörtgen Petri kabına geri koyun ve baş aşağı kapalı bir plastik torbaya koyun. 30 °C'de 6 gün kuluçkaya yatırın.

4. Dereplication Plaka MHB Kaplama ve ARP/ MARP Kütüphane Plaka Hazırlama

1. 6 gün sonra, 30 °C inkübatörden derepyon plakasını çıkarın. Steril cımbız kullanarak (otoklavveya iyice püskürtülür 70% etanol), dikkatle Bennett's agar yüzeyinden nitroselüloz membran kaldırın.
   NOT: Bu adım, 4.2 adımını kolaylaştırarak, derepifasyon için temiz bir yüzey sağlamak için membran yüzeyinde yetişen hidrofobik sporları ve miseli ortadan kaldıracaktır.
2. Adım 3.4 için açıklandığı gibi, çalışma yüzeyinin düz olduğundan emin olun ve 23 mL'lik sıcak katyon ayarlı MHB agar aspire etmek için serolojik pipet kullanın. Dereplication plakasının yüzeyine 20 mL eşit olarak dağıtarak, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için ortamın geri kalanını pipette bırakarak bir kaplama oluşturun.
3. Orta tüm alanları kaplayana kadar plakayı yavaşça döndürün ve agar tamamen ayarlanana kadar onu rahatsız etmeyin. Soğuduktan ve katılaştırıldıktan sonra, çoğaltma plakasını kapalı plastik torbaya geri döndürün ve bir gecede 4 °C'de ters bir şekilde saklayın.
   NOT: Bu adım, fermente Bennett'in medyumundan ikincil metabolitlerin MHB agar kaplamasına difüzyonunu sağlar. Nitroselüloz membran düzgün hazırlanmış değilse plaka kenarlarında spor büyüme olacak, Hangi MHB agar püskürtmek hidrofobik özelliklere sahip. Bindirmeyi bu sporların üzerine dökmeyin, çünkü bindirmenin kirlenmesine neden olabilir.
4. Bindirmenin döküldüğü gün, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 100 μL katyon ayarlı MHB boru sulandırarak yeni bir ARP/MARP şablonuna inoküledin.
   NOT: Dereplik sırasında kontaminasyon yayılma olasılığını azaltmak için, yalnızca 2−3 dereplication plakasını çoğaltmak için tek bir ARP/MARP kitaplık plakası kullanın. Bu nedenle, dereplicated olacak suşların sayısına göre yeterli 96-iyi ARP / MARP plakaları aşılamak.
5. -80 °C'lik dondurucudan dondurulmuş stok ARP/MARP kütüphane plakasını çıkarın. Yoğuşma alt tarafında oluşmaya başlamadan önce alüminyum mührü çıkarın, bu nedenle kütüphane plakasında komşu kuyuları kirletme olasılığını azaltarak.
6. Steril 96 kuyulu sabitleme araçları (veya diğer aşılama ekipmanları) kullanarak, dondurulmuş stok ARP/MARP kütüphane plakasından dikkatlice sabitlenin ve 96 kuyulu yeni MHB içeren plakaları aşılayın. Dereplik sırasında kontaminasyonu en aza indirmek için, kütüphane plakası başına yalnızca 2−3 dereplik plakasını çoğaltmak için gereken sayıda ARP veya MARP kitaplık plakası kadar hazırlayın. Her plaka aşılama arasında sabitleme araçları sterilize.
7. Dondurulmuş şablona yeni bir steril alüminyum conta koyun ve -80 °C'lik dondurucuya geri döndürün. Aşılanmış 96 kuyulu plakaları kapalı bir plastik torbanın içine yerleştirin ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın ve 18 saat boyunca havalandırma (250 rpm) ile kuluçkaya yatırın.
   NOT: Yeni dondurulmuş stok kütüphane plakaları hiçbir kontaminasyon mevcut olduğundan emin olduktan sonra bu adımdan hazırlanabilir. Adım 2.5 açıklandığı gibi -80 °C'de depolamadan önce tabağa gliserol ekleyin.

5. ARP/MARP kullanarak çoğaltma

1. ARP/MARP şablonu kuvözden çıkarın ve hiçbir kirletici madde bulunmadığından emin olun. Her zaman taze hazırlanmış ve doğrudan dondurulmuş stoktan değil bir şablon kullanarak çoğaltmak.
2. Dereplication plakaları 4 °C'den çıkarın ve oda sıcaklığına dengede izin verin. Yoğuşma varsa, kapakları açın ve steril bir ortamda kurumasını bekleyin.
3. Steril sabitleme araçları (veya diğer aşılama ekipmanları) kullanarak, ARP/MARP kütüphane plakasından çoğaltma plakalarının MHB agar kaplamasının yüzeyine sabitle. Agar'ı delmemeye dikkat et. Her ayrıştırıcıplaka nın aşılanması arasında sabitleme araçlarını sterilize edin.
4. Şablonu çoğaltma plakalarının yüzeyine yapıştırdıktan sonra, şablon inoculumun 3−5 dk kurumasını bekleyin. aşılanmış ayrıştırıcıplakaları kapalı plastik bir torbaya ters yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
5. Dereplication sonuçları ertesi gün, çoğaltma plakası üzerindeki büyümeyi ARP/MARP haritasına karşılık gelen kuyularla karşılaştırarak analiz edin(Tablo 3 ve Tablo 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Aşağıdaki sonuçlar, antibiyotik üreten bir ilgi suşlarının arp ve/veya MARP kullanılarak çoğaltılması yla elde edilebildi.

ARP/MARP dereplik iş akışının diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir ve kütüphane plaka haritaları Ek Şekil 1 ve Ek Şekil 2'degösterilmiştir. Şekil 2, çevresel ekstre WAC 8921'in kloramfenikol üreticisi olarak tanımlandığı pozitif bir dereplik sonuc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yukarıda açıklanan protokol, hem yeni antimikrobiyal bileşiklerin keşfine hem de aktivitelerini kurtarmak için mevcut antibiyotiklerle birlikte kullanılabilecek adjuvants'a uygulanabilir. Platform direnç mekanizmaları ve onların cognate antibiyotikyüksek substrat özgüllüğü yararlanır, ham doğal ürün özleri içinde bileşikleri dereplicate için. Dereplication plakaları için gerekli süre uzun olmasına rağmen (~2 hafta), derepyon işleminin kendisi tek bir gecelik kuluçka döneminden sonra tamaml...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2